六价铬对L-02肝细胞线粒体功能的影响.pdf

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1、9 1 8实用预防医学 2 0 0 4 年t o 月 第1 1 卷 第5 期 P r a c t i c a l P r e v e n t iv e M e d i c i n e , O c t . 2 0 0 4 , V o l I I , N o . 5 文章编号: 1 0 0 6 一 3 1 1 0 ( 2 0 0 4 ) 0 5 一 0 9 1 8 一 0 4【 论著 】 六价铬对 L 一 0 2 肝细胞线粒体功能的影响 肖经纬， 钟才高， 张洪霞 摘要: 目的探讨六价铬( C r ( V I ) ) 对肝细胞线粒体与凋亡密切相关功能的影响。方法选取2 , 4 , 8 , 1 6

2、, 3 2 , 6 4 p m o 1/ L 6 个不同 浓 度的C r ( V I ) 溶液 处 理L - 0 2 人 胚 肝 细 胞6 h ， 采用M T T 法检 测细 胞 活力 和 线 粒体 酶抑 制 率; 荧 光 分光 光 度 法 检 测 线粒 体膜 通透 性 转 运 孔( P T P ) 的开放程度和 线粒 体膜电 位的( 恤) 的 变化。 结果 在2 . 6 4 I Cm o l/ L C r ( V I ) 处理浓度， C r ( V I ) 对L 一 0 2 肝细胞具有明显的细胞毒性， 其细胞存活率与C r ( V I ) 处理浓度呈负相关( 相关系数r =一 0 . 9 1

3、 0 ) 。随着C r ( V I ) 浓度的增加L 一 0 2 肝细胞线粒体总酶活性受到抑制; 线粒体P T I 孔开放程度增加; 线粒体膜电位 ( 伽) 降低， 且与对照组比 较均具有显著性差异( P 0 . 0 5 ) 。 结论 C r ( V I ) 可对L - 0 2 肝细胞线粒体与凋亡相关的功 能产生损伤效应。 关键词:六价铬; L 一 0 2 人胚肝细胞; 线粒体; 膜通透性转运孔; 膜电位; 线粒体酶 中图分类号: R- 3 3文献标识码: A Th e Ef f e c t 月o n g一x i a o f H e x a v a l e n t C h rom i u m

4、o n L一0 2 H e p a t o c y t e Mi t o c h o n d r i a X I A O J i n g一” T iC a i 一g a o ，Z H A N G D e p a r t m e n t o f H e a l t h T o x i c o l o g y ，X i a n g y a S c h o o l o f P u b l i c H e a l t h ，C e n t r a l S o u t h U n i v e r s i t y , C h a n g s h a 4 1 0 0 7 8 , C h i n a ) A

5、b s t r a c t : ( ) 场 e c t i v e T o e x p lo r e t h e e ff e c t o f h e x a v a le n t c h r o m iu m o n t h e f u n c t io n s o f L 一 0 2 h e p a t o c y t e s m it o c h o n d r ia w h ic h a r e in c lo s e r e la t io n s h i p w it h a p o p t o s is . M e t h o d s T h e e ff e c t s o f

6、 C r ( V I ) o n cel l s u r v iv a l r a t e w e r e a s s e s s e d o n t h e r e d u c t io n s o f t e t r a z o l iu m d y e ( M T T ) in c u lt u r e d h e p a t o c y t e s . L 一 0 2 h e p a t o c y t e s in a ll t e s t s w e r e in c u b a t e d w it h 2 , 4 , 8 , 1 6 , 3 2 , 6 4 u m o l/ L

7、 c o n cen t r a t io n s o f C r ( V I ) f o r 6 h a c c o r d in g t o s u r v iv a l r a t e . T h e p e r m e a b i lit y t r a n s it io n p o r e ( P T P ) o f m it o c h o n d r ia , m it o c h o n d r ia l m e m b r a n e p o t e n t ia l a n d t h e in h ib it r a t e o f m it o c h o n d r

8、 ia l e n z y m e a s in d ic a t o r s o f m it o c h o n d r ia l d a m a g e w e r e m e a s u r e d b y f lu o r e s cen t s p e c t r o m e te r a n d t h e r e d u c t io n s o f t e t r a z o liu m d y e ( M T T ) ， r e s p e c t iv e ly . R e s u l t s C r ( V I ) r e s u lt - e d in s e v e

9、 r e c y t o t o x ic it y o f L 一 0 2 h e p a t o c y t e s . C o n c e n t r a t io n 一 d e p e n d e n t d e c r e a s e in cell s u r v iv a l r a t e o f C r ( V I ) 一 t r e a t e d L 一 0 2 h e p a t o c y t e s w e r e o b s e r v e d . T h e r e la t i o n s h i p b e t w e e n c o n cen t r

10、a t io n a n d s u r v iv a l r a t e w a s s ig n if ic a n t n e g a t iv e c o r r e la - t io n ( r =一 0 . 9 1 0 ) . T h e r e s u lt s o f p e r m e a b i l it y t r a n s it io n p o r e ( P T P ) o f m it o c h o n d r ia , m it o c h o n d r ia l m e m b r a n e p o t e n t ia l a n d t h e

11、in h ib it r a t e o f m it o c h o n d r ia l e n z y m e in a ll c o n cen t r a t io n s o f C r ( V I ) h a d s ig n if ic a n t d iff e r e n ce c o m p a r e d t o t h e c o n t r o l cells ( P 0 . 0 5 ) . C o n c l u s io n T h e r e s u lt s d e m o n s t r a t e d t h a t C r ( V I ) in d u

12、 ced L 一 0 2 h e p a t o c y t e s m it o c h o n d r ia l d a m a g e s r e la t e d t o a p o p t o s is . K e y w o r d s : H e x a v a le n t c h r o m iu m ; L 一 0 2 h e p a t o c y t e ; M it o c h o n d r ia p e r m e a b ilit y t r a n s it io n p o r e( P T P) ; M e m b r a n e p o t e n t

13、ia l ; Mit o c h o n d r ia l e n z y m e 铬是环境中常见的重金属污染物， C r ( I I I ) 由于不易通过细 胞膜而被认为基本无毒 。 C r ( V I ) 能通过细胞膜特异性离子 通道进人细胞内， 并在细胞内还原过程中产生活性氧族( r e a c - t i v e o x y g e n s p e c i e s , R O S ) 即含氧自由基( o x y g e n - d e r iv e d f r e e r a d i c a ls ) 如超氧阴离子( 汀一 ) 、 经自由基( “ O H ) 、 过氧化氢 ( H z

14、O z ) 等及一系列中间产物而造成细胞的程序性死亡即凋亡 ( a p o p t o s is ) z 7 。 肝 脏 是C r ( V I ) 作用的 主 要 毒 作 用 靶器 官， 肝细 胞线粒体不仅是体内的能量加工厂， 而且在决定细胞的生存或 作者单位: 中 南大学湘雅公共卫生学院毒理学系( 湖南 长沙 4 1 0 0 7 8 ) 作者简介: 肖 经纬( 1 9 7 8 一 ) ， 女， 北京市人， 在读硕士， 研究方向: 分子毒 理学。通讯作者: 钟才高( 1 9 5 4 一) ， 男， 教授， 硕士、 博士生导师。 死亡方面也起到非常重要的作用。线粒体损伤与细胞凋亡密 切相关 3

15、， 其损伤后的功能改变往往表现为膜电位的降低、 膜 的不稳定增加、 P T P 孔开放以及多种酶活性的降低或丧失。已 知活性氧( R O S ) 的过度积累可造成细胞内氧化和抗氧化的不平 衡状态即氧化应激， 引起细胞膜、 线粒体膜等膜结构的氧化损 伤， 或使线粒体内的氧化还原电子传递链紊乱， 破坏细胞的动 态 平 衡， 危 及 细 胞的 生 命活 动 闭。 另 一 方面， 线粒体 膜 通透 性 转运孔( P T P ) 的开放能够导致线粒体跨膜电位( 伽) 的改变， A T 生成减少， 也可促进R O S 产生5 .G 。 故本次实验重点在于 探讨C r ( V I ) 对L 一 0 2 人胚

16、肝细胞线粒体与凋亡相关功能的影 响， 为深人探讨C r ( V I ) 通过诱导生物机体氧化损伤所致细胞凋 亡的机制提供部分实验依据。 万方数据 实用预防医学 2 0 0 4 年1 0 月 第1 1 卷 第5 期 P r a c t i c a l P r e v e n t iv e Me d ic i n e , O c t - 2 0 0 4 , V o l 1 1 , N o . 59 1 9 1 . 1 材料与方法 材料 1 . 1 . 1 细胞系L 一 0 2 人胚肝细胞株( 简称L 一 0 2 肝细胞) ， 购自 武汉大学典型培养物中心。 1 . 1 . 2 主要试剂重铬酸钾(

17、K z C r z g， 分子量2 9 4 . 1 9 ， 上海 浦江化工厂， 基准级， 含量9 9 . 8 %以上) ; 胰蛋白酶( D i f c o 公司， 美国) ; D M E M 培养基( G I B U 公司， 美国) ; 新生胎牛血清 ( G I B C ( ) 公司， 美国) 。噬陛蓝( M T T , A m r 、 公司， 美国) ; 二 甲 基亚矾( D M S O , S ig m a 公司， 美国) ; 罗丹明1 2 3 ( R h 1 2 3 , S ig m a 公司， 美国) ; H E P E S ( A M E R S H A M公司， 美国) ; 曲拉通

18、X 一 1 0 0 ( T r i t o n 一 X 1 0 0 , S ig m a 公司， 美国); 蔗糖、 *M酸钠、 磷酸二氢 钾、 异丙醇等均为市售分析纯。 1 . 1 . 3 主要仪器MK 3型酶标仪( T h e r m o 公司， 美国) ; 9 6 0 M C 型荧光分光光度计( L E N G G U A N G公司， 美国) ; %孔 培养板及6 孔培养板( C o s t a r 公司， 美国) ; H H C P 一 1 型二氧化 碳细胞培养箱( 上海一恒科技有限公司) ; X l ) 一 1 0 1 型倒置生物 显微镜( J N O E C公司， 美国) ; F

19、o r m a T 2 5 超低温冰箱( 一 8 0 C, 美国) ; T D Z 5 一 4 . 0 型多管架自 动平衡离心机( 长沙天创仪器制 造有限公司) ; G L - 2 A型全自动高速冷冻离心机( 湖南仪器仪 表总厂科学仪器厂) ; O l y m p u s 普通双目 光学显微镜等。 1 . 2 方法 1 . 2 . 1 L - 0 2 肝细胞培养按常规细胞培养法培养L - 0 2 肝 细胞， 所用培养基为含 1 0 %胎牛血清的D ME M培养基， 置于 5 %二氧化碳培养箱中培养， 每2 一3 d 用0 . 2 5 %的胰酶消化并 传代一次。 1 . 2 . 2 L - 0

20、2 肝细胞生存率测定取处于对数生长期的L 一 0 2 肝细胞， 用0 . 2 5 %胰蛋白酶消化， 离心去上清后加人2 m l 含1 0 % 胎牛血清的D ME M培养基稀释， 充分吹打成单细胞悬 液， 取少许滴在细胞计数板的一侧， 盖上盖玻片， 显微镜下观察 计数， 调整细胞密度为1 一 2 x 104/ml.以每孔2 0 0 u l 单细胞 悬液接种于 % 孔培养板， 过夜后更换新鲜培养基， 培养 2 4 h 后， 设6 个浓度组即2 , 4 , 8 , 1 6 , 3 2 , 6 4 fu n o l/ L 和一个空白 对照 组， 6 个浓度组所有孔内 取出5 川培养基， 分别加人0 .

21、 0 8 , 0 . 1 6 , 0 . 3 2 , 0 . - 6 4 , 1 . 2 8 , 2 . 5 6 u m o l/ L k 2 C r 2 O , 溶液 各5 l ， 每 组6 个复 孔。 培养板继续在3 7 5 % C O 2 及饱和湿度条件下培养6 h ( 换用无血清培养基后) ， 每孔吸掉2 0 u l 培养基， 加人5 m g / m l M T T 2 0 u l ， 继续孵育4 h ， 小心吸掉培养基， 每孔加人 1 5 0 u l 二 甲基亚矾( D M S O ) ， 振荡 1 0 m i n 使结晶物充分溶解。用 MK 3 型酶标仪， 于4 9 0 n m处测

22、吸吸光度( A ) ， 计算其平均值。用下 清) ， 其 余组 依次加人0 . 0 8 , 0 . 1 6 , 0 . 3 2 , 0 . 6 4 , 1 . 2 8 , 2 . 5 6 m m o l/ L k 2 C r 2 C y 溶液 各5 0 讨及1 . 9 5 闪D ME M培 养基( 不 含 胎牛 血 清) ， 继续培养6 h o制备线粒体: 细胞消化吹打成单细胞悬 液后用2 m l P B S 洗一次， 离心去上清， 加含2 5 0 m m o l/ L 蔗糖的 细胞裂解液3 耐， 吹打均匀后于4 4 0 0 0 r / m in 离心1 0 m i n , 取上清再于4 1

23、0 0 0 0 洲 m in 离心 1 5 m in ， 所得沉淀即为线粒 体， 加入3 m l 测定介质P ( 2 5 0 m m o l/ L蔗糖、 2 m m o l/ L H E P E S , 0 . 5 m m o l/ L K H Z P O , , 4 . 2 m m o l/ L AM酸钠) ， 吹打均匀即成线 粒体悬液。然后定量测定线粒体蛋白含量， 使各组含量基本一 致。将上述线粒体悬液移人石英杯中， 发射及激发波长均为 5 2 0 n m， 温度2 5 ， 在9 6 0 M C型荧光分光光度计上测定吸吸 光度( 氏2 0 ) 。计算P T P 开放度( %) : P T

24、P 开 放 度 ( %)= 对照组吸光度值一染毒组吸光度值 对照组吸光度值 1 0 0 %。 ” 1 . 2 . 4 线粒体酶活力测定细胞预处理及染毒同P T P 孔 检 测。 细胞染毒6 h 后每孔吸去2 0 0 闪培养基后， 加人2 0 0 tL L M T T ( 5 m g / m L ) ， 继续培养4 h 后， 将细胞消化， 并用P B S 吹 打成2 m l 细胞悬液， 1 5 0 0 订 m in 离心1 0 m in ， 弃上清后沉淀加 0 . 4 m l 酸性异丙醇， 混匀并静置2 0 m i n ， 取1 0 0 川上清液加于 9 6 孔板上， 每组重复4 个复孔。M K

25、 3 型酶标仪上5 7 0 n m处 测定吸吸光度( A ) ， 计算其平均值。 酶抑制率( %) = 对照组吸光度值 一处理组吸光度值 对照组吸光度值 x 1 0 0 。 1 . 2 . 5 线 粒体跨膜电 位( 恤) 测 定细胞预处理、 染毒及 线粒体制备同P T l 检测。 将3 m l 线粒体悬液移人石英杯中， 加人浓度为2 0 m m o l/ L R h 1 2 3 溶液5 j l ， 保温3 0 m in 后检测 R h 1 2 3 荧光强度的变化。发射波长5 0 5 n m， 激发波长5 3 4 二 。 温度为2 5 ， 测定吸吸光度( A s i a ) o 1 . 3 统计

26、学处理实验数据采用S P S S 1 0 . 0 统计软件处理， 计 量资料用A N O V A分析， 结果以均数士 标准差表示。 列公式计算细胞活力: 细胞活力 样品的光吸收值 对照的光吸收值 x 1 0 0 。 1 . 2 . 3 线粒体膜通透性转运孔( P T P ) 检测细胞预处理: 将大培养瓶中的细胞用0 . 2 5 %的胰酶消化并吹打成单细胞悬 液， 调整细胞数为5 x 1 0 5 / m l 。将充分吹打均匀的细胞悬液接 种于6 孔板中， 0 . 5 r n l/ 每孔， 另外每孔再加1 . 5 r n l D M E M培养 基， 于二氧化碳培养箱中培养2 4 h o 染毒:

27、吸除每孔中全部的 培养基。 对照组加2 0 0 川新鲜的D M E M培养基( 不含胎牛血 2结果 2 . 1 C r ( V I ) 对L - 0 2 肝细胞生存率的影响M T I ， 比色试验 是检测细胞存活的重要方法。活细胞线粒体中的墟拍酸脱氢 酶能使外源性的显色剂 M T I 还原成难溶性的蓝紫色结晶物， 并沉积在细胞中， 只有具有完整线粒体的活细胞才可以还原 M T T ， 还原的M T I ， 量直接和存活细胞的数量相关， 死细胞无 此功能。 C r ( V I ) 作用于L 一 0 2 肝细胞6 h ， 加M T T 4 h 后， 倒置显微 镜下观察可见黄色的M TI ， 被还原

28、成紫蓝色颗粒， 加 】 ) M S ( ) 后 颗粒溶解， 各染毒组溶液颜色深浅不同。2 , 4 , 8 , 1 6 , 3 2 , 6 4 u - 0 1压C r ( V I 处理组细胞生存率分别为8 7 . 2 4 % , 7 2 . 2 9 % , 6 1 . 3 6 %, 5 3 . 0 7 %, 4 4 . 3 5 %, 4 1 . 2 8 %， 各C r ( V I ) 浓度处理组与 对照组比较， PG0 . 0 5 ， 并且 C r ( V I ) 对 L一 0 2 肝细胞增殖的抑 制作用存在明显的浓度一效应依存关系， 相关系数 Y = 一 0 . 9 1 0 , P= 0 .

29、0 2 5 ， 两者呈显著负相关， 即L - 0 2 肝细胞生存 率( %) 随C r ( 班) 浓度增加而降低见图 1 。 根据 MT I ， 的试验结 万方数据 9 2 0实用预防医学 2 0 0 4 年1 0 月 第1 1 卷 第5 期 P r a c t ic a l P r e v e n t iv e M e d ic i n e , O c t . 2 0 0 4 , V o l 1 1 , N o . 5 果， 为保证细胞存活率在二个比 较适宜的范围及统计分析的需 要， 下列线粒体损伤检测 试验均采用2 , 4 , 8 , 1 6 , 3 2 p x n o V L 的细 胞染

30、毒浓度设置， 细胞处理时间为6 h o 1 0 0 9 0 00 六石口尹6050 李1巴 403020100 勺卜己n的 2 4 8 1 6 3 2 C r ( V I ) ( L L m o l / L ) F ig I G r a d e d c o n c e n t r a t io n 一 r e s p o n s e r e la t io n s h ip s b e t w e e n C r ( V I ) e x p o s u r e a n d L 一 0 2 h e p a t o c y t e s u r v i v a l r a t e S u r v i

31、 v a l r a t e s o f L 一 0 2 h e p a t o c y t e s e x p o s e d t o 0 一 6 4 f u n o l/ L C r ( V I ) f o r 6 h d e c r e a s e d w i t h i n c r e a s e o f C r ( V I ) 一 t r e a t c o n c e n t r a t io n 2 . 2 C r ( V I ) 对L - 0 2 肝细胞线粒体膜通透性孔( P T P ) 的影响 线粒体肿胀是P T P 开放的直接结果， 因此测定线粒体肿胀可 直接反应P T P

32、 是否开放7 ,8 l 。 线粒体肿胀导致透射光增多， 散 射光减少。试验发现， 不同浓度C r ( V I ) 处理组均使吸光度下 降， 与对照组比 较P 0 . 0 5 ， 且呈一定的浓度一 效应依存关系， T a b l e 1 E f f e c t o f C r ( V I ) o n L 一 0 2 h e p a t o c y t e m i t o c h o n d r i a l p e r m e a b i l i t y t r a n s i t io n p o re( P T P ) 表明线粒体肿胀及 P T P孔开放程度随C r ( V I ) 浓度增加而

33、增 加， 见表t o 2 . 3 C r ( V I ) 对L - 0 2 肝细胞线粒体总酶活性的影响 不同浓 度的C r ( V I ) 作用于L 一 0 2 肝细胞6 h 后， 结果发现各C r ( V I ) 浓 度处理组线粒体总酶活性与对照组比较， P 值均小于0 . 0 5 ， 见 表2 ; L - 0 2 肝细胞线粒体总酶活性的抑制作用随C r ( V I ) 浓度 的增加而加强， 二者相关系数y = 0 . 9 0 6 , P = 0 . 0 1 3 ， 表明C r ( V I ) 对L - 0 2 肝细胞线粒体总酶活性的影响具有浓度一 效应依存 关系。 2 . 4 C r (

34、V I ) 对L - 0 2 肝细胞线粒体跨膜电位( o m) 的影响 P T P 的 开 放 引 起 线 粒体 跨膜电 位( 恤) 的 变 化 19 1 0 罗 丹明 1 2 3 ( R h 1 2 3 ) 是阳 离子染料， 能够依靠线粒体跨膜电 位进人线粒 体基质， 而使其荧光消失。线粒体跨膜电位丧失时， R h 1 2 3 则重 新从线粒体释放而发出荧光。 C r ( V I ) 作用于L 一 0 2 肝细胞6 h 后， 2 , 4 , 8 , 1 6 , 3 2 p x n o l/ L C r ( V I ) 染毒组的线粒体反应液吸光度 值分别为1 1 . 1 士 0 . 2 , 1

35、 5 . 1 士 0 . 3 , 1 6 . 1 士 0 . 3 , 1 8 . 2 土 0 . 3 , 2 3 . 3 士 0 . 4 ， 各 C r ( V I ) 浓度处理组与对照组( 9 . 2 士 0 . 2 ) 比较， 尸 0 . 0 5 。 结果表明， W E) 可促使线粒体反应液荧光强度增高即 线粒体跨膜电位下降， 经统计学处理， 二者呈显著负相关( r = 一0 . 9 4 5 , P=0 . 0 0 4 )。 C r ( V I ) 浓度( ta wU L )次数( 次)吸光度( 壬 士 : ) 7 2 . 2士0 . 7 5 P1 7 开放度( %) 6 8 . 1 士0

36、 . 9 0. 5 . 6 8 5 9 . 8士0 . 6 0- 1 7 . 1 7 5 6 . 6士0. 3 5 * 2 1 . 6 1 5 2 . 1 士0 . 5 0 * 2 7 . 8 4 4 5 . 0士0 . 3 0 * 3 7 . 6 7 481632 g rou p, i n d i c a t e s ; a s t a t is t ic a l ly s ig n if i c a n t d i f f e r e n c e f ro m t h e c o n t r o l 尸0 . 0 5 . T a b l e 2 E f f e c t o f C r (

37、V I ) o n L 一 0 2 h e p a t o c y t e m i t o c h o n d r i a l e n z y m e C r ( V I ) 浓度( PM 刃 L )孔数( 个)吸光度( s士: )总酶活性抑制率 ( %) 0 . 5 8士0 . 0 6 0 0. 5 0士0. 0 7- 1 2. 9 9 0 . 4 7士0 . 0 2- 2 2 . 3 7 0 . 4 0士0. 0 4 * 2 9 . 8 8 0 . 3 6士0 . 0 2 * 3 8 . 0 9 0 . 2 9士0 . 0 6- 4 9 . 9 0 月，才，月斗刀，日斗4 02481632

38、 g ro u p, in d ic a t e s : a s t a t i s t i c a l ly s ig n if i c a n t d i f f e r e n c e f r o m t h e c o n t ro l P 0 . 0 5 . 3 讨论 以往的研究已经证实C r ( V I ) 具有诱导肝细胞凋亡的作用， 其细胞凋亡率与C r ( v i ) 具有明显的浓度一 效应关系， 凋亡的形 态学和生物化学变化也得以验证。C r ( V I ) 诱导肝细胞凋亡的 两条途径即P 5 3 依赖和P 5 3 非依赖性途径中的关键性物质包 括活性氧( R O S ) ,

39、 c a s p a s e s 、 细胞色素C及凋亡诱导因子( A I F ) 等 1 0 . 1 1 7 ， 但C r ( V I ) 诱导凋亡的 具体作用机制目 前尚 不清楚。 细胞凋亡不仅与细胞核的改变有关， 而且与线粒体功能的 改变相联系 1 2 1 。 在细胞凋亡机制研究中， 线粒体已 成为细胞凋 亡研究的的重要对象。凋亡过程中线粒体呼吸链电子传递中 断， 自 由基产生， 能量供应受阻。 . 在检测到经典的凋亡特征以 前， 线粒体膜的完整性就已经发生了重大的变化。这些变化涉 及到线粒体内膜和外膜的改变， 包括内膜跨膜电位的丧失和 ( 或) 蛋白 质通过外膜释放。线粒体在细胞存亡机制

40、中越来越 引起人们的重视， 一方面是由于线粒体膜间隙的细胞色素C释 放到 胞质 后触 发c a s p a s e s 级 联， 导 致细 胞死亡 ” ; 另 一方面， 线 粒体外膜上B d 一 2 蛋白家族调控细胞色素C 从线粒体中释放。 概括而言线粒体与细胞凋亡密切相关的功能改变包括P T I 孔、 跨膜电位、 总酶活性等方面。线粒体膜通透性转运孔( P T P ) 的 开 放能够导致线粒体跨膜电位( 恤) 的 崩溃， 胧冬肤酶 ( c a s p a s e s ) 的活化和凋亡诱导因子( 细胞色素C , 凋亡诱导因子 ( A I F ) , S m a c / D I A B L (

41、) 等) 的释放， A T P 生成减少， 酶活性降低 或丧失以及有时由于氧的不完全氧化导致的氧自由基的 增 加 等 14- 161 。 P T P 孔是由 线粒体内膜和外膜跨膜蛋白共同形成的一种 高电导非选择性通道， 许多证据表明它可能是由腺昔转移酶 万方数据 实用预防医学2 0 0 4 年1 0 月第 1 1 卷第5 期P r a c t ic a l P r e v e n t i v e Me d i c in e , O c t . 2 0 0 4 , V o l 1 1 , N o . 59 2 1 ( t r a n s lo c a t io n o f a d e n in

42、e n u c le o t i d e s , A N T ) 电 压依赖性阴 离子通 道( v o l t a g e 一 d e p e n d e n t a n io n c h a n n e l , V D A C ) 和c y c lo p h io in D组 成的 ” ， 其生理作用可能参与细胞内 钙稳态调控、 生理性钙震 荡、 防止线粒体钙超载以及 A T P / A D I 的转运与能量代谢 等 18 .19 0 P T P 孔 作 为 细 胞 许多 生 理 效 应( 包 括电 压、 二 价阳 离 子、 线粒体基质 P H值、 氧化还原状态、 A D P , A T P

43、 、 一些代谢产 物如葡萄糖、 肌酸、 繁醒等) 的 感受器 2 2 1 ， 它整合了 细胞电 生理、 氧化还原与细胞代谢状态的多种生物学信息。因此， P T P 在维 持线粒体和细胞的正常生理功能方面起着重要的作用。P T P 开放可以使分子量高于 1 . 5 K L 的物质进人线粒体基质， 导致 线粒体肿胀。随着线粒体的肿胀， 折叠的内膜皱折逐渐打开， 最终导致线粒体外膜胀破， 使得线粒体间隙内的促凋亡因子释 放2 0 1 。 线粒体内电 子经呼吸 链传递时， 将质子由内 膜的 基质侧 转至内膜外， 质子不能回流而形成电化学梯度( 包括 H + 浓度梯 度和跨膜电位差) ， 作为能量储备供

44、给A T P 合成所需。C r ( V I ) 可能通过作用于P T P 孔使其开放， 质子回流致跨膜电位下降， 线粒体合成A T P 受阻， 酶活性受到抑制， 细胞的能量供给发生 危机而促进细胞的凋亡。 肝脏是 C r ( V I ) 毒作用的主要靶器官之一。周小玲等 ( 1 9 9 0 ) 用小鼠一次性腹腔注射C r O , 溶液3 2 m g / g 2 4 h 后， 肝 小叶周边肝细胞的葡萄糖一 6 一 磷酸酶( G一 6 一 P a s e ) , 唬拍酸 脱氢酶( S D H ) 活性明显下降， 线粒体、 内质网有明显的病理改 变2 1 1 o K e j ia n L i。 等(

45、 2 0 0 1 ) 大鼠 气管注射1 0 0 p 1 1 0 0 m m o l / L C r ( V I ) 1 0 m i n ， 采用核磁共振成像( M R I ) 系统可检测到肝脏中 高浓度的C r ( V I ) 快速还原中间产物C r ( V ) 和C r ( 1 1 1 ) ;2 z 7 。以上 研究表明C r ( V I ) 可导致肝脏功能性与器质性的损害， 其损害机 理可能与C r ( V I ) 还原过程中产生含氧自由基引起肝细胞凋亡 有关。基于C r ( V I ) 对肝细胞凋亡的诱导作用和线粒体对凋亡 的调控， 可以从理论上推断 C r ( V I ) 可能通过产生

46、含氧自由基造 成线粒体的损伤， 而促进肝细胞凋亡。因此， 本实验检测C r ( V I ) 对与细胞凋亡息息相关的线粒体膜通透性转运孔( P T P ) , 线粒体 跨膜电 位( 0 M ) 、 线粒体总酶活性等方面的 改变， 对研 究C r ( 班) 诱导的细胞凋亡机制具有重要意义。 本次实验研究检测了C r ( V I ) 对 L - 0 2 肝细胞线粒体与凋 亡相关的一些损害效应， 为开展C r ( V I ) 诱导肝细胞凋亡机制研 究提供了部分实验依据， 但要阐明线粒体损伤在C r ( V I ) 诱导的 细胞凋亡通路中的作用还有待进一步深人探讨。 参考文献 1 B a r u t h

47、 io F . T o x ic e f f e c t s o f c h r o m iu m a n d i t s c o m p o u n d s J . B io l T r a c e E le m R e s , 1 9 9 2 , 3 2 : 1 4 5 一 5 3 . 仁 2 K e J i a n L i u , X ia n g l i n S h i . I n v i v o r e d u c t io n o f c h r o m i u m ( V I ) a n d i t s r e l a t e d f r e e r a d ic a l g e

48、 n e r a t io n J . M o le c u la r a n d C e ll u la r B io c h e m i s - t r y , 2 0 0 1 ， 2 2 2 : 4 1 一 4 7 . 3 J o z a N , S u s i n S A , D a u g a s E , e t a l . E s s e n t ia l r o l e o f t h e m it o c h o n d r i a l a p o p t o s i 、 一i n d u c in g f a c t o r i n p r o g r a m m e d c

49、 e l l d e a t h J .N a t u r e , 仁 4 K u z a 一 S c h u g h a r t L A , H a b b e r s e t t R C , F r e y e r J P . Mit o c h o n d r ia l f u n c - t io n i n o n c o g e n e 一t r a n s f e c t e d r a t f i b r o b l a s t s i s o l a t e f r o m m u t i c e l l u l a r s p h e r o id s J . A m J P h y s io l , 1 9 9 7 , 2 7 3 ( 5 p t 1 ) : c 1 4 8 7 一 1 4 9 5 . 5 H e n g a r t n e r M. T h e b io c h e m is t r y o f a p o p