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1、第2 9 卷第7 期 2 0 0 8 年7 月 纺织学报 J o u r n a lo fT e x t i l eR e s e a r c h V 0 1 2 9N o 7 J u l 2 0 0 8 文章编号：0 2 5 3 9 7 2 11 2 0 0 8 ) 0 7 0 0 1 7 0 4 再生蚕丝丝素蛋白纳米颗粒的制备及抗茵性 陈忠敏1 ，郝雪菲1 ，吴大洋2 ，饶佳家1 ，邵 飞1 ( 1 重庆工学院化学与生物工程学院，重庆4 0 0 0 5 0 ；2 西南大学纺织服装学院，重庆4 0 0 7 0 0 ) 摘要采用一种高效简便新工艺，用特定的溶剂将家蚕丝素蛋白溶解，透析浓缩后用a
2、 一糜蛋白酶酶解，制备了蚕 丝丝素蛋白纳米级颗粒，进行了4 种不同溶剂溶解的筛选性实验。结果表明：采用L i B r C H ，O H H ：0 溶剂溶解，透析 浓缩后用n 一糜蛋白酶酶解的整体工艺效果最优。对生成的纳米粒子尺寸用扫描电镜、场发射扫描电镜进行表征， 观察到4 种混合溶剂溶解得到的丝素蛋白肽颗粒大小在2 0 - 5 0t t m 之间；再用a 糜蛋白酶酶解后，丝素蛋白肽颗粒 的大小降解为8 0 3 0 0a m 。测定了丝蛋白肽粉末的抗菌性，其纳米级颗粒比微米级颗粒具有更优异的抗菌效果。 关键词丝素蛋白肽；纳米丝素肽颗粒；抗菌性能；纳米生物材料 中图分类号：T S1 4 1 9
3、2 1文献标识码：A P r e p a r a t i o no fs i l kf i b r o i np e p t i d en a n o - s c a l ep a r t i c l e s a n di t sa n t i b a c t e r i a la c t i v i t y C H E NZ h o n g m i n l ，H A OX u e f e i l ，W UD a y a n 9 2 ，R A OJ i a j i a l ，S H A OF e i l ( 1 C o l l e g eo fC h e m i s t r ya n dB 沁
4、n g i n e e r i n g ，C h o n g q i n gI n s t i t u t eo fT e c h n o l o g y ，C h o n g q i n g4 0 0 0 5 0 ，C h i n a ； 2 C o l l e g eo fT e x t i l ea n dG a r m e n t ，S o u t h w e s tU n i v e r s i t y ，C h o n g q i n g4 0 0 7 0 0 ，C h i n a ) A b s t r a c tN a n o s c a l ep a r t i c l e
5、so fs i l kf i b r o i np e p t i d e ( S F P ) w e r ep r e p a r e db yat h r e e - s t e pp r o c e s s ：d i s s o l v i n g s i l kf i b r o i nf i b e ri ns p e c i a ls o l v e n t s ，f o l l o w e db yd i a l y s i sa n dc o n c e n t r a t i o n ，a n df i n a l l ye n z y m o l y s i sw i t
6、ha c h y m o t r y p s i n S c r e e n i n gt e s tW a Sp e r f o r m e dw i t h4k i n d so fs o l v e n t sa n de x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tL i B r C H l O H H 20m i x e ds o l v e n ta c h i e v e dt h eb e s te f f e c t n es i z eo fS F Pp a r t i c l e sa p p e a r e d
7、a b o u t2 0 5 0t t m ， a n dt h a t o fS F Pn a n o s c a l e p a r t i c l e s w e r ea b o u t8 0 3 0 0a m S F Pn a n o s c a l ep a r t i c l e sr e v e a l e db e t t e r a n t i b a c t e r i a la c t i v i t yt h a nS F Pp a r t i c l e s K e yw o r d s f i b r o i np e p t i d e ；f i b r o i
8、 np e p t i d en a n o - s c a l ep a r t i c l e s ；a n t i b a c t e r i a la c t i v i t y ；n a n o b i o m a t e r i a l s 随着高分子技术的不断发展，其研究领域也不 断拓宽。生物大分子是目前高分子学科很活跃的一 个研究领域，其研究对象为糖类、蛋白质和核酸等。 作为生物大分子的蚕丝蛋白，是人类利用很早的天 然蛋白质之一，具有纯度高，来源广等优点，对其进 行研究及有效利用具有重要的意义。蚕丝中，丝素 蛋白占总质量的7 0 8 0 ，丝胶蛋白占2 0 一 3 0 。丝素蛋
9、白是一种纤维蛋白，其在生物整体、细 胞和分子生物学3 个水平的实验结果都表明丝素蛋 白安全可靠，具有与胶原蛋白相同的生物、细胞亲和 性，适合于开发生物功能材料。 近年来生物功能材料领域出现了纳米生物材料 的研究热点。纳米生物材料可以应用在组织工程、 再生医学材料以及生物相容界面材料等领域。其在 生物相容界面材料领域应用时，主要通过层层组装 技术，实现包括蛋白质、D N A 和聚电解质等在众多 基材上的组装，不仅实现了对天然生物材料的结构 模拟，而且可以获得表面层状生物材料，解决了材料 生物相容性的关键问题，可以应用在细胞生长支架、 药物缓释材料以及生物传感器材等领域o 。将性能 良好的丝素蛋白
10、制成纳米级颗粒，开发材料的应用 性能，已成为生物材料研究的一个热点。文献 3 将 收稿E t 期：2 0 0 7 0 8 2 7 修回日期：2 0 0 8 0 4 0 2 基金项目：重庆市教委科学技术项目( 2 0 0 5 C J 0 5 ) ；国家教育部留学回国人员科研启动基金资助项目( 2 0 0 6 C R 0 1 ) 作者简介：陈忠敏( 1 9 6 8 一) ，女，教授，博士。研究领域为功能高分子材料、纺织材料等。E - m a i l ：c h e n z h o n g m i n e q i t e d u c a 。 万方数据 PDF Watermark Remover DEM
11、O : Purchase from www.PDFWatermarkR to remove the watermark 1 8 纺织学报第2 9 卷 水溶性丝素溶液与能和水相溶的质子型有机溶剂或 极性非质子型有机溶剂混合，形成球形微粒分散在 有机溶剂体系中制得，纳米颗粒尺寸在3 5 1 2 5n m 之间；文献 4 运用生物纳米技术，将蚕丝蛋白质在 适当条件下发生自组装形成纳米微球制备，纳米颗 粒尺寸在8 0 。20 0 0n m 之间。这些制备方法都具有 将蚕丝蛋白纳米化，增大其应用范围的重要意义。 本文采用无机盐或有机无机混合溶剂将丝素蛋白溶 解，透析浓缩后再用蛋白酶进行酶解细化制备颗粒
12、均匀的纳米丝素蛋白颗粒，同时测试了此纳米材料 的抗菌性能。 1实验部分 1 1 材料 废弃茧壳由西南大学生物技术学院提供。 Z n C l 2 ，C a ( N 0 3 ) 2 ，L i B r ，C H 3 0 H ，N a S C N ，N a C l ，苦味 酸胭脂红溶液等均为市售，分析纯。透析袋进口分 装，标定截留分子量为1 40 0 0 。透析袋使用前，按照 使用说明在2 碳酸氢钠和1m m o l LE D T A ( p H 值为 8 0 ) 中煮沸1 0m i n ，并用蒸馏水洗净。廿糜蛋白酶、 抗菌实验用牛肉膏，蛋白胨等，均购自重庆市化学试 剂公司。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌由
13、重庆工学院 化学与生物工程学院免疫学实验室提供。 1 2 测试 F E G S E M ，F E I 公司生产，配备丹麦H K L 公司的 E B S D 系统和英国牛津仪器公司的N o v a4 0 0N a n oS E N 场发射扫描电子显微镜，用于纳米级蚕丝蛋白肽颗粒 形状尺寸的观察，测试在低真空模式下进行。J O E L J S M - 6 4 6 0 L V 型扫描电子显微镜( S E M ) ，日本电子生 产，用于微米级蚕丝蛋白肽颗粒形状尺寸的观察。 T U 1 9 0 1 型双光束紫外可见分光光度计，北京普析通 用仪器有限责任公司生产，用于测定蛋白质浓度。 1 3 实验方法 1
14、 3 1 丝素纤维的制备 使用索氏萃取仪，用乙醚将茧壳进行4 8h 循环 萃取，除去其中的蜡质物，用蒸馏水洗涤干燥后再用 乙醇煮沸1h ，除去碳水化合物及灰分，洗净后再在 纯水中煮沸以脱去丝胶。用苦味酸胭脂红溶液法检 验并确认丝胶已脱净后，将得到的纯净丝素用蒸馏 水洗涤干燥备用。 1 3 2 丝素蛋白粉末的制备 配制L i B r C H 3 0 H H 2 0 ( 物质的量比为1 ：2 ：1 ) 有机 无机混合溶剂，参考文献 5 6 的方法配制质量分数 为6 0 的Z n C l 2 和6 0 的N a S C N 溶液、C a ( N O ，) 2 C H 3 0 H H ：O ( 物质的
15、量比为l ：2 ：4 ) 混合溶剂。将 1 3 1 得到的纯净丝素纤维各取1g ，溶于上面配制的 各类溶剂中。经透析、浓缩，5 0 下真空干燥2 4h 。 1 3 3 再生丝素蛋白粉末酶解实验 将装有丝素蛋白水溶液的烧杯放在8 0 水浴 中加热5m i n ，然后用2 5 氨溶液调节p H 值至7 5 ， 按照丝素蛋白与a 糜蛋白酶质量比为1 0 ：1 的比例加 入小糜蛋白酶，在3 7 搅拌水解1 5h ，将溶液直接 放入一4 0 冻库中，使酶失活停止反应。经过滤、 5 0 真空干燥，得到酶解后丝素多肽粉末。 丝素蛋白质水溶液的浓度采用双光束紫外可见 分光光度计测定。即将丝素蛋白溶液稀释到一定
16、倍 数后，在2 8 0n m 条件下测定其O D 值，用式( 1 ) 计算 样品蛋白的质量浓度，m g m L 。 样品蛋白质量浓度= O D 值X 稀释倍数( 1 ) 经测定及定容，本实验所用丝素蛋白肽溶液质 量浓度均在2 。5m g m L 范围内。 1 3 4 抗菌实验 使用牛肉膏、蛋白胨、N a C l 、水来制作培养基。 琼脂粉经溶解灭菌后接种金黄色葡萄球菌，麦康凯 琼脂接种大肠杆菌。 将培养好的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌取出， 用涂布方式将2 种细菌分别接种到培养皿，将丝蛋 白肽粉末分别接种培养1 8h ，观察细菌生长情况，实 验均在无菌操作台上进行。 2 结果与讨论 2 1 溶解性
17、能 将1g 丝素纤维溶解在1 0 0m LL i B d C H ，O H H 2 0 的有机无机混合溶液中，在6 0 水浴，以2 0 0r m i n 的转速搅拌，观察到大约2 0m i n 后丝素可完全溶解， 溶解后的溶液呈黏性透明状。同量丝素在质量分数 为6 0 的Z n C l ：溶液和C a ( N 0 3 ) 2 C H ，O H H ：O 混合溶 液、质量分数为6 0 的N a S C N 溶液中以相同条件溶 解，观察到其在Z n C l ：溶液和N a S C N 溶液中大约用 了1h 就溶解完毕，溶液略呈黄色。而C a ( N O ，) ： c H 3 0 H u s O 溶
18、液显示出较差的溶解性，经过3h 丝素 也未能完全溶解。Z n C h 溶液溶解的丝素溶液在透 析时出现白膜，阻碍了Z n 2 + 、C l 一的透析，这可能是 z n 2 + 与丝蛋白形成了络合物，因此，L i B r C H ，O H H ：O 万方数据 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkR to remove the watermark 第7 期陈忠敏等：再生蚕丝丝素蛋白纳米颗粒的制备及抗菌性 1 9 混合溶液和浓厚N a S C N 溶液显示出对丝素纤维的 良好溶解性。 2 2 微米级丝素蛋白肽颗粒的形态
19、 图1 是在不同溶解条件下得到的丝蛋白肽的扫 描电镜照片。由图可知：L i B r C H ，O H I S 2 0 混合溶液 溶解的丝素蛋白肽呈线粒状，大小约为2 0 上m ，见 图1 ( a ) ；Z n C I ：、C a ( N O ，) ：C H ，O H H 2 0 混合溶液溶解 得到的丝素蛋白肽呈粒状，见图l ( b ) 、( d ) ；N a S C N 溶液溶解得到的丝素蛋白肽略呈线段状，见 图l ( C ) ，大小均在2 0 一5 0t t m 之间。这是由于在溶 解丝素时，不同的盐与丝素蛋白中的极性氨基酸残 基如酪氨酸作用强度不同，使得肽链断裂的地方有 所差别，呈现的链段
20、大小不同。同时，还观察到 L i B r C H ，O H H ，O 混合溶液溶解的线粒状丝素蛋白肽 颗粒大小差距相对较小，而N a S C N 溶液溶解得到的 线段状丝素蛋白肽规则度较低。因此，选择 L i B r C H ，O H H ，O 混合溶液溶解得到的丝素蛋白肽来 进行酶解实验。 图1 丝素蛋白肽S E M 照片 F i g 1 S E Mi m a g e so fS F Pp a r t i c l e s ，d i s s o l v i n gb y ( a ) L i B r C H 3 0 H H 2 0m i x e ds o l v e n t ，( b ) 6 0
21、 Z n C t 2s o l v e n t ， ( c ) 6 0 N a S C N ，( d ) C a ( N 0 3 ) 2 C H 3 0 H H 2 0m i x e ds o l v e n t 2 3 酶解后丝素蛋白肽颗粒的形态 图2 所示为L i B r C H ，O H H ：O 有机无机混合溶 液溶解丝素蛋白肽经a 糜蛋白酶酶解后得到丝素蛋 白肽片段的F E G S E M 照片。由图2 可见放大2 4 万 倍的S E M 照片丝素蛋白肽片段呈粒状；但放大1 0 万 倍的S E M 照片可以观察到其颗粒是由8 0 3 0 0n m 的纳米级小颗粒组成，即经过a 糜蛋白
22、酶处理后，丝 素蛋白肽片段达到了纳米级。 图2 纳米蛋白肽颗粒的F E G - S E M 照片 F i g 2F E G - S E Mi m a g e so fS F Pn a n o - s c a l ep a r t i c l e s 万方数据 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkR to remove the watermark 2 0 纺织学报第2 9 卷 对丝素蛋白氨基酸组成的研究已有较长历史， 到现在为止得到公认的丝素蛋白的分子量为3 万一 3 0 万( 由于取样方法、手段不同，结果相差极大
23、) ，其 氨基酸组成：甘氨酸约占4 4 、丙氨酸2 9 ，丝氨 酸1 2 ，酪氨酸5 ，其他约占1 0 1 7 1 。本文采用 L i B r C H ，O H H ，0 混合溶液溶解丝素蛋白，其机制为： 丝素蛋白是按照( G l y A l a G l y A l a G l y S e r ) 的顺序排 列，以B 折叠形式堆积而成的多片层结构。p 折叠 的形成是依靠不同肽链之间的氢键作用，而片层之 间则是依靠范德华力的作用。一般条件下丝素蛋白 纤维的肽链处于冻结状态，当浸入L i B r 、C H ，O H 、H 2 0 分子时，数量众多的强极性离子产生较强的水化作 用，使丝素蛋白分子表面
24、吸附大量的水，水是增塑 剂，显著加强了多肽链的运动，削弱了分子链间的范 德华力，从而使其逐步溶解，相当于将丝素蛋白无规 则切断。这个过程得到的蛋白质，采用S D S 一聚丙烯 酰胺凝胶电泳法测定得到丝素蛋白肽的分子量约为 2 6k D a 。对此片段用小糜蛋白酶进行酶解，由于a 糜蛋白酶主要对酪氨酸起到切断作用1 ，酪氨酸在 丝素蛋白大分子链段上的含量约为5 ，从而得到 大小均匀的丝素肽段。 2 4 丝素蛋白肽颗粒的抗菌性 表l 所示为丝素蛋白肽颗粒对金黄色葡萄球菌 和大肠杆菌的抗菌实验结果。表中所述的微米级丝 素颗粒为L i B r C H ，O H H ，0 混合溶液溶解制备的丝素 蛋白肽
25、，纳米级丝素颗粒经a 糜蛋白酶酶解后得到， 其用量均为0 0 5g 。对1 、24 、3 。培养皿中呈现的 抑菌圈的面积进行测定，结果如表1 所示。可以看 出，丝素蛋白肽对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌都有 一定的抗菌效果，而酶解后的纳米级丝素蛋白肽颗 粒的抑菌效果略强于酶解前微米级丝素蛋白肽颗 粒。丝蛋白具备抗菌性，可能是由于其具有微调节 周围环境的功能，从而抑制了细菌繁殖条件所致旧1 ， 颗粒越小，其微调节功能就越强。 表l 丝素蛋白肽颗粒抗菌性实验结果 T a b 1 A n t i b a c t e r i a la c t i v i t i e so fS F Pp a r t i c
26、 l e sa n dS F Pn a n o - s c a l ep a r t i c l e s 3结论 1 ) L i B r C H ，O H H 2 0 有机无机混合液显示了对 丝素纤维蛋白良好的溶解性能，在溶解过程中将丝 素蛋白切断成2 0 3 0k t m 大小的线粒状物质。 2 ) 采用特定溶剂溶解丝素蛋白，透析浓缩后用 a 一糜蛋白酶酶解的工艺可制备颗粒较均匀的纳米级 丝素蛋白肽颗粒。 3 ) 微米级和纳米级丝素蛋白肽颗粒均具有抗金 黄色葡萄球菌及大肠杆菌的效果，纳米级丝素蛋白 肽颗粒显示出更为优越的抗菌性，说明丝素蛋白肽 颗粒越小，抗菌效果越好。 参考文献： 1 】盛伟
27、华，谢字锋，缪竞诚，等蚕丝蛋白材料对鼠胚表 皮细胞毒性的实验研究 J 】苏州大学学报：医学版， 2 0 0 5 ，2 5 ( 4 ) ：5 5 1 5 5 4 2 沈家骢纳米生物医用材料 J 中国医学科学院学 报，2 0 0 6 ，2 8 ( 4 ) ：4 7 2 4 7 4 张雨青丝素纳米颗粒的制造方法：中国， 2 0 0 4 1 0 0 1 4 2 2 8 2 P 2 0 0 6 0 2 2 2 邵正中，曹正兵，陈新蚕丝蛋白纳米微球及其制备 方法：中国，2 0 0 4 1 0 0 1 6 8 5 6 4 P 2 0 0 5 一O l 一0 5 宗绪岩，王世富，李丽p H 及阳离子浓度对柞蚕
28、蛹蛋 白溶解性的研究 J 蚕业科学，2 0 0 5 ，3 1 ( 4 ) ：4 9 4 4 9 6 S u n gW o n H a ，S a m u e lM ，H u d s o n T h ed i s s o l u t i o n o f b o m b y xm o r is i l kf i b w i ni nt h ac a l c i u mn i t r a t et h t r a h y d r a t e - m e t h a n o ls y s t e ma n da s p e c t so fw e ts p i n n i n go ft h ef i
29、b w i n s o l u t i o n C S h i r a iH i r o f u s a 2 “I n t e r n a t i o n a lC o n f e r e n c e o nA d v a n c e dF i b e r T e x t i l eM a t e r i a l s2 0 0 2i nU e d a U e d a ： A d v a n c e dF i b e rC e n t e ro fS h i m h uU n i v e r s i t y ：2 0 0 2 ：3 3 4 4 志村宪助，片方阳太郎7 ，f7 口fy 力化学横 造
30、 M ，北条舒正，白井汪芳统绢丝力耩造日本： 信州大学出版，1 9 8 0 ：3 3 5 3 4 0 夏其昌，曾嵘蛋白质化学与蛋白质组学 M 北京： 科学出版社，2 0 0 4 ：3 1 3 3 杨明英，朱良均，闵思佳丝绸服饰对人体保健功能 的研究概况 J 纺织学报，2 0 0 0 ，2 1 ( 4 ) ：6 5 6 6 1j 1 J 1 J 1 J 1 J 3 4 5 6 7 8 9 r L r L r L r L r L r L r L 万方数据 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkR to remove the watermark