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1、 1 2 6C h i n J N o s o c o mi o l Vo l . 1 6 N o . 2 2 0 0 6 论著 单克隆抗体标志乳胶凝集试验快速检测 金黄色葡萄球菌及其耐药性 王崇义 ， 俞晓春二 ， 徐晓z ( 1 . 浙江省宁海县第一医院， 浙江 宁海县 3 1 5 6 0 0 ; 2 . 浙江省医药高等专科学校，浙江 宁波 3 1 5 0 0 0 ) 摘要:目的探讨金黄色葡萄球菌( S AU) 的细菌学快速检测鉴定及其耐药性分析的试验方法。方法目标菌落 先经传统鉴别方法怀疑葡萄球菌， 采用 S li d e . MR S A D e t e c t i o n乳胶快速检测
2、 S A U菌株青霉素结合蛋白 2 . ( P B P 2 a ) , 确认耐甲氧西林金黄色葡萄球菌( MR S A ) ; 设立 S AU耐苯理西林筛选试脸对照， 两组不符合菌株经 P C R方法检测 Mc e A基因确认。结果4 5 6株葡萄球菌中S l id e . s t . p h . p l u s 乳胶凝集法阳性( 鉴定为 S AU) 1 3 5 株，1 3 5 株凝集法阳性菌中最后确认为S AU 1 2 7 株， 3 2 1株凝集法阴性菌最后确认为 S AU 1 l株， 乳胶凝集法鉴 定金黄色葡萄球菌灵敏度 9 2。 %， 特异性 9 7 . 5 % ; S l i d e .
3、 MR S A D e t e c t i o n 乳胶快速检测 1 3 8 株 S A的 P R P 2 a , 阳 性 5 2株，1 3 8 株 S AU经苯哇西林筛选试验及 P C R测定 mc e A基因， 确定 MR S A 5 7株， 乳胶凝集法快速检测 S A U的P B P 2 a 确定 MR S A, 灵敏度 9 1 . 2 %, 特异性 1 0 0 %,结论单克隆抗体乳胶凝集法快速检测 S AU及鉴定 MR S A, 具有较高灵敏度和特异性。 关钮词:金黄色葡萄球菌;耐甲氧西林金黄色葡萄球菌;m c e A基因;聚合酶链反应; 青霉素结合蛋白2 a ;单克 隆抗体; 乳胶凝
4、集法 中圈分类号: R 3 7 8文献标识码: A文童编号:1 0 0 5 - 4 5 2 9 ( 2 0 0 6 ) 0 2 - 0 1 2 6 - 0 3 R a p i d I d e n t i f i c a t i o n o f S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s a n d I t s R e s i s t a n c e A g a i n s t Me t i c i l l i n U s i n g S l i d e x - s t a p h Mo n o c l o n a l A n t i b o d y WA N
5、G C h o n g - y i , Y U Xia o - c h u n , X U X i a o ( Ni n h a i Fi r s t Ho s p i t a l , Ni n h a i , Z h e j i a n g 3 1 5 6 0 0 , Ch i n a ) Ab s t rac t ; O B J F C 1 1 V E T o d e v e l o p a r a p i d me t h o d f o r s imu l t a n e o u s l y i d e n t if y i n g S t a p h y l o c u c c u
6、s a u r e u s ( S A) a n d i t s r e s is t a n c e a g a in s t me t ic il l in . ME T HO D S T h e t a r g e t s t r a in s a u t h e n ic a t e d t o S t a p h y l o c o c c u s b y t r a d i t io n a l me t h o d s ( a p p e a r a n c e , Gr a m - s t a in , c a t a la s e ) f ir s t , t h e n u
7、 s in g S l id e x s t a p h . p l u s to a u t h e n t ic a t e S A; e s t a b l is h i n g t r a d it i o n a l me t h o d o r c o a g u la s e t e s t a n d AT B-I D 3 2 S TA P I I s y s t e m f o r v e r i f ic a t io n . Th e p e n i c i l li n - b i n d i n g p r o t e i n 2 a ( P B P 2 a ) w
8、a s e x a min e d b y S l i d e x MR S A D e t e c t i o n , e s t a b li s h in g r e s i s t a n c e o x a c i l li n s i e v i n g t e s t a n d me c A g e n e wa s e x a mi n e d b y P C R f o r v e r if i c a t io n . R E S U L T S T h e 1 3 5 s tr a in s w e r e p o s i t i v e a n d 3 2 1 s t
9、 r a i n s we r e n e g a t i v e f o r S l id e x s t a p h . p lu s f r o m 4 5 6 s t r a in s . T h e 1 2 7 S . a u r e u s s t r a i n s a n d e ig h t o t h e r s we r e c o n f i r me d f r o m 1 3 5 p o s it iv e s t r a in s f i n a l l y , 1 1 S A s t r a in s a n d 3 1 0 o t h e r s t r a
10、i n s we r e c o n f ir m e d f r o m 3 2 1 n e g a t iv e s t r a i n s , t h e r e w e r e 9 2 . 0 % f o r s e n s it iv it y a n d 9 7 . 5 % f o r s p e c i f ic it y in t h i s me t h o d . T h e 5 2 s t r a i n s P B P 2 a p o s it i v e l y c o n fi r me d t o me t ic i ll i n - r e s i s ta n
11、 t S . a a r e u s ( MRS A ) u s i n g S l i d e x MR S A D e t e c t io n a n d 5 7 MR S A s t r a i n s w e r e c o n fi r m e d u s in g r e s i s t a n c e o x a c i ll i n s i e v in g t e s t o r P C R f r o m 1 3 8 s t r a in s . Th e r e w e r e 9 1 . 2 % f o r s e n s i t iv i t y a n d 1 0
12、 0 % f o r s p e c i f i t y i n t h i s me t h o d . C ON C L U S I ON S T h e d u p le x S li d e x - s t a p h mo n o c l o n a l a n t ib o d y e x a min a t e d t o S A a n d c o n f ir me d t o MR S A h a s h i g h e r s e n s it i v i t y a n d s p e c if i c i t y , K e y w o r d s ; S tap h
13、 y l o c o c c u s -u s ; Me t ic i ll i n - r e s i s t a n t S ta p h y l o c o c c u s a u r e u s ; m c e A g e n e ; P o l y me r a s e c h a in r e a c t i o n ; P e n i c i l li n - b in d in g p r o t e in 2 a ; Mo n o c l o n a l a n t i b o d y ; S l i d e x s o l id if y t e s t 金黄色葡萄球菌是最
14、常见的感染病原菌， 随着 MR S A感染 比例及 耐药性不断升 高， 快速 诊断 收稿日期: 2 0 0 5 - 0 6 - 3 0 i 修回日期: 2 0 0 5 - 0 8 - 1 1 M R S A 感染， 及时合理选择抗生素， 成为临床探索的 课题之一。笔者对我院临床分离的 4 5 6株葡萄球 菌， 用抗 S A U 特殊抗原的单克隆抗体和抗 P B P 2 a 的单克隆抗体进行快速检测鉴定， 其结果报道如下。 中华医院感染学杂志 2 0 0 6 年第 1 6卷第 2期 资料与方法 琼脂 糖凝胶电泳， 6 0 -8 0 V电压1 5 - 3 0 m i n , 滇化乙 锭显色， 紫外
15、成像系统观察结果。 1 . 1 菌株未源 2 0 0 4 年1 -1 2 月我院 住院及门 诊 患者临床送检的标本， 培养所得 目标菌落先经传统 方法( 形态、 革兰染色、 触酶试验) 怀疑葡 萄球 菌 4 5 6株 。 1 . 2 菌株鉴定设金黄色葡萄球菌A T C C2 5 9 2 3 为 阳 性对照， 本试验自 备的表皮葡萄 球菌为阴性对照。 1 . 2 . 1 S l i d e x s t a p h . p l u s 乳胶凝集法 挑取目 标 菌株， 用 S l i d e x s t a p h . p l u s乳胶试剂 ( 购 自法 国 B i o-Me r i e u x公
16、司) 进行凝集试验， 操作与结果判断 严格按说明。 1 . 2 . 2 传统方法鉴定目标菌株参照 K l o o s w e 等 分类方法及法国 B i o - Me r i e u x 公 司 A T B - S t a p h系 统鉴定， 以玻片法或试管法分别测定其结合凝固酶 和游离凝固酶。 1 . 3 MR S A鉴定以金黄色葡萄球菌 A T L C 2 5 9 2 3 阴 性对照， 金黄色葡萄球菌A T C C 4 3 3 0 0 为阳性质控菌株。 1 . 3 . 1 P B P 2 a 测定 采用单克隆抗体乳胶凝集方 法 ， S l i d e x MR S A D e t e c
17、t i o n 乳胶凝集试验的操作及 结果判断严格按说明书进行。 1 . 3 . 2 耐苯噢西林( O X A ) 筛选试验试验操作及 结果判断均按( N C C L S ) M 1 0 0 - S 1 3 规则 ， 进行， 目 标菌株制成 0 . 5 Mc F a r l a n d浓度， 点种在含 N a C l ( 4 Y . w / v ) ， 苯哇西林( 6 p g / m l ) MH琼脂上， 3 5 C 2 4 h观察结果。 1 . 4 Mc e A基因测定P C R法， m c e A基因寡合昔 酸引物参照 Ho o k e y 等报道的序列， 其序列为: Mc e A : 5
18、 T 0 00 TA TC G T G TC A C A AT C G3 Mc e A2 : 5 C T G GA AC T T G T T( U A C T CA G AG 3 扩增片段大小为 3 1 0 b p ， 引物委托上海生物工程公 司合成， 扩增方法如下: 模板D N A制备: 挑取菌落， 加人2 0 0 川灭菌离 子水， 1 0 0 , C煮沸 1 0 - 1 5 m i n ， 以 1 5 O O O r / mi n离心 1 - mi n ， 吸上清液作为 P C R扩增模板。P C R扩 增: 扩增总体积为 3 0 户。首先配制1 0 X P C R反应 液 : 1 0 X
19、 P C R缓 冲液( 0 . I m o l / L t r isH C I p H 8 . 3 , 0 . 5 m o l/ L K C I , 0 . 0 2 5 m o 1/ L M g C l ? ， 0 . 1 5 p m o l / L , 。 1 % B S A ) , d N T P 0 . 7 p m o l / L , m c e A引物各为1 - 3 p m o l / L 。向反 应管内加人I O X P C R反应液 3 浏， T a q D N A聚合酶( B i o m e d i c a l 公司) 2 1 l ， 模板 D N A 2 1 d ， 灭 菌离
20、子水补足3 0 p 1 ， 置D N A热循环仪 上 9 4 预变性 3 m i n ， 然后进人P C R循环 9 4 0C2 5 s , 5 6 C 2 5 s , 7 2 0C 2 5 s共 3 5循环， 最后 一个循环延伸 后， 再于7 2 0 C 延伸5 m i n ， 取1 2 禅扩增产物于1 . 5 % 结果 2 . 1 乳胶凝集法阳性4 5 6株葡萄球菌 S l i d e x s t a p h . p l u s 乳胶凝集法阳性( 鉴定为 S A M 1 3 5 株， 1 3 5 株凝集法阳性菌中经经典方法、 凝固酶试验和 A T B - I D 3 2 S T A P H
21、鉴定系统验证， 最后确认为 S AU 1 2 7 株， 其他葡萄球菌 5 株和浅绿气球菌3 株， 3 2 1 株凝集法阴性菌最后确认为 S A U 1 1株， 凝集 法阴性 1 1 株细菌经传代后， 凝集反应恢复阳性结果 9 株。乳胶凝集法鉴定 S A U灵敏度 9 2 . 0 ， 特异 性 9 7 . 5 0 0 , 阳性预测值 。 . 9 4 , 阴性预测值 。 . 9 6 , 鉴 定结果见表 t o 衰 1 4 5 6株葡萄球菌乳胶凝集法鉴定结果 病 原 荫 乳 胶 凝 集 法 S AU ( 十 )其他 ( 一) 合计 135315-榻 3 1032 1 2 . 2乳胶 快速检 浏 P
22、BP 2 a 1 3 8株 S A 经 S l i d e x MR S A D e t e c t i o n乳 胶快 速 检 测 P B P 2 a ， 确 认 MR S A 5 2 株; 1 3 8 株 S AU经苯哇西林筛选试验及 P C R方法检测mc e A基因， 认定 MR S A 5 7株， 5 2株 P B P 2 a阳性全部为耐苯哇西林菌株， P B P 2 a阴性耐 苯哇西林 1 4株， 经 P C R方法检测 mc e A基因， 5株 确认为 MR S A, 9 株为甲氧西林敏感金黄色葡萄球 菌( MS S A ) 。乳 胶凝 集 法鉴定 MR S A灵 敏度 9 1
23、. 2 写， 特异性 1 0 0 0 a , 阳 性预测值为1 , 阴 性预测值 。 . 9 4 , 检测结果见表 2 , 裹2 1 3 8株S A U乳胶凝集法检测P B P 2 a 结果 病 原菌 PB P 2 a 合 计 h 7 RS A +一 5 2 5 M S S A U 8 1 8 1 合计5 2 8 6 1 3 8 3讨论 金黄色葡萄球菌为临床最常见的感染病原菌， 因 其产生多种侵袭性酶和毒素， 常引起严重的疾病。近 年来， 有关S A U感染， 特别是M R S 的 多重耐药， 给临 床 抗感染治疗带来了 挑战。因此， 探索快速准确的 S A U分离、 鉴定及耐药性检测方法，
24、已成为全球性的 课题 。 应用单克隆抗体标志的乳胶凝集试验快速检测 C h in J N a s o c o mi o l Vo l. 1 6 No . 2 2 0 0 6 S AU的技术， 国外研究开始较早， 经改正发展， 最近 开发出的 S li d e x s t a p h , p l u s 乳胶试剂， 不仅检测 S A U凝集因子和蛋白A， 还包括检测 S A U的特殊表 面抗原， 保证了试验的灵敏度。经典的金黄色葡萄球 菌鉴定方法， 需要菌株分纯、 增菌， 再行多种操作鉴 定， 耗时长， 操作复杂。乳胶凝集试验利用S l id e x s t a p h . p l u s 乳胶
25、试剂中单克隆抗体同时测定 S A IL的 凝集因子、 蛋白 A和其周边英膜上的特异抗原。我 们的结果显示， 该方法灵敏( s e - 9 2 . 0 %) 、 准确 ( s p =9 7 . 5 0 o ) 、 同陈丽萍等川报道一致。 MR S 的主要耐药机制是由染色体介导产生特异 低亲和力的青霉素结合蛋 白 P B P 2 a , mc e A基因是 P B P 2 a 的编码基因， 用 P C R法直接检测 m c e A基因， 特异性高， 但需要较好的实验室条件， 且不适宜个别 检测 3 . 51 。 近几年来， 国外研究利用 P B P 2 a 单克隆抗 体标志技术的乳胶凝集快速检测
26、S A U的 P B P 2 a ， 取 得了较大进展。本试验中我们应用S l i d e x MR S A D e t e c t i o n乳胶 快速检 测 S A U 菌株 P B P 2 a ， 确 认 MR S A ， 结果显示: 方法灵敏( s e = 9 1 . 2 %) 、 准确 ( s p =1 0 0 0 、 快速、 简易， 适合临床快速诊断MR S A 感染， 为合理选择抗生素， 提供了可靠依据。 应用单克隆抗体标志的乳胶凝集试验快速鉴定 金黄色葡萄球菌方法， 不适用于 L型葡萄球菌检测， 可能是由于葡萄球菌 L型细胞壁缺损， 抗原性较弱， 易引起假阴性结果; 多数气球菌
27、菌株有 S A L T 相同的 菌体抗原， 采用S l i d e x s t a p h . p l u s 乳胶容易发生交叉 凝集， 引起假阳性结果， 这在国内外报道中都未提出， 谨请注意。 参考 文献 : 1 2 1 3 1 厂 4 1 N C C L S . P e rf o r m a n c e s t a n d a r d s fo r a n t m ic mh ia l d i s k s u s c e p - t ih il it y t s e t S . T h irt e e n t h i n f o r m a ti o n a l s u p p le me
28、 n t . M 1 0 0 - S 1 3 . NC CL S . 2 0 0 3 . 陈丽 萍 ， 雷依娜 ， 何琦网 ， 等 . 乳 胶凝集 与旋 固酶试验 检测金 黄 色葡萄球菌对比研究U7 _ 中华检验医学杂志 2 0 0 2 , 2 5 ( 5 ) 3 05 阳志强 ， 郭兆彪 ， 宋 亚军 ， 等. 用双 重聚 合酶链 快速鉴别 葡萄 球 菌及其耐甲氧西林性 J 中华医院感染学杂志, 2 0 0 3 , 1 3 (10 ) : 9 1 6 - 9 1 8 . 孙宏莉 ， 王辉 ， 陈 民钧. 耐甲氧 西林 的金 黄 色葡 萄球 菌耐 药性 及分子流行病学调查C J . 中华微生物
29、学和免疫学杂志, 2 0 0 5 , 2 5 ( 2 ) : 1 3 7 - 1 4 1 . 肝移植科 医务人员血液性传播疾病的预防措施 曹力，纪慧茄，高进，焦向红，李严 ( 武警总医院， 北京 1 0 0 0 3 9 ) 关挂词: 肝移植科;医务人员;血液性传播疾病; 预防措施 中圈分类号: R1 9 7 . 3 2文献标识码: B文章编号:1 0 0 5 - 4 5 2 9 ( 2 0 0 6 ) 0 2 - 0 1 2 8 - 0 1 肝移植住院患者多数有乙型肝炎史， 均带有不同程度的 传染性。因此， 加强肝移植科医务人员的自我防护意识和措 施尤为重要。 1 提高自身防护管理措施 1 .
30、 1 强化护理人员防护意识由于肝移植患者带有传染 性， 要求护土在接触患者时必须按照规定执行操作， 以增加 自我保护意识确保工作顺利进行， 加强自身防护。 1 . 2 有效的洗手、 戴手套在接触患者前后用快速手消毒 液消毒。护士在接触患者血液、 体液时应戴手套。在处理血 液污染的物品及更换引流袋、 尿袋, T管时必须戴手套操作 脱手套后立即彻底洗手， 手套破损时必须立即更换， 有高度 污染可能者戴双层手套 1 . 3 污染物品的处理凡接触患者血液、 体液的物品， 应放 进医用黄色垃圾袋结扎后， 放在指定地点集中进行焚烧处 理。对 HI V感染者和AIDS 有高度可能污染者的标本， 要注 意盖紧
31、盖再送检验科， 标本一定要有明显标记。 1 . 4 预防接种对乙型肝炎表面抗原阴性的所有医务人员 接种乙型肝炎疫苗， 注射后半年均应抽血监测是否产生抗 体。护理人员应每年检查乙型肝炎表面抗原。 2 锐器伤处理 2 . 1 锐器伤的预防避免将使用过的带血或不带血针头套 回针帽， 防止刺伤自己的手; 抽血时要求戴手套操作 要用带 盖的试管; 针头使用过要及时放人耐刺的锐器盒中并毁形处 理， 不要将针头丢在一般垃圾袋内， 以免刺伤保洁员 2 . 2 锐器伤后应急处理刺伤后立即用力挤出伤 口的血 液， 再用碘酒、 乙醇消毒受伤部位.如 对 H工V状态不明者， 须给患者进行 H工 V检查， 同时刺伤人员也须查 HI V即基线 试验， 用来证实是否为职业性感染。一旦被锐利器械割扎 伤， 立即在2 4 h 及 1 个月各肌内注射乙型肝炎免疫球蛋白 1 支， 同时皮下注射乙型肝炎疫苗 to g g ， 于I 个月以后再次皮 下注射乙型肝炎疫苗 5 u g ， 并进行迫踪检查。 收 藕 日期 : 2 0 0 5 - 0 9 - 1 2