低氧对人外周血单个核细胞迁移活性的影响及其临床意义.pdf

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1、山东医药2 0 0 6 年第 4 6 卷第 2 7 期 低氧对人外周血单个核细胞迁移活性的 影响及其临床意义 宋海波 . 2 ， 曲迅“ ， 杨美香“ ， 杨咏梅“ ， 邵倩倩“ ( 1山东省医学科学院基础医学研究所， 山东济南2 5 0 0 6 2 ; 2山东大学齐鲁医院) 摘要 目的探讨低氧对机体外周血单个核细胞( P B MC ) 迁移的影响及其临床意义。方法分离外周血 单个核细胞， 采用T r a n s w e l l 小室实验检测常氧和低氧条件下P B MC迁移能力的变化， 流式细胞术( F C M) 检测 常氧和低氧条件下T , B淋巴细胞， N K细胞及单核细胞迁移的变化。结果

2、低氧环境下P B MC的迁移率降低 3 1 %。对其细胞亚群的分析结果显示， N K细胞的迁移率降低 3 1 . 7 % o ， 单核细胞的迁移率降低 6 3 . 1 写, T , B淋巴 细胞的迁移率无显著变化。结论低氧能显著影响单核细胞及N K细胞的迁移功能; 检测低氧条件下P B MC的 迁移能力， 可为以免疫细胞迁移功能为靶点的炎症等疾病提供新的治疗对策。 关键词 低氧; 外周血单个核细胞; 迁移; N K细胞 中图分类号 R 3 9 2 文献标识码 A 文章编号 1 0 0 2 - 2 6 6 X ( 2 0 0 6 ) 2 7 - 0 0 1 3 - 0 3 E f f e c t

3、 o f h y p o x i a o n mi g r a t i o n c a p a c i t y o f h u m a n p e r ip h e r a l b l o o d m o n o n u c le a r c e l l s a n d i t s s i g n i f ic a n c e S O N G Ha i - b o , Q U X u n , Y A N G Me i - x i a n g , Y A N G Y o n g - m e i , S HA O Q i a n - g i a n ( 1 I n s t i t u t e o

4、f B a s i c Me d i c a l S c i e n c e s , S h a n d o n g A c a d e m y o f Me d i c a l S c i e n c e s , J i n a n 2 5 0 0 6 2 , P . R . C h i n a ) A b s t r a c t ; O b j e c t iv e T o s t u d y t h e a f f e c t o f h y p o x ia o n m ig r a t io n c a p a c i t y o f h u m a n p e r i p h e

5、r a l b l o o d m o n o n u c l e a r c e l l s ( P B MC ) a n d i t s b i o l o g i c a l s i g n i f i c a n c e . Me t h o d s P B MC w e r e i s o l a t e d a n d i t s m i g r a t i o n c a p a b i l i t y w e r e d e t e c t e d b y T r a n s w e l l s y s t e m o n n o r m o x i c a n d h y p

6、 o x i c c o n d i t i o n . T h e n t h e m i g r a t i o n o f T a n d B l y m p h o c y t e , N K c e l l s a n d P B M C w e r e a n a l y z e d b y f l o w c y t o m e t r y . R e s u l t s T h e m i g r a t io n r a t e d e c r e a s e d 3 1 % i n h y p o x i a . T h e s u b t y p e s a n a l

7、y s i s s h o w e d t h a t t h e m i g r a t i o n r a t e o f N K c e l l d e c r e a s e d 3 1 . 7 写 , a n d m o n o n u c l e a r c e l l d e c r e a s e d 6 3 . 1 % . B u t h y p o x ia h a d n o a f f e c t io n b o t h o n T a n d B l y m p h o c y t e s . C o n c l u s i o n s T h e s e r e

8、s u l t s i n d i c a t e t h a t h y p o x i a c a n s i g n i f i c a n t l y a f f e c t t h e m i g r a t i o n o f m o n o c y t e s a n d N K c e l l s . S o m e d i s e a s e s h a v e t h e r a p y t a r g e t s u c h a s i m m u n e c e l l m i g r a t i o n , a n d i t m a y p r o v i d e

9、n e w t h e r a p y m e t h o d s f o r t h o s e d i s e a s e s b y c h e c k i n g P B MC m i g r a t i o n c a p a b i l i t y i n h y p o x i a c o n d i t i o n . K e y w o r d s : h y p o x i a ; p e r i p h e r a l b l o o d m o n o n u c l e a r c e l l s ; m i g r a t i o n ; n a t u r a l

10、 k i l l e r c e l l s 低氧状态普遍存在于人体生理与病理生理过程 中川。人体实体肿瘤、 炎症等许多疾病重要特征之一 是局部的低氧微环境。 外周血单个核细胞( P B MC ) 是 其病理生理过程的重要介导细胞。近年的研究证 实 2 .3 ， 免疫细胞可对许多疾病的发生、 发展与转归 起重要作用。 P B MC在功能的行使中， 通常需要迁移 至反应部位而产生相应的生理或病理生理效应( 保 护或损伤) 。因此， 迁移是免疫细胞功能发挥的基础， 而低氧微环境是其功能反应的特征微环境。现已证 实 4 . 5 1 ， 低氧可影响人P B MC细胞因子的产生及增殖 基金项目 国家自

11、然科学基金资助项目( 3 0 4 7 2 2 6 1 ) . ，通讯作者 活性。 然而低氧对P B MC迁移功能的影响知之甚少。 2 0 0 5 年 1 月一2 0 0 6 年 1 月， 我们观察了低氧对 P B MC及其亚群迁移能力的影响， 以便为基于免疫 细胞迁移特性为靶点的炎症等疾病的治疗提供新的 对策与思路。 1 材料与方法 1 . 1 主要试剂R P M1 1 6 4 0 ， 胎牛血清， 淋巴细胞分 离液， T r a n s w e l l 小室， 荧光标记的鼠抗人 C D 3 , C D 1 4 , C D 1 9 , C D 5 6 单克隆抗体及相应的同型对照， 小鼠 成纤维细

12、胞株( N I H - 3 T 3 ) . 1 . 2 方法 1 , 2 . 1 P B MC的分离取健康献血员外周静脉血 2 0 m l ， 肝素抗凝。采用F i c o l l 密度梯度离心法分离 1 3 山东医药 2 0 0 6 年第 4 6 卷第 2 7 期 n一110 208 月.人，人 P B MC , 8 0 0 r / m i n 离心5 m i n , P B S 液洗涤3 次， 调至 1 X 1 0 / m l 备用。 1 . 2 . 2 N I H - 3 T 3的培养和上清液的获取N I H - 3 T 3 用含 1 0 %胎牛血清的R P M1 1 6 4 0 培养液

13、培养， 在细胞长势良好时换无血清培养液继续培养 2 4 h , 收集培养上清液作为趋化试验的下室液备用。 l . 2 . 3 P B MC迁移能力的检测取6 0 0 p 1 N I H - 3 T 3细胞上清加人下室， 在上下室之间加直径 1 3 m m的聚碳酸酷微孔膜( 微孔直径为 5 t e m) ， 光面朝 上。取2 0 0 p .l P B M C ( 2 X 1 0 6 ) 加人上室中， 常氧 ( 2 1 0 0 0 2 , 5 0 o C 0 2 ) 环境下和低氧( 1 0 0 0 2 , 5 o o C O Z , 9 4 0 o N 2 ) 环境下孵育 8h ， 收集下室 P

14、B MC ， 采用细胞 计数法计数。常氧环境下 P B MC的迁移率作为 1 0 0 0 0 ， 计算低氧下P B MC的迁移抑制率。应用流式 细胞仪( F C M) 对单核细胞、 淋巴细胞的迁移能力进 行检测， 同时设阴性对照管、 同型对照管。计算迁移 至下室中的T, B淋巴细胞， N K细胞及单核细胞的 迁移率: ( 迁移后细胞占P B MC的百分率X迁移后 P B MC细胞数) /(迁移前细胞占P B MC的百分率X 迁移前P B MC细胞数) X 1 0 0 0 0 。以常氧下的迁移率 为1 0 0 0 0 ， 计算低氧下单核细胞与淋巴细胞的迁移抑 制率。 1 . 3 统计学方法应用

15、S P S S 1 0 . 0 统计软件、 O n e - S a m p l e t 检验进行两两分析。a =0 . 0 5 , 2 结果 2 . 1 低氧对P B MC迁移能力的影响 ， 与常氧环境 比较， 低氧环境下 P B MC迁移到下室的数目显著减 少， 迁移率下降了3 1 0 o ( P0 . 0 5 ) 。 详见 图 2 。 图2 低叙对单核细胞和淋巴细胞迁移能力的影响 3 讨论 低氧是许多生理与病理生理过程如人体胚胎的 发生和胎盘发育、 心血管疾病、 炎症、 肺部疾病( 如囊 性纤维化) 、 实体瘤和糖尿病等的局部环境特征。肿 瘤细胞的生长速度经常超过新生成的血管细胞的生 长速

16、度; 炎症时， 炎症区由于大量吞噬细胞的阻塞， 血液供应经常被阻断， 从而形成了 低氧区域川。 局部 环境氧含量对胎盘发育、 肿瘤进展与转移、 先天免疫与 适应性免疫起重要的调节作用。在这些具有特征性低 氧环境的疾病中， P B MC是重要的反应介导细胞1 2 . 3 7 P B MC在功能的行使中， 通常需要迁移至反应部位进 而产生相应的生理或病理生理效应( 保护或损伤) ， 如 病原人侵时， 免疫细胞移动并聚集到炎症部位， 产生免 疫效应以清除病原; 免疫细胞在机体组织中移动并 发挥免疫监视功能， 避免肿瘤的发生和发展。因此， 迁移是免疫细胞发挥功能的关键因素。近年来研究 已证实 4 .

17、5 1 ， 低氧影响人P B MC中I L - 2 , I L - 4 , I F N - 7 等细胞因子的产生及细胞的增殖活性， 为炎症性疾 病的治疗提供了新的思路。 然而， 低氧对 P B MC迁移功能的影响我们尚不 了解。 本研究中我们发现， 将P B MC置低氧( I Y O 0 2 ) 环境下 8 h其迁移率下降 3 1 0 o ， 提示低氧能显著影 响其迁移活性。 采用F C M对迁移至下室的P B MC中 单核细胞， T , B淋巴细胞及N K细胞进行检测， 结果 显示， 低氧环境对 T, B淋巴细胞的迁移活性无明显 影响; 对单核细胞及 N K细胞的迁移活性影响显著。 研究结果

18、提示低氧环境对不同的免疫细胞迁移活性 的影响力不同。而目前对淋巴细胞的其他功能研究 显示， 低氧影响T淋巴细胞产生细胞因子， 抑制T淋 巴细胞的活化， 特别是造成 C D 4 细胞的生存和增殖 能力的下降， 从而影响机体的适应性免疫应答。 低氧 对 B淋巴细胞的影响的研究显示， 低氧不影响其抗 体的产生， 可见低氧对机体的体液免疫无明显影响。 而低氧显著抑制N K细胞的激活和细胞毒效应1 6 1 。 因 此， 低氧可通过影响 N K细胞的激活和迁移功能抑 1 4 山东医药 2 0 0 6 年第 4 6 卷第 2 7 期 制机体的天然免疫。另外， 近年来研究发现 7 1 ， 在实 体肿瘤中有肿瘤

19、相关巨噬细胞( T A M) 的浸润， 造成 肿瘤的侵袭和转移增加。由于单核细胞可在细胞因 子的作用下转化为巨噬细胞， 而肿瘤区域的低氧环 境又抑制了单核细胞的迁移。我们推测， 低氧对 T A M 的形成和浸润有一定的影响。我们认为， 本研 究的发现对进行体外单核细胞及N K细胞迁移机制 研究的设计方法提出了值得思考的新问题， 也对基 于免疫细胞迁移特性为靶点的肿瘤和炎症等疾病的 研究策略提供新了的思路。 参考文献 1 R ic h a r d K, B r u i c k R K, S t e v e n L , e t a l . O x y g e n s e n s i n g g e

20、 t s a s e c o n d w i n d J . S c i e n c e , 2 0 0 2 , 2 9 5 ( 5 5 5 6 ) : 8 0 7 - 8 0 8 . 2 L i c h t A H, Mu l l e r - H o l t k a m p F , F l a m m e 1 , e t a l . I n h i b i t io n o f h y p o x i a - i n d u c i b l e f a c t o r a c t i v i t y i n e n d o t h e l i a l . c e l l s d i s r

21、u p t s e m b r y o n ic c a r d i o v a s c u l a r d e v e l o p m e n t J . B l o o d , 2 0 0 6 , 1 0 7 ( 2 ) : 5 8 4 - 5 9 0 . 3 C r a m e r T , Y a m a n is h i Y, C l a u s e n B E , e t a l . H I F - l a is e s s e n t ia l f o r m y e l o i d c e l l - m e d ia t e d i n f l a m m a t io n 仁

22、 J . C e l l , 2 0 0 3 , 1 1 2 ( 2 ) : 6 4 5 - 6 5 7 . 4 N a l d in i A , C a r r a r o F , S il v e s t r i S , e t a l . H y p o x ia a f f e c t s c y t o k i n e p r o d u c t i o n a n d p r o l i f e r a t i v e r e s p o n s e s b y h u m a n p e r i p h e r a l m o n o n u c l e a r c e l l

23、s J . J C e l l P h y s i o l , 1 9 9 7 , 1 7 3 ( 3 ) : 3 3 5 - 3 4 2 . 5 N a l d i n i A , C a r r a r o F . H y p o x i a m o d u l a t e s c y c l i n a n d c y t o k in e e x p r e s s i o n a n d i n h i b i t s p e r i p h e r a l m o n o n u c l e a r c e l l p r o l i f e r a t i o n 1 . C e

24、 l l P h y s io l , 1 9 9 9 , 1 8 1 ( 3 ) : 4 4 8 - 4 5 4 . 6 L o e f f l e r D A, J u n e a u P L , H e p p n e r G H . e t a l . N a t u r a l k i l l e r - c e l l a c t i v i t y u n d e r c o n d i t i o n s r e f l e c t i v e o f t u m o r m i c r o - e n v i r o n m e n t J . I n t J C a n c

25、 e r , 1 9 9 1 , 4 8 ( 6 ) : 8 9 5 - 8 9 9 . 7 L e w i s C , Mu r d o c h C . Ma c r o p h a g e r e s p o n s e s t o h y p o x ia : i m p l i - c a t i o n s f o r t u m o r p r o g r e s s i o n a n d a n t i - c a n c e r t h e r a p i e s J . A m J P a t h o l , 2 0 0 5 , 1 6 7 ( 3 ) : 6 2 7 -

26、6 3 5 .( 收稿日 期: 2 0 0 6 - 0 7 - 0 2 ) 经验交流 低体质量婴幼儿V S D不停跳心内直视术 2 2 例治疗体会 蒋锡初， 游庆军， 丁卫军 ( 苏州大学附属第四医院， 江苏无锡 2 1 4 0 6 2 ) 2 0 0 1 年1 月2 0 0 5 年1 月， 我们对2 2 例1 0 k g 以下婴幼 儿室间隔缺损( V S D ) 施行不停跳心内直视手术， 手术死亡率 为4 . 5 %。现报告如下。 资料与方法: 本组患儿年龄为6 - 3 6 个月; 体质量 5 . 5 - 1 0 . 0 k g 。术前反复呼吸道感染 1 2 例， 有心力 衰蝎史 5 例，

27、经 查体、 X线胸片、 E C G及超声心动图检查确诊。 心胸比为0 . 5 4 - 0 . 7 3 。 无肺动脉高压( 收缩压簇3 0 m m H g ) 4 例， 轻度肺动 脉高压( 3 1 - 6 0 m m H g ) 4 例， 中度( 6 1 1 .2 0 m m H g ) 1 1 例， 重 度( 1 2 0 m m H g ) 3 例。 膜周部V S D 1 7 例( 7 8 . 9 %) . 漏斗部 V S D 5 例( 2 1 . 1 %) . 2 2 例均采用胸骨正中切口， 术中维持体 温3 1 C -3 5 。 不阻断升主动脉根部， 体外循环时间为2 1 - 1 0 3

28、m i n 。采用右心房切口修补V S D者 1 5 例， 右心室切口修 补者7 例。 直接缝合修补V S D者1 3 例， 补片修补者9 例( 4 例 采用涤纶补片， 5 例采用戊二醛处理的自 体心包补片) 。在补 片修补V S D时， 均采用间断褥式缝合， 并同期矫治合并的心 内畸形。 结果: 全组均顺利完成手术， 术后住I C U 3 7 - 2 4 0 h ， 呼 吸机辅助 4 . 5 1 7 2 h ， 术后 2 4 h引流量 1 0 - 1 4 0 m l ， 住院 1 0 2 1 d 。术后再次开胸止血 1 例， 肺部感染 2 例( 气管切开 1 例) ， 心律失常2 例， 肺动

29、脉高压危象 1 例， 残余分流 1 例。1 例重度肺动脉高压患儿因术后反复出现肺动脉高压危象， 右 心衰蝎， 继而发生恶性心律失常死亡。余2 1 例随访 2 - 6 0 个 月， 术后肺动脉压持续 5 0 m m H g 者 3 例， 均为术前中度以 上肺动脉高压患儿。 除2 例听诊有 I 级杂音、 1 例超声心动图 示少量残余分流外， 无其他并发症及死亡。 讨论: 随着心外科整体技术水平的提高， 先天性心脏病手 术低龄化已成趋势。 低龄V S D手术可避免过迟手术因严重肺 血管病变所致的手术死亡率过高. 本组2 2 例低龄患儿体质量 均在1 0 k g 以下， 死亡1 例， 总体效果良 好。

30、 本组2 2 例均使用小儿膜式氧合器， 体外循环中增加应用 胶体或血液预充的比例， 防止血液过度稀释， 提高胶体渗透 压， 以防术后组织水肿， 维护术后重要生命器官的有效功能。 手术方法掌握不当很易发生气栓。 首先需掌握手术适应证， 膜 部或膜周部V S D缺损直径 0 . 8 c m者适于应用不停跳技 术。若术中见有心内畸形复杂， 估计手术时间长、 显露困难或 合并主动脉瓣关闭不全， 则应改行传统手术。 术中维持平均灌 注压5 0 - 6 0 m m H g ， 保持头低位， 主动脉根部置排气装置， 必 要时接负压， 修复时避免肺膨胀。本组无 1 例发生气栓。 术中由于过度牵拉， 心跳较快， 心内操作困难， 手术时间 长而使主动脉内供血不足， 从而影响冠状动脉灌注。为此， 我 们在术中将F o l e y 导尿管从右心房通过缺损插人左心腔， 充 水后暂时阻断缺损分流， 带垫褥式缝合修补缺损。 对较为复杂 的病例， 我们主张预先插好主动脉根部灌注管， 保持血温， 尽 可能地准确完成心内操作， 缩短手术时间。一旦出现停搏， 迅 速给予温血灌注， 使心脏复跳。 ( 收稿日 期: 2 0 0 6 - 0 7 - 1 2 ) 1 5