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1、原代培养小鼠心肌细胞的观察与鉴定 葛建军1， 周正春1， 汪学龙2 （安徽医科大学 1. 第一附属医院心血管外科； 2. 病原生物学教研室， 安徽 合肥 230022） Observation and identification of primarily cul- tured neonate mice cardiomyocytes GE Jian-jun，ZHOU Zheng-chun， WANG Xue-long （Dept of Cardiovascular Surgery， 1 st Affiliated Hospital of Anhui Medical University， He
2、fei 230022， China） 中国图书分类号： R-332； R 322. 11； R 329. 21； R 329. 24 文献标识码： A 文章编号： 1001 -1978 （2005） 11 -1402 -02 关键词： 小鼠心肌细胞； 细胞培养；免疫化学 Key words： neonate mice cardiomyocytes；cell culture；immu- nochemistry 心肌细胞体外培养可以用来作细胞移植和基因治疗的 载体， 应用于治疗冠心病和心肌细胞凋亡等的实验研究 中 1。我们选用昆明鼠乳鼠的心脏做原代细胞培养， 对培养 的心肌细胞进行了观察和免疫组化
3、鉴定。 1 材料与方法 1.1 实验动物、 培养液及试剂 出生 d1 的乳鼠 18 只 （安徽 医科大学实验动物中心） ， 含体积分数为 10% 胎牛血清 （四 季青公司） 的 IMDM （Invitrogen 公司） ， 2. 5 gL -1胰蛋白酶 （ Gibco 公司） ， 5-2-脱氧尿苷 （ Brdu， Sigma 公司） 。 1. 2 心肌细胞的分离和培养 取出生 d1 的乳鼠， 无菌条件 下取出心脏， 用 PBS 液清洗 3 次， 剪碎成糜状。2. 5 gL -1 胰蛋白酶消化， 37， 45 min。1000 rmin -1离心 10 min， 弃 上清液， 共 3 次。用 I
4、MDM 培养液培养。2 h 后将培养液移 入另一培养瓶内， 加入 0. 1 mmolL -1 Brdu 继续培养， 24 h 后换液。 Fig 1 Cultured for 8 days mice myocardial cells Fig 2 Mice myocardial cells identificed by immunohistochemistry Fig 3 Negative contrast：Mice myocardial cells cytoplasm were not stained by immunohistochemistry 1. 3 细胞活力、 纯度及鉴定 用 0. 5
5、 gL -1胰酶消化制成 单细胞悬液， 台盼蓝染色计算细胞存活率。细胞的， 纯度及 鉴定用抗肌球蛋白重链的单克隆抗体的免疫组织化学方法 进行， SABC 法。对照组一抗用 PBS 代替。 2 结果 2. 1 心肌细胞的观察 酶消化后的细胞呈圆形， 悬浮。4h 后开始逐渐贴壁， 初为圆形， 后为梭形， 12 h 后可见细胞陆续 收稿日期： 2005 -04 -13， 修回日期： 2005 -06 -11 基金项目：安徽省自然科学基金资助项目 （No 03043707） 作者简介：葛建军 （1967 - ）男， 博士， 副教授， 副主任医师， 硕士生 导师， 研究方向： 冠心病的外科治疗， 通讯作
6、者， Tel： 0551-2922042，E-mail：gejanjun mail. hf. ah. cn 伸出伪足， 细胞团最先开始搏动， 随后， 可见单个细胞开始搏 动， 搏动频率各异， 多在 50 80/ min 次左右。24 h 大部分细 胞都伸出伪足， 形成不规则的星形。48 h 后见细胞通过伪足 细胞相互交织成网， 渐形成细胞簇， 同步搏动 （Fig 1） 。20 d 后渐趋老化。 2.2 台盼蓝染和免疫组化染色结果 培养 1 wk 时， 细胞存 活率为 96%； 2 wk 时， 为 92%； 20 d 时， 仅为 75%。心肌细 胞免疫组化呈强阳性 （Fig 2） ， 纯度达 9
7、5%； 对照呈阴性 （Fig 3） 。 3 讨论 小鼠心肌细胞原代培养需要注意以下几点： 取材时， 严格无菌操作。细胞分离时， 酶消化的时间、 温度、 酶的浓 2041中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Nov； 21 （11） ： 1402 33 甲状腺素引起大鼠胰岛 细胞功能改变的机制研究 韩慧蓉1， 王冬梅2， 康 白1， 段 鹏1， 张广学1 （1. 潍坊医学院应用药理学实验室， 山东 潍坊 261042； 2. 山东省泰安卫生学校药理学教研室， 山东 泰安 271000） Investigation on the mechani
8、sm of function change of pancreatic islets cells on rats induced by thy- roxin HAN Hui-rong1，WANG Dong-mei2，KANG Bai1， DUAN Peng1，ZHANG Guang-xue1 （1. Applied Pharmacology Laboratory，Weifang Medical College， Weifang 261042， China； 2. Dept of Pharmacology，Taian Pub- lic Health School，Taian 271000， Ch
9、ina） 中国 图 书 分 类 号： R-332； R 329. 25； R 335. 6； R 347. 2； R 347. 8； R 392. 12 文献标识码： A 文章编号： 1001 -1978 （2005） 11 -1403 -02 关键词： 甲状腺素； 细胞； 细胞因子； 凋亡 Key words： thyroxin； cells；cytokine；apoptosis 研究发现， 甲状腺素 （thyroxin， T4） 水平过高可引起大鼠 糖耐量异常。在此病理过程中， 产生了胰岛素分泌水平的下 降而非胰岛素抵抗， 并且胰岛素水平的下降是因为胰岛素分 泌水平下降而并非胰岛素清除率升
10、高 1。临床资料报道， 部 分甲亢病人同时伴有糖耐量降低， 甚至出现糖尿病 （diabetes mellitus，DM） 2。但其机制的研究尚未见报道。本文初步 探讨了甲状腺素引起大鼠胰岛 细胞功能改变的机制。 1 材料与方法 1. 1 动物 SD 大鼠， $#各半， 体重 （200 20）g， 潍坊医 学院实验动物中心提供， 鲁动质字 200001003 号。 1. 2 试剂与仪器 左旋甲状腺素钠由德国 Merck KgaA， Darmstadt 公司生产， 批号： 2881050； TNF、IL-1 放免试剂购 自解放军总医院科技开发中心放免所， 批号： 20030626； 胰岛 收稿日期
11、： 2005 -05 -10， 修回日期： 2005 -07 -24 作者简介： 韩慧蓉 （1972 - ） ， 女， 硕士， 实验师， Tel： 0536-2602335， E- mail：hanhuirong1699 yahoo. com. cn； 康 白 （1954 - ） ， 女， 教授， 硕士生导师， 研究方向： 神经 内分泌药理 素试剂盒购自北京原子能医学科学院同位素研究所， 批号： 030527； 葡萄糖试剂盒购自中生北控生物科技股份有限公 司， 批号： 030308。多探头 计数器 （FT-630G 型， 核工部北 京核仪器厂生产） ， GENE GENIUS 数码凝胶成像仪
12、（英国 SYNGENE 公司生产） 。 1. 3 方法 1. 3. 1 甲状腺素对大鼠血清葡萄糖、 胰岛素、 IL-1 和 TNF 的影响 30 只 SD 大鼠， 随机分为 3 组： 对照组， 给予生理盐 水； 低剂量组， 给予 T40. 1 mgkg -1d-1； 高剂量给药组， 给予 T40. 6 mgkg -1d-1。各实验组连续给药 14 d， ig。 于末次给药后， 禁食18 h， 颈总动脉取血， 氧化酶法 3测定大 鼠血清葡萄糖含量， 放射免疫法 4测定大鼠血清胰岛素、 IL- 1 和 TNF 的含量。 1. 3. 2 大鼠胰岛总 DNA 琼脂糖凝胶电泳 按上述方法分 组给药后，
13、处死大鼠， 取胰腺， 提取总 DNA， 行琼脂糖凝胶电 泳 （50 V， 1 2 h） ， 并在数码成像分析系统下观察摄片。 1. 4 统计学分析 数据以-x s 表示， 采用 SPSS 10. 0 软件 进行统计分析， 行 t 检验。 2 结果 2. 1 甲状腺素对大鼠空腹血清葡萄糖、 胰岛素、 IL-1 和 TNF 的影响 T4高剂量组的血清胰岛素水平与对照组相比 明显降低 （P 0. 05） ， 血糖水平则升高 （P 0. 01） 。另外， T4 高剂量组血清 IL-1 水平高于对照组 （P 0. 01） 。见 Tab 1。 2. 2 大鼠胰岛总 DNA 琼脂糖凝胶电泳 T4高剂量组出现
14、 典型梯状条带， 而其他各实验组均出现单一条带， 说明 T4高 剂量组大鼠胰岛 细胞出现凋亡。见 Fig 1。 3 讨论 Heimberg 等 5研究表明在离体条件下核因子 kB （Nu- clear factor-kappa B， NF-kB） 的活化是胰岛 细胞凋亡的前 兆。IL-1、 TNF- 与相应受体结合后激活相关蛋白激酶， 活 化 IKK， 使 NF-kB 活化易位 6。入核后， NF-kB 与 iNOS 基因 启动子中的 kB 序列结合， 导致 iNOS 表达， 促进 NO 的合成 而导致胰岛 细胞凋亡。 度， 需要严格控制。培养最关键的问题是保证心肌细胞的 纯度， 尽量去除成纤
15、维细胞和内皮细胞等非心肌细胞。根据 心肌细胞贴壁速度较慢的特点， 采用差速黏附技术和加入 Brdu， 能明显提高心肌细胞的纯度 2。我们观察到胰酶消 化时间长， 会加快心肌细胞的老化。细胞存活率在 1 2 wk 左右最高， 细胞状态也最好， 搏动规则、 有力。 自律性 搏动是体外培养心肌的重要特征 3。结合免疫组化结果， 心 肌细胞纯度可达 95%。 参考文献： 1 Reida M，Oakley E，Ooi CH et al. Myocyte transplantation for myocardial repair：A few good cells can mend a broken heart J . Ann Thorac Surg， 2001， 71 （3） ： 1725 -7. 2 章 斌， 梅 举， 张宝仁 et al. 大鼠胎心细胞的分离培养技术 J . 实用医学杂志， 2003， 19 （3）： 235 -7. 3 薛庆善 主编. 体外培养的原理与技术 M . 北京：科学出版 社， 2001： 632. 3041中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Nov； 21 （11） ： 1403 4