六味地黄汤对实验性骨关节炎兔软骨细胞凋亡与增殖的体内实验.pdf

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1、第2 4 卷第7 期 2 0 06年 7月 中医药学刊 CHI NE S E AR CHI VE S OF T R ADI T I ON AL CHI NE SE ME DI CI NE . 2 4 N o . 7 2 0 0 6 六味地黄汤对实验性骨关节炎兔 软骨细胞凋亡与增殖的体内实验 舒谦， 曹亚飞， 卿茂盛， 陈小砖， 刘玲 ( 深圳市中医院， 广东深圳5 1 8 0 3 3 ) 摘要: 目的: 探讨六味地黄汤对实验性膝骨关节炎兔软骨细胞增殖、 凋亡的影响。方法: 加 只新西兰兔用 H u l t h 法造骨关节炎动物模型， 随机分成空白对照组、 实验组; 实 验组用六味地黄汤灌胃，

2、空白 对照组用生理盐水， 治疗第4 , 8 , 1 2 , 2 4 周后每组各取2 只动物， 用亚稍酸盐还原酶法测定关节滑液N O水平， 关节软骨组织H E染色， 光镜观察形态学变化、 电 镜观察软骨细胞内 结构变化及原位末端标记( T U N E L ) 法观察软骨细胞凋亡病理改变， 进行组织病理学评佑。结果: 空白对照组N O活性在不同时期均高于实验组( 8 周， 尸 0 . 0 5 ) 0 表2 关节软骨病理改变计分比较( X士 : ) 空白 对 照 组 ( n 二 1 0 ) 软 骨 细 胞 病 理 改 变 加重， 软骨失去原有的光泽， 呈灰黄色， 空白对照组表现更 为突出， 表面变得

3、粗糙， 并有裂纹、 糜烂及溃疡形成， 软骨触 之变软， 可见边缘有细小骨赘形成。治疗2 4 周: 实验组的 病理变化略有进展， 部分标本表面有裂纹形成及细小溃疡 形成， 少见骨赘存在; 空白对照组多数标本可见溃疡， 大小、 形态及深浅不一， 深者可达骨质， 软骨下骨板暴露。 3 . 2 光镜观察正常关节软骨4 层结构清晰可辨， 软骨细 胞排列整齐， 潮线完整。治疗4 周: 实验组软骨面有脆裂， 未 见到溃疡面， 软骨细胞稍减少， 排列尚整齐， 细胞成簇存在。 空白 对照组除上述病理改变外， 软骨面脆裂明显， 出现糜烂 和溃疡。治疗8 一 1 2 周: 实验组软骨面脆裂明显， 出现糜烂 或溃疡，

4、 偶见边缘骨赘形成， 软骨细胞数目 减少， 排列紊乱， 细胞成簇增加; 空白 对照组软骨面出现明显裂纹， 中等表层 缺损， 可见小骨赘和溃疡面或轻度软骨下骨暴露， 软骨细胞 中 度减少， 排列无规则， 细胞成簇明显。治疗2 4 周后: 实验 组软骨未见明显病理进展， 软骨细胞数目减少增加， 排列变 紊乱， 细胞成簇明显; 空白 对照组软骨广泛表层缺损， 骨赘和 溃疡面增加， 中度软骨下骨裸露， 软骨细胞广泛减少， 甚至未 见单个软骨细 胞存在， 只见明 显的细胞成簇。 3 . 3 软骨病理改变评分( 表2 ) 实验组的关节软骨病理 软 骨 深 层 病 理 变 化 病 理 变 化 总 积 分 细

5、 胞 成 簇 细 胞 缺 失 表 层缺 损 糜 烂 或 溃 疡 翩 袭 纹 囊 肿 骨 赘 软 骨 下 骨 暴 露 4 周 8 周 1 2 周 2 4 周 2 . 9 5 士 0 . 7 4 3 . 1 4 1 0 . 8 3 2 . 8 9 士 0 . 7 7 2 . 3 4 土 0 . 1 5 3 . 2 5 士 0 . 8 2 3 . 2 7 士 1 . 0 3 1 . 0 7 土 0 . 5 2 1 . 1 2 1 0 . 8 1 1 . 5 9 士 0 . 的 1 8 . 5 0 土 0 . 8 7 2 4 . 8 8 土 3 . 1 4 3 0 . 7 5 土 1 . 2 7 3

6、6 . 4 8 士 1 . 3 2 实 验 纽 ( n 二 1 0 ) 2 . 0 8 1 0 . 5 7 2 . 1 2 士 0 . 9 4 “ 1 . 4 8 1 0 . 4 6 “ 1 的1 0 . 5 7 “ 2 . 1 5 1 0 . 5 8 1 . 7 5 1 0 . 6 3 0 . 5 9 1 0 . 4 4 0 . 9 1 1 0 . 5 1 0 . 8 4 士 0 . 7 2 1 1 . 7 5 1 2 . 2 4 1 4 . 2 9 土 0 . 8 3 招 1 7 . 8 6 土 2 . 1 7 “ 1 8 . 4 3 土 2 . 5 4 “ 中医药 1 2 5 1 学刊

7、注: 与 空白 对 照组比 较: # P 0 . 0 5 ) 。与同期空白 对照组比较， 亦有显著性差异( 均P 0 . 0 5 ) ， 比4 周、 8 周、 1 2 周, 2 4 周的N O含量分别降低1 . 5 , 2 . 1 , 3 . 6 和5 . 7 倍( P 0 . 0 5 , 0 . 0 1 ) 。提示N O含量在O A 早、 中期关节液呈上升状态， 六味地黄汤能明显降低早、 中 中医药学刊 2 0 0 6 年第2 4 卷 期O A兔关节液中较高浓度的N O ， 从而减轻高浓度N O对 关节软骨造成的损伤。 表3 各组亚硝酸盐含量浓度变化( F L m o V L , 叉士 :

8、) 4 周8 周1 2 周2 4 周 实 验 组1 0 1 2 1 . 2 4 士 1 1 .5 3 1 0 5 . 8 3 士 13 . 17 7 2 . 1 5 1 12 . 1 1 “ * 5 4 . 2 3 土 1 0 . 0 8 “ * 空 白 对 照 组 1 0 1 6 3 . 1 0 土 1 2 . 盯 2 2 4 . 1 6 土 1 2 . 1 4 2 5 8 . 1 1 士 1 1 . 8 2 .2 8 3 . 1 7 土 1 0 . 1 2 二 注: 与空白 对照组比 较: # P 0 . 0 5 , # # P 0 . 0 1 ; 与本组4 w时比 较: * P 0 .

9、0 5 ， * P 0 . 0 1 。 3 . 5 T U N E L 凋亡细胞主要位于软骨浅层， 各层均有分 布。实验组和模型空白组之间的A I 比较有显着性差异( F 二1 4 . 4 3 , P 0 . 0 5 ) 。 3 . 6 相关因素的L o g i s t i 回归 分析 以N O含量作因变量， 以组别、 软骨细胞病理改变( 细胞成簇和细胞缺失) 、 软骨 表层病理改变( 表层缺损、 糜烂或溃疡和表面脆裂) 和软骨 深层病理改变( 裂纹、 囊肿、 骨赘和软骨下骨暴露) 等为自 变量， 进行L o g i s t i 多因素分类分析， 筛选O A的影响因素。 将不同组别、 不同软骨

10、病理改变赋值( 实验组 二 1 ， 空白对 照组二 2 ; 软骨细胞病理改变: 细胞成簇= 1 ， 细胞缺失 = 2 ; 软骨表层病理: 缺损= 1 ， 糜烂或溃疡二 2 ， 脆裂二 3 ; 软骨深 层病理: 裂纹二 1 ， 囊肿= 2 ， 骨赘= 3 ， 软骨下骨暴露= 4 ) ， 似 然比卡方检验结果P 0 . 0 1 ， 说明至少有一个自 变系数不 为0 ， 模型有意义。结果显示: 在。= 0 . 0 5 水平， 实验组与 空白 对照组比 较软 骨 细 胞 病 理、 软 骨 表层病理( 犷= 5 . 1 2 7 , P 二 0 . 0 2 4 矿= 4 . 2 3 1 , P 二 0 .

11、 0 3 7 ) 有统 计学意 义， 凋 亡细 胞 的数目 与O A的严重程度明显相关; 实验组与空白对照组 比 较N O 含 量 的 变 化 只 有 软 骨 表 层 病 理变 化( 犷= 5 . 1 0 8 , P = 0 . 0 2 4 ) 有统计学意义， O A关节液N O 水平与病情呈正相 关。 4 讨论 目 前， 虽然对骨、 关节生长发育和功能重建中的细胞凋 亡有了一定的认识， 但其相关基因及其调控机制尚不清楚。 骨关节炎的发病涉及软骨细胞和软骨基质两个方面， 极为 复杂， 相关的研究有待于进一步探讨。了解细胞凋亡相关 基因参与凋亡过程的机制， 找到相应的控制方法， 将对于我 们更好

12、地防治骨关节炎产生积极影响。本课题是在中医理 论的指导下和中医药治疗 O A研究的基础上， 运用细胞生 物学的方法， 探讨六味地黄汤对软骨细胞增殖及凋亡影响 的一项前瞻性研究工作。 O A属中医“ 痹证” 的范畴， 病机特点“ 本虚标实” ， 即肝 肾不足为本， 风寒湿痹为标。O A最主要的中医病因病理 是肝肾亏损， 补益肝肾中药在临床治疗中也发挥着较好的 治疗作用， 且在相关实验中亦证实了它对关节软骨及软骨 细胞的保护作用。那么， 传统经典补益肝肾方剂一六味地 黄汤也应该能够起到同样的作用， 即对关节软骨和软骨细 胞的保护作用， 且影响软骨细胞的凋亡程序可能是补益肝 肾方剂所起作用的细胞生物

13、学机理; 根据以“ 方” 推“ 理” 的 原则， 可以推导出 以 重要的中医治疗原则一补益肝肾。 这是本研究所提出的学术假说和要达到的目的。 研究表明: O A关节软骨的细胞凋亡主要途径之一 N O 诱导途径， 可能通过以下方式诱导O A的发生发展: 抑制 蛋白多糖合成 卜 激活基质金属蛋白 酶， 促进基质的降 解s t 抑 制 脯 氨酞 经化酶 影响 胶原质的 代谢9 t 协同 I L 一 1 提高软骨细胞合成环加氧酶一 2 的合成 “ 。 另外， N O还可以 抑制软骨细胞的增殖、 促进软骨细胞的凋亡， 使 滑膜肿胀痕血等， 受损的软骨细胞、 滑膜细胞进一步产生 N O ， 形成一个恶性循

14、环。 本研究中O A动物模型关节液中N O水平较高， 且随病 情程度的加重其含量升高。可能是由于炎症关节局部高浓 度细胞因子刺激软骨细胞， 诱导N O产生增加。关节内增 高的N O 又可加重软骨损伤， 抑制软骨细胞增值， 促使软骨 细胞凋亡， 抑制软骨细胞合成胶原和蛋白多糖， 加速软骨基 质的 降 解 s - u 。 笔者观察到空白 对照组中 关节软骨产生 了含量较高的N O ， 且有软骨细胞的凋亡， 细胞凋亡的数量 随N O 含量的 增高 而 增高， 与S a n s h i r o 等 10 报 道相似。 给 动物模型口服六味地黄汤后， 成功地降低了关节液中N O 的表达的同时， 实验组关

15、节软骨病理改变总积分和软骨表 层病理改变积分明显， 亦低于空白对照组， 有显著性差异。 此外， 实验组在软骨细胞病理变化方面( 细胞缺失及细胞 成簇) 积分与空白对照组比较也有统计学意义， 说明六味 地黄汤防治实验性兔膝骨关节炎疗效确切。推测六味地黄 汤可能通过N O诱导途径对关节软骨起保护作用， 从而达 到延缓膝骨关节炎的病理进程的作用， 其作用机制可能为 抑制N O的过量释放、 提高软骨修复组织的质量， 使其对软 骨的损害减少并使其它一些因子难以发挥协同作用。从而 改善软骨细胞生存的微环境， 延缓细胞退变进程。 尽管实验组各期病理积分低于空白对照组， 但随着时 间的推进， 各期之间的病理积

16、分也在向前发展， 说明六味地 黄汤能起到延缓膝骨关节炎的病理进程的作用， 而不能完 全阻止骨关节炎的发展。特别在深层病理改变( 囊肿、 骨 赘和软骨下骨暴露) 方面各组均不明显， 其作用机理有待 进一步研究。 参考文献: 川L o tz M . T h e ro l e o f n i t r i c o x i d e i n a r t i c u l a r c a rt il a g e d a m a g e J . O s t e o a r th r i t i s , 1 9 9 9 , 2 5 ( 2 ) : 2 6 9 一 2 8 2 2 P e l l e t i e r

17、 J P , J o v a n o v i c D , J u l i o C . R e d u c e d p ro g r e s s i o n o f e x - p e r i m e n t a l o s t e o a rt h r i t i s i n v iv o b y s e l e c t iv e i n h i b i t i o n o f i n d u c - i b l e n i t r ic o x i d e s y n t h a s e J 了 . A rt h r i t i s R h e u m , 1 9 9 8 , 4 1 ( 7

18、 ) : 1 2 7 5一1 2 8 6 3 B l a n c o F J , C u i t h n R , V a z q u e z M a rt u l E , e t a l . O s t e o a rt h r i t i s c h o n d r o c y t e s d i e b y a p o t a o s i s J . A rt h r i t i s R h e u m , 1 9 9 8 ， 4 1 : 2 8 4 4 曹春林. 中药药剂学【 M . 第5 版. 上海: 上海科学技术出版 社， 1 9 8 6 . 1 6 0 5 H u l t h A

19、, L i n d b e r g L , T e l h a g , e t a l . E x p e r i m e n t a l o s t e o a r th r i t i s i n r a b b i t s ; p re l i m i n a ry re p o rt J . A c t a O rt h o p S c a n d , 1 9 7 0 , 4 1 : 5 2 2一 5 3 0 6 C o l o m b o C , B u t l e r M, O B y m e E , e t a l . A n e w m o d e l o f o s - t

20、o o a n h n D s i n r a b b i t s 1 ; D e v e l o p m e n t o f k n e e J o i n t p a t h o l o g y f o l - l o w i n g l a t e r a l m e n i s c e c t o m y a n d s e c t i o n o f t h e f i b u l a r c o l l a t e r a l a n d s e s a m o i d l i g a m e l l t s J . A rt h r i t i s R h e u m , 1 9

21、 8 3 ， 2 6 ( 7 ) : 8 7 5一8 8 5 7 B l a n c o F J , C a l d o F , d e T o r o r c F J , e t a l . O s t e o a rt h r i t i s c h o n - d r o c y t e s d i e 场a p o p t o s i s a p o s s ib l e p a t h w a y f o r o s t e o a rt h r i t i s p a - t h o l o g y 仁 J . A rt h r i t i s R h e u m , 1 9 9

22、8 ， 4 1 ; 2 8 4 一 2 8 9 中医药 1 2 6 2 学刊 第2 4 卷第7 期 2 006年 7月 中医药学刊 CHI NE SE AR CHI VE S OF T R A DI T I ON A L CHI NE S E ME D I CI NE V o l . 2 4 N o . 7 J u l . 2006 关于张锡纯伤寒学术思想的整理与探讨 翁赛坤 ( 广州中医药大学第二临床医学院， 广东 广州 5 1 0 4 0 5 ) 摘要: 近代中西医汇通学派的代表人物， 著名医学家张锡纯是一位较早运用中西医医学理论来研究 伤寒 论) 的医家 之一。他注重临床实践， 理论联系

23、实际， 联系临床而验证经文; 并主张灵活变通经方， 提倡中西药配 合， 取长补短， 并结合实践体会， 另制新方以补仲景之未备。在 医学衷中参西录 中， 张锡纯对 伤寒论 的阐发 有许多独到的见解， 对后世学者启发极大。就 医学衷中参西录 一书， 对张锡纯的伤寒学术思想进行归纳与探 讨。 关键词: 伤寒论 ; 张锡纯;(医学衷中 参西录 中图分类号: R 2 4 9文献标识码: A文章编号: 1 0 0 9 - 5 2 7 6 ( 2 0 0 6 ) 0 7 一 1 2 6 3 - 0 3 近代河北盐山张锡纯先生， 不仅是一位著名的汇通中 西医的先驱者， 而且还是一位经方实践大师， 伤寒大家。他

24、 善用经方以屡起沉病， 并善于依据经方组成原则自 裁新方。 他虽无伤寒专著， 但在 医学衷中参西录 某些篇章中， 对 伤寒学说颇多发挥， 并有不少独到见解。遗憾的是， 迄今为 止， 尚无人对其伤寒学术思想进行系统的整理。笔者不揣 愚陋， 今就张氏 对伤寒方面的学术思想和成就， 探讨如下。 1 言简意赅 独具创见 1 . 1 对六经实质的探讨关于 伤寒论 六经实质的讨 论， 历来意见不一， 早已 形成争论的局面。张锡纯认为 伤 寒论 六经寓手经于足经之中， 并非只言足经。他在 六经 总论 篇中说: “ 伤寒治法以六经分篇， 然手足名有六经， 实 则十二经也。 手足之经既有十二， 而( 伤寒论 但

25、分为六经 者， 何也?按 内经) 之论十二经也， 凡言某经而不明言其 为手经， 足经者皆系足经， 至言手经则必明言其为手某经。 伤寒论 之以 六经分篇， 此遵 内 经 定例寓手经于足 经中也。彼解 伤寒论 者， 谓其所言之六经皆系足经， 是 犹未明仲景伤寒之深意也。 ” 张氏还认为经络与脏腑是密切相关的， 经络脏腑是六 经的基础。他说: “ 经者， 气血流通之处也。人之脏腑与某 经相通， 即为某经之府， 其流通之气血原由府发生， 而外感 之内侵遂多以府为归宿。 ” 由于经府相通， 张氏又从经之阴 阳表里相属相配详述了足三阴三阳与府， 手三阴三阳与府 之后， 得出伤寒治法以六经分篇， 然手足各有

26、六经， 实则十 二经也， 十二经者连带十二府也。张氏的这些认识与现代 医家所归纳的“ 脏腑经络说” 相似。近人刘渡舟皆强调伤 寒六经就是脏腑经络。 刘渡舟教授在( 伤寒十四讲 中说: ，(伤寒论 的六经， 是继承了 热论 的六经学说， 而有其脏 1 8 1 9 C a o M, E v a n s C H, S t e f a n o v i c 一R a c i c M, e t a l . N i t ri c o x i d e i c h b i ts t h e s y n t h e s i s o f t h e II c o ll a g e n w it h o u t a

27、l t e ri n g C o l2 A 1 m R N A a b u n d a n c e p r o l y l h y d r o o x y l a s e a s a p o s s i b l e t a r g e J . B i o c h e m J , 1 9 9 7 ， 3 2 4 ; 3 0 5 一 3 1 0 P e l l e t i e r J P , J o v a n o v i c D , J u l i o C . R e d u c e d p ro g r e s s i o n o f e x p e r - i m e n t a l o s

28、 t e o a rt h ri t i s i n v i ro b y s e l e c t i v e i n h i b i t i o n o f i n d u c i b l e n i t r i c o x i d e s y n t h a s e J . A r t h r i t i s R h e u m , 1 9 9 8 , 4 1 : 1 2 7 5一 1 2 8 6 1 0 S a n s h iro H a s h i m o t o , K e n g i T a k a h a s h i , D a v i d A i e l , e t a l .

29、 C h o n - d r o c y t e a p o t o s i s a n d n i t r i c o x i d e p r o d u c t io n d u ri n g e x p e ri m e n - t a l l y i n d u c e d o s t e o a rt h r i t i s J .A rt h r i t i s R h e u m , 1 9 9 8 ， 4 1 : 1 2 6 6一1 2 7 4 E ff e c t o f L iu w e i D ih u a n g D e c o c t io n o n t h e C

30、 h o n d r o c y t e A p o p t o s i s a n d P r o l if e r a t io n o f E x p e r i m e n t R a b b it O s t e o a r t h r it is 中医药 S h u Q i a n , C a o Y a f e i , Q i n g M a o S h e n g , C h e n X i a o z h u a n , L i u L i n g ( S h e n z h e n H o s p i t a l o f T C M , S h e n z h e n 5

31、1 8 0 0 7 , S h a n d o n g , C h i n a ) A b s t r a c t : O b j e c t iv e : T o i n v e s t i g a t e t h e e ff e c t o f L i u w e i D i h u a n g D e c o c t i o n o n t h e c h o n d r o c y t e a p o p t o s i s a n d p r o l i f e r a t i o n o f e x - p e ri m e n t r a b b i t o s t e o a

32、 rt h r i t i s . M e t h o d s : T w e n ty e x p e ri m e n t a l o s t e o a r th ri t i s N e w Z e a l a n d a d u l t r a b b i t s w h i c h e s t a b li s h e d b y H u l t h m e t h o d , w e re r a n d o m l y d i v i d e d i n t o 2 g r o u p s : b l a n k g ro u p i n t r a g a s t ri c

33、a d m i n i s t r a t i o n 场p h y s i o l o g ic s a li n e , e x p e ri m e n t a l g r o u p b y L i u w e i D i h u a n g D e c o c t i o n . A ft e r 4 , 8 ， 1 2 , 2 4 w e e k s , t h e N O c o n t e n t s o f s e r u m w e re e x a m i n e d b y n i tri c a c i d re d u c t a s e , t h e c h a

34、 n g e s o f m o r p h o l o g y o f a rt i c u l a r c a r ti l a g e w e re o b s e r v e d场 li g h t m ic r o s c o p y a n d t r a n s m i s s i o n e l e c t ro n m i c r o s c o p y a n d e x a m i n e d b y T U N E L f o r a p o p t o s i s . R e s u l t s : T h e N O a c t i v i ty o f b l a

35、 n k g r o u p i s h i g h e r t h a n t h e e x p e ri m e n t a l g r o u p i n a n y s t a g e ( P 0 . 0 1 ) A p - o p t o s i s c e ll i n d e x a n d c e ll p r o l if e r a t i o n i n d e x o f L i u w e i D i h u a n g D e c o c t i o n g r o u p h a d s i g n i f i c a n t d iff e r e n c a

36、 ( P 0 . 0 1 ) C o n c l u - s i o n ; L i u w e i D i h u a n g D e c o c t i o n g ro u p c o u l d d e c r e a s e t h e N O i n s e r u m o f e x p e r i m e n t a l o s t e o a r th r i t i s i n r a b b i t s , d e c re a s e t h e a p o p - t o s i s o f c h o n d r o c y t e s , i n c r e a

37、s e c h o n d r o c y t e s p r o l i f e r a t i o n , a n d m a y b e i t s t h e m e c h a n i s m o f a c t i o n . K e y w o r d s : o s t e o a rt h r i t i s ; L i u w e i D i h u a n g D e c o c t i o n ; a p o p t o s i s r a b b i t ; a n i m a l m o d e l ; i n v i v o 1 2 6 3 学刊 收稿日期: 2 0 0 6 - 0 1 - 2 0 基金项目: 广州中医药大学第二临床医学院第三届学生科研创新基金( 2 0 0 4 - 2 0 0 5 ) 作者简介: 翁蜜坤( 1 9 8 4 一 ) ， 男， 广东中山人， 研究方向: 中医基础与临床。