《冷冻猪肝细胞在生物型人工肝系统中的生存状态研究.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《冷冻猪肝细胞在生物型人工肝系统中的生存状态研究.pdf（3页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、文章编号： 1000-5404 （2005） 12-1247-03论著 冷冻猪肝细胞在生物型人工肝系统中的生存状态研究 周霖1， 薛毅珑2， 楼敏1， 田磊2， 李雁凌2， 张佐云2， 杨永平1（ 1 解放军 302 医院感染内科， 北京 100039；2解放军 总医院老年医学研究所细胞生物学研究室， 北京 100853） 提要：目的研究冷冻复温后猪肝细胞在生物型人工肝支持系统 （BALSS） 中的生存状态。方法用酶法从中国实 验用小型猪肝脏分离出猪肝细胞； 将 1 1010猪肝细胞冷冻保存在 - 196 液氮中； 1 个月后复温， 将等量的冷冻和新鲜猪 肝细胞分别培养在 BALSS 中， 比
2、较其形态、 存活率和白蛋白、 尿素、 葡萄糖合成功能及对利多卡因的转化功能。结果冷 冻保存的猪肝细胞， 复温后其存活率较高； 在培养于 BALSS 时其生化功能、 利多卡因转化功能及超微结构与新鲜肝细胞类 似。结论用该冻存方法保存的猪肝细胞可试用于 BALSS 系统。 关键词：猪肝细胞； 低温保存； 生物型人工肝 中图法分类号：R318.14；R322.47；R329.28文献标识码：A Living states of cryopreserved porcine hepatocytes in biological artificial liver support system ZHOU Li
3、n1，XUE Yi-long2，LOU Min1，TIAN Lei2，LI Yan-ling2，ZHANG Zuo-yun2， YANG Yong-ping1（1Department of Infec- tious Diseases，No. 302 Hospital of PLA， Beijing 100039； 2Department of Cell Biology，Institute of Geraeology，The General Hospital of PLA，Bei- jing 100853，China） Abstract：ObjectiveTo study the living
4、states of cryopreserved porcine hepatocytes under the support of bio- logical artificial liver system. MethodsPorcine hepatocytes were isolated from Chinese experimental miniature swines by collagenase digestion and stored with aliquots of 1 1 010 cells at - 196 liquid nitrogen. After 1 month，the st
5、ored cells were resuscitated and cultured in bioartificial liver support system（BALSS） . Fresh hepato- cytes at same amount were served as control. The morphology，survival rate，and functions of synthesizing albumin， urea and glucose and transforming lidocaine were observed. ResuItsThe survival rate
6、of the frozen hepatocytes was high. There was no obvious difference of the two group in the cell function and microstructure. ConcIusionThe re- sults indicate that cryopreserved hepatocytes can be used in BALSS. Key words：porcine hepatocytes；cryopreservation；bioartificial liver 近10 年来， 生物型人工肝支持系统 （b
7、ioartificial liver support system， BALSS） 的研究方兴未艾 13 。国内外动 物及临床实验 47 表明它是治疗暴发型肝衰竭 （fulmi- nant hepatic failure，FHF） 及肝移植桥接的有效方法。储 备大规模的肝细胞以备 BALSS 治疗之需， 是 BALSS 技 术广泛应用的基础。我们通过对降温过程、 冷冻保护 液、 细胞密度和复温后洗脱条件的探索， 建立了自己的 大规模猪肝细胞的低温保存方法 8 。但尚不明确冷冻 复温后猪肝细胞是否能够在生物反应器中大规模培养。 作者简介： 周霖 （1974 - ） ， 男， 湖北省黄冈县人， 硕
8、士， 主治医师， 主要从事 生物型人工肝及肝细胞移植的基础与临床方面的研究。电话： （010） 6693342 收稿日期： 2004-04-08； 修回日期： 2004-10-15 本研究对培养于 TECA-型 BALSS 的新鲜猪肝细胞和 冷冻复温后猪肝细胞的功能、 形态及活率进行比较， 以 探讨冷冻猪肝细胞在 BALSS 中的生存状态。 1材料与方法 1.1材料 中国实验用小型猪 10 只， 体质量 6 8 kg， 雌雄不限， 由解 放军总医院实验动物中心提供； 冻存袋由美国 Baxter 公司提 供； WKL-97 型程控降温仪购自军事医学科学院仪器厂； Nuaire - 85 低温冰箱
9、； HW1 型电热恒温水浴箱； TECA-I 型 BALSS 系 统、 混合胶原酶、 营养液粉剂由香港德矩国际有限公司提供； DMSO 为北京石鹰化工厂产品； 牛血清白蛋白购自华美公司。 1.2方法 1.2.1肝细胞分离采用改良的胶原酶灌注法分离猪肝细 7421 第 27 卷第 12 期 2005 年 6 月 第三军医大学学报 ACTAACADEMIAEMEDICINAEMILITARISTERTIAE Vol. 27，No. 12 Jun. 2005 胞 （见另文阐述） 。 1.2.2实验分组实验分成两组：新鲜肝细胞组 （对照 组） ： 新鲜分离获得的猪肝细胞 0.8 1010个， 活率 8
10、0%以上； 冷冻肝细胞组 （实验组） ： 将 1 1010个新鲜肝细胞 （因考虑冷冻 复温洗涤后有 20%左右的肝细胞损失） 采用 4 / - 85 / - 196 的方法 8梯度降温， 最后入液氮罐 （ - 196 ） 中保存。 将在液氮中保存 1 个月的肝细胞取出，迅速浸入 39 水浴中 复温， 复温后肝细胞活率在 70%以上。 1.2.3BALSS 培养TECA-I 型 BALSS 由细胞环路、 血液环 路及中空纤维管式半透膜组成， 两个环路中的液体及中、 小分 子的物质通过中空纤维管的半透膜进行顺浓度差的交换。分 别将新鲜及冷冻复温后的猪肝细胞置于细胞环路 （生物反应 器） 中循环培养
11、 6 h； 在血液环路中串连 1 个三角烧瓶， 使 250 ml DMEM 细胞培养液在血液环路中循环流经中空纤维管。为测 定肝细胞的功能， 在 DMEM 细胞培养液中加入 0.2 mg/ml 的利 多卡因、 30 mg/L 的 NH4Cl 及 10 mmol/L 的果糖 9 。 1.2.4肝细胞活率测定各组分别于 BALSS 培养的 0、 2、 4、 6 h 时从细胞环路中取 1 ml 肝细胞液， 用台盼蓝 （typran blue） 拒 染法测定肝细胞的活率。 1.2.5肝细胞药物代谢功能及生化功能的测定各组分别 于培养的 0、 2、 4、 6 h 从血液环路取 100l 细胞培养液， 于
12、解放 军总医院医学仪器中心用高效液相层析法 10测定利多卡因的 浓度； 另取 500l 送解放军总医院生化科用全自动生化检测仪 测定白蛋白 （ALB） 、 尿素氮 （BUN） 、 葡萄糖 （GLU） 及乳酸脱氢酶 （LDH） 的浓度。 1.2.6肝细胞形态学的观察各组分别于培养的 0、 3、 6 h 从细胞环路中取 2 ml 肝细胞悬液， 125 g， 离心 10 min， 用 2.5%戊二醛固定， 送解放军总医院电镜室行 TEM 观察肝细胞 超微结构的变化； 另取 1 ml 细胞， 于倒置相差显微镜下观察其 显微结构。 1.3统计学处理 计量资料以-x s 表示， 实验数据用 Stata4.
13、0 软件进行双因 素重复设计资料的方差分析检验。 2结果 2.1存活率的变化 新鲜猪肝细胞在培养的前 4 h 活率变化不大 （P 0.05） ； 而 冷冻猪肝细胞在培养 4 h 的活率与 0 h 相比即有显著差异， 下 降了 13%， 见表 1。这表明冷冻猪肝细胞在 BALSS 中培养时死 亡较快， 提示在培养 4 h 时即应更换猪肝细胞， 以更好的发挥其 肝脏支持功能。 表 1 猪肝细胞存活率 （%，n = 10，-x s） Tab 1Survival rate of porcine hepatocytes （%，n = 10，-x s） Time （h） FreshCryopreserve
14、d 083.6 2.375.4 4.2 281.4 2.468.1 3.3 479.3 1.462.4 6.5 675.9 6.360 4.5 ：P 0.05） 。培养 0 h 时两组细胞的乳酸脱氢酶浓度无显著差异， 均 随着培养时间的延长而增加， 但新鲜肝细胞组的乳酸脱氢酶浓 度上升幅度较冷冻肝细胞组小， 在培养 4 h 后二者即有显著差 异 （P 0.05） 。在 BALSS 中培养 2 h 时， 二者都可将约 75%的利多卡因转化， 4 h 时可转化 90%、 6 h 时可转化 95%的利多卡因。 表 3 血液环路中利多卡因的浓度 （mmol/L， -x s） Tab 3Concentr
15、ation of lidocaine in blood circle（mmol/L，-x s） Time （h） FreshCryopreserved 00.20.2 20.046 0.0190.044 0.016 40.022 0.0080.023 0.008 60.010 0.0040.011 0.004 ：P 0.05） 。在培养的前 2 h， 二者均可以转化 75%的利多卡因， 培养 6 h 可代谢 95%的利多卡因， 表明冷冻肝细胞同样具有较强的肝 脏 P-450 酶活性。使用梯度降温法所保存的猪肝细胞 在 - 196 保存 30 d 后， 其细胞活率维持在较高水平 （75.4%）
16、， 仅较冷冻前下降 8.2%， 这一结果与 Watan- abe 等 11 相比毫不逊色。两组细胞在培养 0 h 时肝细 胞的超微结构均完整， 胞浆内有丰富的细胞器， 随着培 养时间的延长， 有部分细胞胞膜破裂， 细胞器溢出， 胞 浆内出现空泡， 但是存活的肝细胞细胞膜完整， 细胞器 形态与培养前无明显差异， 相邻细胞聚集成团， 微绒毛 完整。但是电镜及光镜结果均表明， 破裂的冷冻肝细 胞较新鲜肝细胞明显增多， 这有待进一步改进其培养 条件， 减少细胞破坏。结果表明， 本研究所建立的梯度 降温法及自行研制的冻存液、 洗脱方法可以较长期地 保存大规模的猪肝细胞， 复温后的肝细胞在 BALSS 中
17、 培养时其功能、 形态与新鲜猪肝细胞无显著差异。 参考文献： 1Watanabe F D，Shackleton C R，Cohen S M，et al. Treatment of ac- etaminophen-induced fulminant hepatic failure with a bioartificial liver J . Transplant Proc，1997，29 （1-2） ：487 - 488. 2赵世峰，薛毅珑，李新建，等. TECA-型生物人工肝支持系统治 疗急性肝衰竭犬的实验研究 J . 中国危重病急救医学，2001，13 （4） ：209 - 212. 3陈小
18、平，薛毅珑，李新建，等. TECA-型生物人工肝脏对少肝急 性肝衰犬的治疗效应 J . 世界华人消化杂志，2000，8 （特刊） ： 101B. 4薛毅珑，赵世峰，陈小平，等. TECA-组合型人工肝治疗 2 例急 性肝衰患者 J . 世界华人消化杂志，2000，8 （特刊） ：87C. 5Chen X P，Xue Y L，Li X J，et al. Experimental research on TECA- bioartificial liver support system to treat canines with acute liver failure J . World J Gas
19、troenterol ，2001，7 （5） ：706 - 709. 6陈小平，薛毅珑，黄志强，等. TECA 生物型人工肝支持系统替代 衰竭肝脏功能机制的实验研究 J . 解放军医学杂志，2000，25 （6） ：401 - 404. 7Detry O，Arkadopoulos N，Ting P，et al. Clinical use of a bioartificial liv- er in the treatment of acetaminophen-induced fulminant hepatic failure J . Am Surg，1999，65 （10） ：934 - 938
20、. 8周霖，薛毅珑，田磊，等. 大规模猪肝细胞低温保存方法的建 立 J . 解放军医学杂志，2003，28 （9） ：816 - 818. 9Kasai S，Mito M. Large-scale cryopreservation of isolated dog hepatocytes J . Cryobiology，1993，30 （1） ：1 - 11. 10王海峰，王然，唐晓东. 反相 HPLC 法同时测定普鲁卡因和利 多卡因含量 J . 药学实践杂志，1998，16 （6） ：355 - 357. 11Watanabe F D，Mullon C J，Hewitt W R，et al. Clinical experience with a bioartificial liver in the treatment of serere liver failure. A phase I clini- cal trial J . Ann Surg，1997，225 （5） ：484 - 491. （编辑王红） 9421第 12 期周霖， 等.冷冻猪肝细胞在生物型人工肝系统中的生存状态研究