健骨二仙提取物对大鼠体外培养成骨细胞作用的研究.pdf

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1、6 6 6 实用预防医学2 0 0 7 年 6 月第 1 4 卷第 3 期P r a c t ic a l P r e v e n t i v e Me d io in e ， J u n . 2 0 0 7 ， V o l l 4 ， N o . 3 文章编号: 1 0 0 6 一 3 1 1 0 ( 2 0 0 7 ) 0 3 一 0 6 6 6 一 0 3 【 论著 】 健骨二仙提取物对大鼠体外培养成骨细胞作用的研究 文宁 ， 金玲“ ， 李全， ， 胡一江 ， 江兴林2 摘要: 目的探讨健骨二仙提取物对大鼠体外培养成骨细胞的作用效果及对成骨细胞增殖的作用机理。方法 采用新生大鼠颅骨进行

2、成骨细胞分离， 并在含 10%的胎牛血清D M E M中进行体外培养， 分别加人高、 低剂量的健骨二仙 提取物并与高、 低剂量 Pre m ar m组、 阴性组、 T a m oxi fe n 对照组、 T a m oxi fe n 阻断对照组进行对照. 用 MT T法进行成骨细胞 增殖和活性检测。结果在培养 24 h 后， 健骨二仙提取物对培养成骨细胞增殖有明显的促进作用， 培养到 48 h促进作 用更为明显， 表现出一定的时间相关性， 且其作用不能被 T a m oxi fe n 阻断或完全阻断。结论健骨二仙提取物可促进成 骨细胞增殖， 且其对骨代谢的影响不通过或者主要不是通过雌激素样作用

3、生效。 关键词: 健骨二仙提取物; 成骨细胞; 体外培养; 大鼠 中图分类号: R一332文献标识码 : A E ffec t s o f j i a n 一 G u 一E r 一 x i a nE x t r a c t o nR a t s o s t e o b l as t s i nV i t r owE NN i n g ， J IN 工 i n g ， 工 IQ u a n ， e t a l ， ( H u n a n Uni v ersi tyof l r Q d i t i o n a l Chi n es e 八 J e d i c i n e ，Cha n gsh a4

4、 1 0 0 0 7 ， H “ n a n ) A bst rac t : o bje c t i v e T os t u d yt h ee 能c t a n dm e c h a n i s mo 了 J i a n 一G u 一E r 一X j a n( J G E x ) e x t : a c 飞 o nr a t s 0 5 士 e o b l a s t s i nv i t r o .Me t h o d sT h eo s t e o b l a s t sw e r es e P a r a t e df r o m t h es k u l Iso f n e wb

5、o r nr a t sa n dc u lt u r e din1 O % b o v i n es e r u m D M E M. L O Wa n dh i g hd o s e s o f J G E Xe x t r a c t w e r es e P a r a t e l y a dde dlo wa n dh i g h d O s e s o f P r e m a r i n g r o u P ， t a m o x if e n c o n t r o l g r o u P ， a n dt a m oxi f e nb ! o c k e dg r o u P

6、A t t h ee n do f 飞 h de x P e r ime n t ， o s t e o b la s t P r o i f e r a t io na n da c t iv i t yw e r et e s t e da n dc o m- P a r e db yu s i n gM T Tm e t h o dR esu l tsT i m e一rej a t e dP h a r ma c o Jo g i ce ff e c t o f J G E Xe x t r a c t w a sP r o v e dt h a t e x t r a c t o f

7、J G E XP r o m o t e dt h em u lt iP li c a t i o na f t e r o s t e o b Ia s t b e i n gc u It e r e df o r 2 4h o u r s w h i let h ee f f e c t w a s e v e n s t r e n g t h e n e da f t e r 4 8 h o u r s .C onc l u s i o nJ G E Xe x t r a c t c a nP r e v e n t a n dc u r eo s t e o P o r o s i

8、s b yP r o v i n gm u lt i P l ic a t i o no f o s t e o b Ia s t s K e yw o r d s : J i a n 一G u 一E r 一X i a ne x t r a c t ; o s t e o b l a s t ; C u l t u r ei nv i t r o ; R a t 随着人口的老龄化， 骨质疏松症的防治越来越受到人们的 重视。在诸多药物治疗中， 雌激素替代疗法是防治骨质疏松最 公认有效的方法 。但雌激素类药物容易引起生殖系统肿瘤 而限制了其在骨质疏松防治中的应用。为了探索骨质疏松防 治效果满意而副

9、反应少的药物， 我们对 自主开发的中药制剂健 骨二仙丸进行了临床和实验的系列研究川， 将其制成健骨二仙 提取液研究了其对体外培养大鼠成骨细胞的作用。 1. 1 材料与方法 实验材料 1 . 1 ， 1实验动物一日龄 S D大鼠6只( 广州中医药大学实 验动物中心提供， 实验动物合格证号: 98A O 1 6 ) ， 用于分离原代 成骨细胞。 1 ， 1 . 2 实验药品P r e m a r l n 注射液2 5 m 刁 支( wy e t h 一L e d - 作者单位: 1湖南中医药大学灯 湖南长沙4 功0 0 7); 2怀化医学高 等专科学校; 3广东省深圳市中医院骨科 作者简介: 文宁

10、( 1 9 6 0 一) ， 女， 本科学历， 讲师， 主要从事中医药教学管理 及细胞生物学研究工作。 er le中国有限公司， 批号: 5 52DIN) 。健骨二仙提取物( 广州中 医药大学制剂提供) 。T an1 oxifen(拘椽酸他莫昔芬片， 苏卫药准 字( 1 9 94) 第 3 9 3 4 01 号， 扬子江制药股份有限公司， 批号 0 0 1 0 1 9 ) 。 11 . 3 分离及培养细胞试剂D ME M( G IBC ( ) ) 、 L一谷氨酞胺 ( 华美生物工程公司) 、 H E P E S(SIG M A ) 、 小牛血清( 中国科学院 上海细胞所) 、 胰蛋白酶( S

11、I G MA ) 、 1 1 型胶原酶( S I G M A ) 、 青霉 素、 链霉素、 E D T A( 上海试剂一厂 A R级) ; MT T比色法是试 剂: MT T ( S I G MA ) 、 D MS O ( S e r v a ) 、 戊巴比妥。 11 . 4 细胞分离培养、 鉴定和M T 丁检测主要溶液培养液: M199 培养基干粉 949 ( G 珊C O产品) ， 用 9 00 ml 去离子水溶 解， 加青霉素( 上海第二制药厂产品) 1 00 可m l ， 链霉素( 上海第 四制药厂产品) 1 00 u/m l ， 碳酸氢钠( 广州化学试剂公司产品， A R级) 调p

12、H值7 2 ， 4 平衡. 过滤除菌， 冰冻保存。用时加小 牛血清， 调浓度至 10%。 0 ， 1 %茜素红染色液: 茜素红( 温州化学实验试剂厂) 1 00 m g ， 用 p H S . 3 的T ri S 一 H CI水溶液 I O O m L 溶解. 4 保存。 D 一H a n 协液( g/ L ) : N a C 1 8 . 0 ， K C 1 0 . 4 ， N 处H P q H 2 0 0 . D 6 ， K H : P q DO 6 ， N a H C 0 3 O . 3 5 ， 酚红 0 . 0 2 ， p H= 7 一 4 。 实用预防医学2 0 0 7 年6 月第 1

13、 4 卷第 3 期P ra c t ， c a l P r e v e n t iv e Me d ic i n e ， J u n . 2 0 0 7 ， V o l l 4 ， N o 3 6 6 7 M T T贮存液: M T T溶于P B s ， 浓度为5 以 L ， 过滤除菌， 置 棕色瓶中， 4贮存。 四环素标记液: T et ra cy clin e H CI( SIG M A ) 四环素溶于培养 液中， 使其终浓度为50拜 留 ml。 1 . 2实验方法 1 . 2 . 1 新生大鼠颅骨成骨细胞分离与培养 1 . 2 . 1 . 1新生大鼠颅骨成骨细胞分离新生 1日龄 S D大

14、 鼠， 7 5 %酒精浸泡 巧 m in ， 揭去头皮. 取出头盖骨， 剔除干净附 着的结缔组织， P B S冲洗 3次， 用 0 . 25%胰蛋 白酶预消化 25 m i n 。细胞经 P B S洗后， 加人含 1 0 %的 音养， 第 Zd 换培养液， 以后每 2 一3d换 1 . 2 . 1 . 2 大鼠成骨细胞的传代成骨细胞接种于培养瓶中， 于3 7 5 %C O : 中静置培养， 约每Zd 换 1 次， 弃去原培养液， 每瓶中加人新鲜的含 10%的胎牛血清D ME M进行培养， 约4 一 7 d ， 细胞长成致密单层. 铺满培养瓶底， 进行传代. 弃去原培养 液， 用D一h a n

15、k 5 液冲.洗 2遍， 每瓶加人0 . 25%的胰蛋白酶消 化， 相差显微镜下观察细胞， 约 4min 细胞成圆形， 弃去消化液， 加人培养液， 吹打培养瓶底， 使细胞脱落， 计数， 制成细胞悬液， 接种于新的培养瓶中， 置于37 5 %C O : 中静置培养。 1 . 2 . 2成骨细胞的鉴定 1 . 2 . 21 形态学观察观察成骨细胞在最初分离和培养单层 时的情况， 并长期观察细胞的分泌情况。 1 . 2 . 2 . 2 四环素标记接种于培养瓶中的细胞， 每 Zd 换液， 观察细胞分泌情况和骨小结节的形成。接种 2周后， 在培养皿 中 加人四 环素， 其浓度为50卜 留 耐， 培养l

16、h 后， 在L EIcA 镜下 做落射荧光观察。 1 . 22 3 矿化结节茜素红染色的观察细胞按 5 万个/ 孔接 种于2 5 孔板内， 接种第 Z d 更换含药物血清的培养液， 以后每2 d 换液一次， 连续观察 14 d ， 形成大量的矿化结节。吸去培养 液. P B S冲洗， 9 5 %酒精固定 切 m in， 弃酒精， P B S冲洗 2次， 加 人 0 . 1 茜素红染色液 3 0而n 后在光镜下观察， 并计数， 核红染， 边界清晰， 短径大于100 拼 m的标准， 40倍光镜下对整个孔计 数。 1 . 2 . 3成骨细胞的药物处理取培养瓶中传代 72 h的成骨 细胞， 弃去原培养

17、液， 分别用 0 . 25%的胰酶消化， 待细胞分散 后， 移去消化液， 成骨细胞中加人含 10%胎牛血清的M1 99 培 养液， 反复吹打， 使细胞悬浮于培养液中， 并调整细胞浓度为 5 义 1 0 4 / m l ， 按 l x 1 0 5 / 瓶加人细胞培养瓶， 细胞培养 2 4h 后， 分 别按下列方式加人各组药物: ( 1) 阴性对照组: 不加药物。( 2) H er b 高剂量组: 加人终浓度相当于原药材sm 留 耐 的健骨二仙 提取液。( 3) H er b 低剂量组: 加人终浓度相当于原药材 l m g / ml 的健骨二仙提取液。( 4) Pre m ar in高剂量组: 加

18、人终浓度为 1 义 1 0 一 6 m o l L 的P r e m a r in 溶液。( 5 ) P r e m a r i n 低剂量组: 加入 终浓度为l x 1 0 一 7 m o l/ L的P r e m a r i n 溶液。( 6 ) T a m o x i fe n 高剂 量组: 加人终浓度为 2 . 5 又1 0 一 6 m o l/ L的 P r e m a r i n溶液。( 7 ) T a m o x i f e n 低剂量组: 加人终浓度为 1 又1 0 一 m o 叮 L的P r e m a r i n 溶液。( 8 ) T a m o x i f e n +P

19、r e m a r i n组( 工) : 先加人终浓度为 2 ， 5 x i o 一 “ m o l/ L 的T a m oxif e n 溶液 l h ， 再加人终浓度为I K 1 0 一 5 m o l/ L的 P r e ma r i n 溶液。( 9 ) T a mo x i f e n +P r e m a r i n组( 11) : 先 加人终浓度为2 . s x l o 一 “ m o 叮 L的T a n l (。 x i f e n 溶液 l h . 再加人 终浓度为 i x1 0 一 7 rn o l / L的 P r e m a r i n 溶液。( I D ) T a m

20、 o x i f e n + H e r b 组( 1 ) : 先加人终浓度为2 . s xl o 一 “ m o 厅 L的T a m o x i f e n 溶 液 l h ， 再加人终浓度相当于原药材s m g / ml 的健骨二仙丸提取 液。( 1 1 )T a m o x i f e n+H e r b组( 11) : 先加人终浓度为 2 . S X 10一 6 m 叫L的T a m o xi fe n 溶液 l h ， 再加人终浓度相当于原药材 l m 留m l 的健骨二仙丸提取液。 然后将培养瓶放置37 ， 饱和 湿度， 5 %C q 的培养箱中， 分别培养24， 48 h 。 1

21、 . 2 . 4 MT T法成骨细胞增殖和活性检测( 1) 以每孔 5 火 103 将成骨细胞接种于24 孔培养板， 培养24 h 后， 按 2 . 3 注明 的药物浓度处理细胞， 分别在培养( 37 ， 饱和湿度， 5 %C q) 24、 48 h 后P B S 冲洗， 更换无血清的相应培养液。同时， 每培养 孔加入s m g/ m l M T T Z o 俘 1 ， 培养箱中孵化2 4 h 。( 2 ) 终止培养， 小心吸弃孔内培养上清液， 每孔加人 150越D M so ， 振荡 10 min， 使结晶物充分溶解。( 3) 比色: 与试验平行设不加细胞只 加培养液的空白对照孔， 其他试验

22、步骤保持一样， 比色时， 以空 白孔调零。选择4 90 n m波长. 在酶连免疫检测仪上测定各孔 光吸收值， 记录结果， 以时间为横轴， 光吸收值为纵轴绘制细胞 增殖曲线。 2结果 2 . 1 成骨细胞的鉴定细胞形态观察: 最初分离的鼠成骨细 胞应该呈立方形 ， 48 h 后可见大量细胞贴壁， 培养 14 d 后， 原代 细胞长成单层。传代细胞 10 d内长成单层， 细胞由于 工型胶原 的分泌， 并排出胞外， 集结成结节状， 在高倍镜下可见培养液中 有大量黑色颗粒出现。四环素荧光标记观察: 细胞有黑色结节 形成， 荧光下可见呈同心排列的黄色结节。 茜素红染色可见呈 红色的圆形骨结节产生。 22

23、MT T法检测成骨细胞增殖和活性结果 表 1 不同药物、 药物浓度和作用时间对成骨细胞增殖作用的影响 同 组 不同 时间 比 较的P 值 对照组 H e rb低 剂量 组 He比高 剂量 组 P 二胡 n 低 剂 量 组 P re m 顽 n 高 剂量 组 601 1 4 士 00 2 001 6 3 士 0 . 0 1 80 _ D S 注: 以上各组间相比较， 无显著性差异。 2 . 2 ， ZT a mo x i f e n对健骨二仙提取物和 P r e m a r i n的成骨细胞 增殖作用的影响H erb 低剂量组和 H erb 高剂量组在 T a m o x - ifen 加入与否

24、的情况下， 对细胞的增殖和活性均无显著影响， 特 别在作用4 8h 后， H e rb高、 低剂量组均能在有 T a m o x if en 的环 境基本保持原有的效果不变。而在作用 24 h 后， 虽然 T a m ox- ifen 的加人对原 H er b 低、 高剂量组的活性均无明显改变， 但 H er b 高剂量组原表现出的促进作用在 T a m oxif e n的加人后减 退。见表 3 。 表 3 T a m o xi fe n 对健骨二仙丸的成骨细胞增殖作用的影响 组别 对 照组 H e rb低剂量组 H erb 高剂量组 T a mo x i f e n +h e r b 低剂量

25、组 Tao o x i 纪 n +h e r b高剂量组 0. 1 1 4士0. 02 00 . 1 6 3士0. 0 1 8 0 1 31士0. 01 9fl 22 o士0 0 1 4 6士0. 0 23夭0. 2 8 9土0 01 7 03 4 0. 1 2 0士0. 0 1 5 0 . 2 0 5士0 _ 0 1 9关 关 0 1 3 2士D_ 0 2 20 . 2 7 9士D. D 2 9升 关 P r e m a r i n 高、 低剂量组与相应的有 T a n i o x i f e n加人的 P r e - m arin 高、 低剂量组相比较， 两种浓度下对细胞的增殖和活性的 促

26、进作用均明显下降( P 001 或 P00 5 ) 。见表 4 。 表4T amo x i f e n 对 P r e m a r in 成骨细胞增殖作用的影响 组别n2 4 h4 8 h 对照组 P re or in 低剂量组 P r erna r in 高剂量组 Tamox ife n 十 P : e rn a ri n 低剂量组 Tamox if e n 千 P 二 。巧 n 高剂量组 0 1 1 4士0 0 2 00 . 1 6 3士0 . 0 1 8 0 . 1 5 7 士 0 . 0 1 8 荟书02 3 5 士 0 . 0 2 5沂圣 0 . 1 6 8 士00 2 7 关关02

27、 6 2士00 3 1 圣 苍 60 1 0 9士0 . 0 1 4 0 1 1 7 士0 . 0 1 9铃份 血么 01 3 7 士 0 . 0 2 6 口01 丰 8 士 00 3 7 3 讨论 基于成骨细胞和破骨细胞在骨质疏松症中所起到的关键 作用， 在骨质疏松症的研究中， 通常用体外培养的破骨细胞和 成骨细胞进行关于骨吸收与骨形成的研究川。本研究探讨了 健骨二仙提取物对成骨细胞作用途径中的一些基本问题， 并与 雌激素类药物 P r e ma r i n 对比。 实验结果表明， 健骨二仙提取物对体外培养成骨细胞都有 促进细胞增殖和活性的作用。表现出一定的时间相关性和剂 量相关性， 且随着

28、作用时间的延长， 其疗效接近或超过 P re m ar- in。结果提示. 健骨二仙提取物具有和 Pre m ar in相当的促进培 养成骨细胞增殖和活性的作用， 并有一定的量 一 效关系. 但从 时一效关系上看， 两者之间似乎存在着不同的作用机制。 当T a m o xi f e n 单独与成骨细胞培养时， 在不同的浓度、 不同 时间都没有观察到它对培养成骨细胞的增殖和活性有明显的 影响， 这可能是因为T a m o x i f en和其雌激素受体结合后， 不产生 雌激素样作用， 雌激素作用一般促进培养成骨细胞的增殖与活 性4， 而其本身在此浓度下也无对细胞的增殖和活性的不利影 响， 所以观

29、察不到培养成骨细胞的明显改变， 只有当细胞外环 境中存在一定浓度的雌激素类物质， T a m oxi fe n才表现出对这 一过程的阻滞作用。 通过实验， 发现 H er b 低剂量组和H er b 高剂量组在T a m ox- ifen 加人与否的情况下， 对细胞的增殖和活性均无明显影响， 特 别在作用 4 8h 后， H erb高、 低剂量组均能在有 T a m o xi fe n的环 境中保持原有的效果不变。而分析作用 24 h后的结果， 虽然 T a m oxifen的加人对原 H er b 低、 高剂量组的活性均无明显改 变， 但 H erb 高剂量组原表现出的促进作用在 T a m

30、 oxi fe n的加入 后减退， 这可能与中药组的药效在 24 h 作用不及48 h作用后 明显有关 。 而关于 Pre m arin的雌激素受体阻断实验得到的却是相反 的结果。实验发现， Pre m arin高、 低剂量组与相应的有 T a m o x - i f e n 加人的P r e m a r i n 高、 低剂量组相比较， 两种浓度下对细胞的 增殖和活性的促进作用均明显下降( P 0 . 01 或 P 0 . 0 5 ) ， 降到了和对照组相当甚至是低于对照组的水平。 结果提示: 健骨二仙提取物对培养成骨细胞增殖和活性的 促进作用， 且不能够被雌激素受体阻断剂 T a m oxi

31、f en所阻断或 完全阻断， 而 P r e m a r i n的作用却能够被 T a m o x i f e n所 阻断。 Pre m arin是一种天然结合型雌激素， 含雌酮硫酸钠和孕烯雌酮 硫酸， 其作用能被 T a m oxifen 所阻断， 说明本实验用以验证健骨 二仙提取物是否通过雌激素途径生效的实验设计是成功的。因 此， 可以推断， 健骨二仙丸对骨代谢的影响不是通过或者主要不 是通过雌激素样作用生效的， 其作用机理还有待进一步研究。 参考文献 1 R i k s e n E F ， K a s s e m， L a n d a u l B . E u ro p e a na n

32、dN o r t h A m e r ic a n e x - p e r ie n c e w it h H R Tfo r t h e p r e v e n t io n o f o s t e o p o r ，)s15 【 J . 氏n e ， 1 9 9 6 ， 1 9( 5 5 ) : 1 7 9 5 一1 8 3 2 萧劲夫， 朱海， 李昂， 等. 益气补肾法防治原发性骨质疏松症【 Jl. 中 国中医骨伤科杂志， 2 0 0 2 ， 1 0 ( 2 ) : 1 一 8 . 3 E u n MI C h o i ， K w a n gs i k ， Y o u n gs e o

33、l K im， e t a l . Soy b e a ne t h a n o l ext rac t主 n c r e a s e st h ef u n c t io no f P h y t och e 现 i s t r y ， 2 0 0 1 ， 5 6 : 7 3 3 4 E u nMI C h o i ， K w a n g S ;k s u h ， o s t e o b la s t icMC 3 T 3一E lc e lls J 一 7 3 9. Y o u n g s eol K i m， e t al. 乳y b e a ne t h a - n o 1 e x t r a c t i n c r e a s e S t h ef u n c t i o no f o s t eob l a s t i c MC 3 1 3 一E l c e ll s J P h y 、 o c h e m is t r y ， 2 0 0 1 ， 5 6 : 7 3 3 一 7 3 9 . ( 收稿日期: 2 0 0 7 一 0 1 一1 9 )