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1、!“# 年 $ 月 第 %# 卷第 $ 期 中国比较医学杂志 ， !“# ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! “ “ “ “ # # # # 6%#) 沈阳农业大学畜牧兽医学院， 沈阳%“%?%） 【摘要】 目的将兔出血症病毒 （/76） 64?“ 全长基因在昆虫细胞C杆状病毒系统中表达， 验证重组蛋白形成 病毒样颗粒 （614:） 的能力及其生物学特性， 探讨 614
2、: 作为检测抗原及亚单位疫苗的潜力。方法用 DEFC; ?5“14 =504072“41021*. 1(. 8ELCIEJ%， 1(. ,LEC:HJ%， . SLJ9CT +VHJUEJ9 09ILF8=;8IH .JLYHI:L;U， +VHJUEJ9 %“%?%） 【%(LJE;L /“: L8J (8J (J VHE99=8;LJE;L +OP FH=: =U:E;H F 5VH :HJ:L;LYL;U +OP FH=: =U:E;H F 5VH IEKKL;: :8IYLYHT FVE=HJ9H _L;V =H;VE= T)/49)*“=)*# )*4(#“? +# 6-78， “4
3、 6-78 !“4 *+ D/+D“%“()+* 4B4(#$ )* )(/+ 4+ #=(+/ “*? 6-78 /#=#D(+/ )* )/4（6-78） ；8;H3 %#*#；.*4#=( =#4 基金项目 中央级科研院所科技基础性工作专项计划 （I+5J3307KLJ33MM） 。黑龙江省博士后资金项目 （:6L3M9NMO） 。 作者简介 刘怀然 （0AP2 Q ） ， 女， 助理研究员， 博士， 主要从事分子病毒学和实验动物质量监测工作。K9$“)03， 含量 较低， 功能尚不明确 M。MW末端的长 E6V 编码一个 JN22 氨基酸的多聚蛋白前体， 该前体被病毒蛋白酶 进一步分解
4、为衣壳蛋白 （8;H3） 和非结构蛋白。除 基因组 6IU 外， 在病毒颗粒和感染的组织中， 还含 有 JX2 Y, 的亚基因组 6IU， 也编码衣壳蛋白 8;H3。 8;H3 为 6-78 唯一的结构蛋白， 与诱导抗病毒感染 的免疫反应直接相关， 在新型诊断制剂、 疫苗的研制 中具有十分重要的应用价值 H。由于目前尚未找到 适合 6-78 体外繁殖的系统， 所以 6-7 的诊断和预 防制剂一直利用的是来自攻毒致死兔的脏器组织， 其所涉及的成本、 生物安全和动物福利等问题日趋 突出。利用分子生物学手段获得重组抗原， 建立血 清学检测方法及进行疫苗研究， 对于 6-7 这个一直 缺乏体外繁殖系统
5、的疾病来说意义重大。 与其他杯状病毒相似 P， 6-78 结构基因在真 核系统中表达的蛋白可自发组装成类病毒样颗粒 （)/494） ， 其在结构、 免疫原性上与 自然病毒粒子十分相似 O Q 03， 成为检测试剂和预防 性疫苗研制中具有吸引力的候选者。此方面国外研 究较多， 国内在 J33M 年开始有相关报道 00 Q 0J。 /材料和方法 /0/材料 0X0X0种 毒、 质 粒、 载 体 及 感 受 态 细 胞： 种 毒： 6-789C; 株种毒经非免疫兔传 2 代复壮， 血凝价为 J02， 对非免疫兔致死量为 3XM $:； 含 6-7898;H3 全 长基 因 质 粒（C8;H3） 0N
6、、 DV“4(L“=-C“ 载 体 质 粒、 7-03L“= 感受态细胞由本室保存。 0X0XJ细 胞 培 养 及 转 染 用 材 料：:)D+、 洗涤、 吹干， 加入 0 : 0, 稀释 （,?,0 A ,?,1 伊文 思兰 *“- 稀释液） 的羊抗兔荧光抗体 0,!B， ;， 洗涤、 封片， 荧光显微镜下观察。 0?1?7重组蛋白最佳表达条件确定： 将重组病毒分 别以 CD4 （%EF 离心 0, % 个梯度， 与等量 895 阳性血清混合均匀， 7= 孵育过夜， 次日 01 , !Q%, %/ 份阴性血清， 用进口试剂 盒进行平行验证； 同时检测 /1 份兔血清盲样， 比较 检出率。 免
7、疫动物： 含 895)()B*R 的细胞裂解液测定总 蛋白含量， 以 6,!SQ只、 0 ,!SQ只加氟氏佐剂乳 化， 背部皮下多点注射各免疫 1 只非免疫兔， 每隔 06 A 1, 免疫 0 次， 共免疫 ; 次， 每次免疫前耳动脉 采血分离血清， 分别以间接 PB4-N 及 94 试验检测抗 体水平， 同时设 1 只非免疫兔作为对照。; 免后 0 个月攻毒， 剂量为 0?6 %BQ只 （; 倍致死剂量） 。 !结果 !“#$%： 重组质粒 *38 鉴定（约 0UK 0(;： *38 VW） ； 1， ;： C0; Z 引 物 鉴 定 重 组 “#$% Q)*+, 下 游 引 物 鉴 定 重
8、 组 “#$% VW） ； B#K 1， ;： *38 Z（#WJEF 7U1 W） ； B#K 7， 6： *38 # )*+, #F （ Z ） 引物、 C0; （ ） Q)*+, 下游引物 *38 扩增， 分别扩增出约 7?1 W、 7?, W 左 ,67中国比较医学杂志 1, 3J%G CK， NESERF 1, 左右， 与预期大小相符。重 组病毒 :;-/*DEF 分析 （D） 及 GHIJH!K LMNJJ) 病毒样颗粒 （D， “） 及纯化的 TU)（V） 0123 4FMH$J!NK %” 、“” 型红血球可发生凝 集反应， 凝集效价达 ?1/， 而对照 -./ 细胞裂解液则
9、无凝集性， 此凝集反应可被 TU 阳性血清所抑制。 1Y3中国比较医学杂志 ?,A 年 5 月第 1A 卷第 5 期VB /： 0! ;77:6AC8?8 6- $% :6CF9= ,-. ?8= +A8C:979:7 C89?7A8C:979:7 6- CM9?*#N A8C:979:7 6- ?6:7C6= ,-. ?8=+ 稀释度 *, !“#$%$:-26 ? 免后 )8+26 +2 8,6(+ ,:;*,2 (27.*/ ,:;*,2 +,6/ ,:;*, T， 2+ 41G O1,*,741 4*/ 54+.1.9,741 824+;62( .8 3,641 42:.6649,7
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