六价铬对草鱼肝脏SOD和GSHPX活力的影响.pdf

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1、第 2 8卷第 2期 2 0 0 6年 4月 西南农业大学学报 (自然 科 学 版 ) J o u rna l o f S o u t h w e s t A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y( N a t u r a l S c i e n c e ) V o l . 2 8 , N o . 2 An n 2 0 0 6 文章编号: 1 0 0 ( 一 2 6 4 2 ( 2 0 0 6 ) 0 2 一 0 3 3 3 一 0 4 六价铬对草鱼肝脏 S O D和 G S H - P x 活力的影响 耿晓修， 丁诗华 ， 孙翰昌; 廖品福， 张

2、涛 ( 西南大学水产与水文学院水产生物技术实验室， 重庆 ) 0 7 1 6 ) 摘要: 采用灌喂法， 研究不同剂量六价铬在4 8 h内对草鱼肝脏超氧化物歧化酶 ( S O D ) 和谷脱甘肤过氧化物i* ( G S H - P x ) 活力的影响。结果显示， 用较低剂量的六价格处理时， 草鱼肝脏S O D和G S H - P x 的活力均出 现不同 程度的、 短暂的 诱导效应; 当六价格剂量较高时， S O D和G S H - P x 的活力并未出 现明显的诱导现象， 2 种酶的活力均随六价格剂量的增 加而下降。由 此可见， 2 种酶的活力变化与六价格剂量具有一定的相关性。此外， 这2 种酶

3、对六价格的敏感性也存在 一定程度的差异， 其中S O D对六价格较敏感， 更易受六价格的影响。 关键词: 六价络; 草鱼; 谷耽甘肤过氧化物酶; 超氧化物歧化酶 中图分类号: X 1 7 1文献标识码: A E F F E C T S OF . HE XA VAL E N T C HR OMI UM O N S OD AN D G S H- P x A C T I V I T I E S I N L I V E R O F C T E NO P H A R Y NG O DO N I D E L L U S . 一 笼. nGENG Xi a o一 ( L a b o r a t o ry o

4、 f D I N G S h i 一h u n . A q u a t i c B i o e n g i n e e r i n g , , S U N H a n一 c h a n g , L I A O P i n一 f u , Z H A N G T a o S o u t h w e s t U n i v e r s i ty , C h o n g q i n g 4 0 0 7 1 6 ， C h i n a ) A b s t r a c t : S a m p l e s o f g r a s s c a r p【 C te n o p h a r y n g o d o

5、 n i d e l l u s ) w e r e a d m i n i s t e re d w i t h d iff e r e n t d o s a g e s o f C r ( V I ) b y e n t e r i c f e e d i n g a n d o b s e r v e d f o r 4 8 h t h e r e a f t e r . T h e a c t i v i t i e s o f S O D【 s u p e r o x i d e d i s m u t a s e ) a n d G S H - P x g l u t a t h

6、 io n e p e r o x i d a s e ) w e re f o u n d t o u n d e r g o a t r a n s i e n t i n c re a s e a f t e r l o w e r d o s a g e a d m i n i s t r a t i o n o f C r ( V I ) . I n c o n t r a s t , a d m i n i s t r a t i o n o f h i g h e r d o s a g e s r e s u l t e d i n a d e c re a s e i n S

7、 O D a n d / o r G S H - P x a c t i v i t y . I t i s t h u s c o n c l u d e d t h a t t h e C r ( V I ) - i n d u c e d c h a n g e s i n e n z y m e a c t i v i t y i s d o s a g e - d e p e n d e n t . S O D w a s m o re s e n s i t i v e t o C r ( V I ) t h a n G S H - P x . K e y w o r d s ;

8、C r 6; g r a s s c a r p ( C t e n o p h a r y n g o d o n id e l l u s ) ; g l u t a t h i o n e p e ro x i d a s e ; s u p e ro x i d e d i s m u t a s e 铬及其化合物广泛应用于工业生产的各个领域， 由此产生的大量含铬工业废水可能进人江河湖泊， 对 渔业生态系统造成严重威胁。水体中的铬污染物主 要为六价铬， 易溶于水且十分稳定， 较易被水生动物 吸收， 并在体内蓄积。 六价铬在动物体内的蓄积将产 生一些毒性作用， 它可进人血细胞将血红蛋白氧

9、化为 高铁血红蛋白， 还能抑制很多代谢酶的活性， 干扰体 内 正 常的 生 理 生 化 活 动， 甚 至 引 起中 毒 死 亡 一 。 通 过检测六价铬对实验动物的损害性质和程度， 可以评 价六价铬的毒性， 但一种污染物的 毒性通常会因实验 对 象的 不同 而 存在明 显的 差异 I 。 草鱼( C t e n o p h a - r y n g o d o n id e l l u s ) 对养殖水体的 水质要求较高， 对环境 污染物较为敏感， 是研究六价铬毒性效应的理想模式 动物。 对环境污染物的毒理机制研究表明， 很多重金属 污染物可引起氧化胁迫。在正常的生理状态下， 水生 收稿日 期二

10、 2 0 0 5 一 1 0 - 2 4 基金项目: 重庆市自 然科学基金资助项目( 9 1 2 1 ) 作者简介: 耿晓修( 1 9 8 1 一 ) ， 男， 山东青岛人， 西南大学硕士研究生， 从事水产动物生理生化研究。 * 为通讯作者 3 3 4 西南农业大学学报( 自 然科学版)2 0 0 6 年4月 动物的抗氧化防御系统可有效清除生理代谢过程中 产生的活性氧自由基， 使机体内的自由基处于平衡状 态。但在外源污染物胁迫时， 抗氧化防御系统的组成 成分如超氧化物歧化酶( S O D ) 、 谷胧甘肤过氧化物酶 ( G S H - P x ) 等抗氧化酶的活力可能发生改变， 导致自 由 基

11、代谢平衡被打破， 对水生动物正常的生理功能造 成不利影响。因此， 抗氧化酶活力的变化可作为某些 污染物 胁迫的生化指标闭。目 前， 国内外有关六价 铬胁迫对鱼类生物学效应的研究主要集中在六价铬 的 毒 性测 定及其对鱼类生长发育的 影响 一 s ， 尚 未 发现有关六价铬胁迫对鱼类抗氧化酶活力影响的报 道。本文以草鱼作为研究对象， 利用不同剂量的六价 铬灌喂草鱼， 研究六价铬对肝脏抗氧化酶活力的影 响， 从而为进一步揭示六价铬的分子毒理机制提供一 定的实验依据。 1 材料与方法 1 . 1 实验鱼及实验条件 实验草鱼购于重庆北暗区歇马育苗场， 体质健 壮， 体重为1 0 士 2 g ， 在实验

12、室驯养1 周后用于实验， 养殖用水为曝气7 d 的自 来水， 养殖水体温度为2 0 t 2 9 C , p H 为7 . 0 ， 适量投喂配合饲料。 1 . 2 实验方法 1 . 2 . 1 灌 喂实 验六价铬溶液用重铬酸钾配制， 用 于草鱼的 灌喂实验。根据草鱼体重设置5 个不同的 六价铬剂量， 即0 . 0 1 , 0 . 0 2 ; 0 . 0 3 , 0 . 0 4 及0 . 0 5 m g / g 体重， 每个剂量设2 个平行组， 另设2 个对照组， 每组 放养草鱼巧尾。实验期间的养殖管理与暂养期间完 全相同。 1 . 2 . 2 样品的采集和处理实验开始后分别于1 2 , 2 4

13、, 3 6 , 4 8 h 取样， 从每1 组中随机取3 尾草鱼。将鱼 体剖开后， 取出肝脏， 在冰浴中用电动匀浆器匀浆， 制 成2 0 % ( W / V ) 匀浆液。然后， 于4离心( 1 0 0 0 0 r / m i n , 5 m i n ) ， 取上清液贮存于一 2 0备用。 1 . 3 酶比活力的测定 1 . 3 . 1 S O D活力测定 采用邻苯三酚自 氧化法 6 1 于3 7 进行测定， 每m i n 抑制1 m L 反应液中的邻苯 三酚自 氧化速率达5 0 %的酶量定义为 1 个酶活力单 位( U ) 。 1 . 3 . 2 G S H - P x活力刚定参照改进的 H

14、a ff e m a n 法7 l ， 于2 5 9 0 , p H 8 . 5 的 条 件 下 进 行 测 定。 每m g 酶 样品每m i 。 使反应体系中 G S H - P x 浓度降低 1 N L m o l/ L( 扣除非酶反应) 的 酶量作为1 个酶活力单 位( U / m g ) 。 1 . 4 蛋白含量测定 参照考马斯亮蓝法测定 8 1 ， 以牛血清白蛋白 ( B S A ) 为标准蛋白。 1 . 5 数据的处理和分析 实验数据结果均以“ 平均数 士 标准差” 表示。统 计分析采用S P S S 1 1 . 0 软件， 组间差异显著性分析采 用z 检验法尹 0 . 0 5 表

15、示差异具有显著性。 2 结果与分析 2 . 1 六价铬对肝脏S O D活力的影响 测定结果显示， 用较低剂量的六价铬( 0 . 0 1 - 0 . 0 3 m g / g 体重) 处理后， 草鱼肝脏S O D的活力出现 一定程度的诱导效应( 表1 ) ， 且诱导效应随六价铬剂 量升高而增强。如六价铬剂量为0 . 0 1 m g / g 体重时 诱导效应较弱， 与对照组相比酶活力升高不显著; 但 当 六价铬剂量提高到0 . 0 3 m g / g 体重时， S O D活力受 到的诱导最强， 诱导效应持续的时间亦较长， 且每一 采样时间测得的酶活力均显著高于对照组。值得注 意的是， 低剂量六价铬处

16、理时， S O D活力一般在第3 6 h 达到峰值， 提示六价铬对 S O D活力的诱导需要一 定的时间， 且在处理3 6 h 后， 诱导作用逐渐消失。当 六价铬剂量较高( 0 . 0 4 一 0 . 0 5 m g / g 体重) 时， 没有出 现明显的诱导效应， 与此相反， S O D活力受到较强的 抑制。 这种抑制作用在第2 4 h 开始出现， 在第4 8 h 抑制作用最强， 此时 S O D活力显著低于对照组。在 整个实验期间， 对照组的S O D活力基本保持恒定， 没 有出现明显的变化。这些结果说明， 六价铬处理可对 草鱼肝脏S O D活 力产生一定的影响， 其影响程度与六 价铬的

17、剂量有关。 较低的六价铬剂量引起S O D活力 出 现诱导效应， 但六价铬剂量超过一定的限 度时， S O D 酶活力随六价铬剂量的增加而出现更强的抑制。 2 . 2 六价铬对肝脏G S H - P x 活力的影响 草鱼经不同 剂量的六价铬处理后， 其肝脏G S H - P x 活力在整个实验期间发生明显的变化( 见表2 ) 0 灌喂所用的 六价铬剂量越低， 草鱼肝脏G S H - P x 活力 受到的 诱导作用就越强， 但这种诱导作用只能持续短 暂的时间。例如， 经低剂量( 0 . 0 1 , 0 . 0 2 m g / g 体重) 六价铬处理后的 第1 2 h 和第2 4 h ， 实验组的

18、G S H - P x 活力有一定程度甚至显著的升高， 随后酶活力逐渐下 降。 第2 8 卷第2 期耿晓 修等 六价铬对草鱼 肝脏S O D和G S H - P x 活力的影响3 3 5 表 1 不同剂f的六价铬对草鱼肝脏S O D活力的影响 T a b l e 1 E ff e c t s o f C r ( V I ) o n S O D a c t iv i t y i n l i v e r o f C t e n o p h a r y n g o d o n i d e l l u s 六价铬剂量 / ( m g B 一 ) 酶 活 力 /(U m g 一 I ) 1 2 . 7

19、3 t 1 . 3 2 1 2 . 7 6士0 . 7 8 1 4 . 7 5 10 . 9 4. 1 6 . 7 3士1 . 6 1二 1 4 . 0 1士1 . 7 5 1 2 . 5 0 t 1 . 6 7 1 2 . 1 4士1 . 1 5 1 3 . 1 5士1 . 4 8 1 5 . 3 5 t 1 . 8 3二 1 7 . 4 2士 2 . 0 2 “ 1 1 . 5 1士1 . 2 5 1 0 . 7 1土0 . 9 5 1 1 . 9 2士1 . 4 3 1 2 . 9 0土1 . 2 2 1 6 . 0 2土1 . 3 6* . 1 8 . 7 2土2 . 2 5二 1 0

20、 . 1 4 t 1 . 3 3* 9 . 2 0士1 . 2 1 二 1 1 . 6 1士1 . 2 6 1 1 . 6 8士1 . 3 5 1 2 . 3 6 t 1 . 6 4 1 6 . 6 3士1 . 8 6二 9 . 5 6士1 . 3 4 8 . 1 5土0 . 8 8二 00102030405 00000 注:* 表示与对照组的差异显著性， P 0 . 0 5 ;* 表示与对照组的差异显著性， P 0 . 0 1 o N o t e : * r e p re s e n t s s i g n i fi c a n t d i f f e r e n c e b e tw e

21、e n c o w t r o l a n d t r e a t e d g ro u p , P 0 . 0 5 ;* re p re s e n t s s i g n i f ic a n t d i ff e re n c e b e t w e e n c o n t ro l a n d t re a t e d g ro u p , P 0 . 0 1 ; t h e s a m e h e r e i n a f t e r . 表2 不同荆f的六价铬对肝脏G S H - P x 活力的影响 T a b l e 2 E ff e c t s o f C r ( V I ) o

22、 n G S H - P x a c t i v i ty i n l i v e r o f C t e n o p h a r y n g o d o n i d e ll u s 六价铬剂量 / ( m g 9 一 ) 酶活 力/(U m g 一 ) 中 . 种、月，7哎户 0000 : *. 4气7内J7 0000卜U 巾 * 613七月峪，口 nnU00C 0 . 6 1士0 . 0 8 0 . 7 0士0 . 0 7 0 . 7 6士 0 . 0 7二 0 . 5 6土0 . 0 5 0 . 5 4士0 . 0 7 2 4 h 0 . 6 2 10 . 0 . 7 9士0 . 0

23、. 6 8 t 0 . 0 . 5 3士 0 . 0 . 5 1士0 . 3 6 h 0 . 6 0 1 0 . 0 . 6 5 10 . 0 . 6 0 t 0 0 . 4 8 t 0 0 . 4 5 1 0 . 4 8 h 0 . 6 2士0 . 0 . 5 9士0 0 . 5 6土0 . 0 . 4 5士0. 0 . 4 2 10 . ( 拓 巾. ，1，门、气 0.00 0卜Ij00 当草鱼经较高剂量的六价铬( 0 . 0 3 , 0 . 0 5 m g / g 体重) 处理后， 草鱼肝脏 G S H - P x 活力受到较强的抑 制。 从灌喂后的第1 2h 开始， G S H - P

24、 x 活力出现一定 程度的下降， 到第3 6 h 和第4 8 h , 酶活力受到较强的 抑制， 与对照组相比具有显著性差异。这些结果表 明， 同一采样时间测得的酶活性与灌喂所用的六价铬 剂量有明显的关系。在4 个六价铬实验组中， 六价铬 剂量越高， 肝脏 G S H - P x 活性就越低。而草鱼经六价 铬灌喂处理后， 肝脏 G S H - P x 活性抑制的持续时间也 与六价铬剂量有明显的关系。灌喂所用的六价铬剂 量越高， G S H - P x 活性抑制的持续时间越长。 反之， 灌 喂所用六价铬剂量越低， G S H - P x 活性抑制的持续时 间越短。 以上结果表明， 在实验期间草鱼肝

25、脏 S O D和 G S H - P x 的活力变化趋势有一定程度的相似性， 但2 种酶对六价铬敏感程度不同( 见表 1 、 表2 ) 。草鱼经 低剂量六价铬灌喂处理后， S O D和G S H - P x 这2 种酶 的活力均出现先诱导后抑制的现象。其中， 用0 . 0 2 m g / g 体重以 下的低剂量六价铬处理时， S O D活力受 到比较明显的诱导作用， 其酶活力变化的幅度高于 G S H - P x 活力变化幅度， 说明在低剂量六价铬的作用 下， G S H - P x 较敏感。当六价铬的剂量升至0 . 0 3 m g / g 体重时， S O D活力的变化十分显著， 而 G S

26、 H - P x 的活 力与对照组相比， 并无明显的变化。当六价铬的灌喂 剂量达到0 . 0 5 m g / g 体重时， 2 种酶活力都保持较为 明显的下降趋势。对这些结果进行综合分析时， 发现 六价铬灌喂处理对草鱼肝脏S O D活力的影响更大， 而对G S H - P x 活力的影响则相对较小， 说明草鱼肝脏 S O D 对六价铬更为敏感。 3 讨论 本实验发现微量的铬可激活草鱼抗氧化酶活力， 提高鱼体自 身抵抗逆境的功能。而过量的铬对鱼体 具有毒害作用， 甚至引起鱼类死亡 9 - 10 。它的毒性 作用与自 身的存在形式有关， 研究表明鱼类肠道对六 价铬的吸收效率较高， 远大于对三价铬的

27、吸收效率。 进人体内的六价铬可在细胞内被还原为三价铬， 并以 络合物的形式稳定存在。而鱼类肠道对三价铬的吸 收 效率较低， 故很少进人鱼体内 ， 川。 实验表明， 在 低剂量的六价铬( 低于0 . 0 2 m g / g 体重) 胁迫下草鱼 肝脏内的S O D和G S H - P x 活力都先升高然后下降， 在 灌喂后的4 8 h内， 2 种酶的活力峰值一般出现在2 4 一 3 6 h o 2 种酶在短时间内的活力诱导过程可认为 是草鱼对六价铬胁迫的适应阶段， 通过适应性调节机 体的相关生理机能活动， 从而增强机体抗氧化防御系 统清除活性氧自由基的能力。一些研究者对其他水 环境污染物的研究也发

28、现， 当生物体受到轻度胁迫 时， 在短期内 机体组织的S O D 和G S H - P x 活力往往会 升 高 12 一 ， ， 甚至 在一 定的 浓 度范围内， 酶活 力随 污染 物浓度增加而逐渐升高。本实验同样发现了类似的 3 3 6 西南农业大学学报( 自 然科学版)2 0 0 6年4月 现象， 如灌喂 所用的 六价铬剂量若在0 . 0 3 m g / g 体重 以内， 随着六价铬剂量的增加， 草鱼肝脏S O D活力受 到的诱导作用就越强。 但六价铬的胁迫程度若超过草鱼生理机能的适 应能力时， 就会对草鱼抗氧化系统的功能造成伤害， 影响体内自由基的代谢平衡， 甚至引起鱼体的其他生 理功能

29、下降。因此， 在本实验中随着灌喂所用的六价 铬剂量增加， 草鱼肝脏 S O D和G S H - P x 的活力逐渐下 降， 提示机体抗氧化功能受到损伤， 这与较高浓度的 锡污染物所引起的抗氧化酶活力下降有相似之 处 一 ， 。 目 前， 国内外已对铬的毒理机制进行过较多的研 究， 但有关铬的毒理机制仍有待进一步阐明。大量的 研究表明， 六价铬本身具有较强的氧化能力， 且容易 穿过细胞膜进人细胞， 通过氧化反应直接引起某些蛋 白 质失活并导致活性氧产生【 ， 。 此外， 一些研究还 揭示了六价铬的遗传毒性， 包括引起D N A损伤、 基因 突 变 及染色体畸变等2 ,5 ) 。 六价铬的遗传毒性

30、效应 归根结底是由于六价铬与 D N A发生相互作用的结 果。虽然尚不清楚六价铬胁迫所引起的草鱼肝脏抗 氧化酶活力下降应归因于六价铬本身的氧化作用， 还 是遗传毒性效应， 但考虑到遗传毒性效应产生的过程 较长， 我们推测六价铬所诱导的活性氧胁迫可能是草 鱼抗氧化酶活力受到影响的主要原因。 3 4 5 K R U M S C H N A B E L G , N A W A Z M . A c u t e t o x i c i t y o f h e x a - v a l e n t c h r o m i u m i n i s o l a t e d t e l e o s t h e p

31、 a t o c y t e s J . A q u a t T o x i c o l , 2 0 0 4 ， 7 0 : 1 5 9一 1 6 7 . 刘慧， 王晓蓉， 王为木， 等. 低浓度锌及其E D T A配合 物长期暴露对卿鱼肝脏锌富集及抗氧化系统的影响 J . 环境科学， 2 0 0 5 ， 2 6 ( 1 ) : 1 7 3 一 1 7 6 . S T E I N H A G E N D, H E L M U S T , M A U R E R S , e t a l . E ff e c t 参考文献: 1 2 F A R A G A M, M A Y T , M A R T

32、 Y G D , e t a l . T h e e ff e c t o f c h r o n i c c h ro m i u m e x p o s u re o n t h e h e a l t h o f C h i n o o k s a l m - o n( O n e o r h y n c h u s ts h a w y t s c h a ) J .A q u a t T o x i c o l , 2 0 0 6 ， 7 6 : 2 4 6 一 2 5 7 . T E L E S M , P A C H E C O M , S A N T O S M A . P h

33、 y s i o l o g i c a l a n d g e n e t i c r e s p o n s e s o f E u ro p e a n e e l ( A n g u il la a n g u i l l a L . ) t o s h o rt - t e r m c h ro m i u m o r c o p p e r e x p o s u re - I n fl u e n c e o f p r e e x p o s u r e t o a P A H - l i k e c o m p o u n d J . E n v i r o n T o x

34、i - c o l , 2 0 0 5 ， 2 0 : 9 2一 9 9 . o f h e x a v a l e n t c a r c i n o g e n i c c h r o m i u m o n c a r p C y p r i n u s c a r p i o i m m u n e c e l l s J . D i s A q u a t O r g a n , 2 0 0 4 ， 6 2 : 1 5 5 一1 6 1 6 李永利， 张众. 邻苯三酚自氧化法测定 S O D活性【 J . 中国 卫生检验杂志， 2 0 0 0 , 1 0 ( 6 ) ; 6 7 3

35、. 7 H A F F E M A N D G , S U N D E R A , H O E K S T R A W G , e t a l . E ff e c t o f d i e t a ry s e l e n i u m a n e r y th r o c y t e a n d l i v e r g l u t a t h i - o n e p e ro x i d a s e i n t h e r a t J .N u t r i t i o n , 1 9 7 4 , 1 0 4 : 5 8 0 一5 8 7 . 8 张龙翔， 张庭芳， 李令媛. 生化实验方法和技术

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