中药降乳散对大鼠催乳素瘤表达Pit-1的作用.pdf

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1、2 0 0 8 年1 2 月 第1 6 卷第6 期 中国实验动物学报December，2008 A C I AL B O R A T O R l U MA N I M A U SS C N T I AS I N I C AV 0 1 1 6N o 6 序o 8 $ 4 訇 l ；研究报告I j 曼斗；晕、! 茹- 吩e 矗h 鬯r 中药降乳散对大鼠催乳素瘤表达P i t 一1 的作用 张韶峰，邱文娟，徐春 ( 武警总医院，北京1 0 0 0 3 9 ) 【摘要1目的研究中药降乳散对大鼠催乳素( P R L ) 瘤组织表达P i t 1 的作用。方法用皮下植入雌激素的 方法制备大鼠P R L 瘤

2、模型。将成功诱发出P R L 瘤的大鼠随机分2 组，分别给予安慰剂和中药降乳散灌胃，用药4 周 后处死动物，垂体称重，用放免法测定血清P R L 水平。用反转录一P C R 方法分析P i t - 1 在大鼠P R L 瘤组织中的表达 量。结果降乳散组大鼠血清P R L 水平和垂体重量均明显低予安慰剂组( P 0 0 0 1 ) ，P i t - Im R N A 水平在降乳散组 较安慰剂组明显降低( P 0 0 0 1 ) 。结论降低P i t - 1 的表达水平可能是中药降乳散抗P R L 瘤的重要机制之一。 【关键词】雌激素；催乳索瘤；大鼠；P i t - I ；中药 【中图分类号】R

3、一3 3【文献标识码】A【文章编号】1 0 0 5 4 8 4 7 2 0 0 8 ) 0 6 0 4 5 5 0 3 E f f e c to ft h eC h i n e s eM e d i c i n e ，J i a n g r u s a n ，o nt h eE x p r e s s i o n o fP i t 一1i nR a tP r o l a c t i n o m a Z H A N GS h a n - f e n g ，Q I UW e n - j u a n ，X UC h u n ( 1 1 1 eG e n e r a lH o s p i t a lo

4、 fC M n e s eP e o p l e 8A r m e dP o l i c eF o r c e s ，B e i j i n g1 0 0 0 3 9 ，C h i n a ) 【A b s t r a c t 】O b j e c t i v e T os t u d yt h ee f f e c to ft h eC h i n e s em e d i c i n e ，J i a n g T t m a n ，O i lt h ee x p r e s s i o no fP i t - Ii nr a t p m l a c t i n o m a M e t h

5、o d s T oe s t a b l i s hp r o l a e t i n o m am o d e li nr a t s T h eP r o l a c t i n o m a - b e 8 r i l l gr a t aw e r ed i v i d e di n t o2g r o u p sa t r a n d o m J i a n g r u s a nW a So r a l l ya d m i n i s t e r e dt om t ai nt h eJ i a n g r u s a ng r o u p ，a n dw a t e rW a s

6、a d m i n i s t e r e dt or a t si nt h ep l a c e b o g r o u p A f t e r4w e e k so ft r e a t m e n t a l la n i m a l sw e r es a c r i f i c e da n dt h ep i t u i t a r yg l a n dW a St a k e no u ta n dw e i g h e d S e r u mp r o l a c t i n ( P B L ) l e v e l sw e 他m e a s u r e db yB I Am

7、 e t h o d P i t - 1m R N Al e v e l si np i t u i t a r yt i s s u ew e l em e 8 8 u r e db yR T - P C R R e s u l t sT h e w e i g h to fp i t u i t a r yg l a n da n dP R Ll e v e li nr a t ao fJ i a n g r u s a ng r o u pw e r es i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h o s ei nt h ep l a c e

8、b og r o u p ( P O 0 0 1 ，r e s p e c t i v e l y ) T h ee x p r e s s i o nl e v e lo fP i t - 1m R N Ai nr a t so fJ i a n 掣u 伽g r o u pW a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h a ti np l a c e b o g r o u p ( P 0 0 0 1 ) C o n c l u s i o nJ i a n g r u s a nh a sap o t e n t i a lp r e v

9、 e n t i v ee f f e c to ne s t r o g e n i n d u c e dr a tp r o l a c t i n o m a T h ed e c r e a s e o fP t - Im R N Al e v e lm a yb ei n v o l v e di nt h em e c h a n i s mo fa n t i p r o l a e t i n o m ae f f e c t o fJ i 岬s a n 【K e yw o r d s 】E s t r o g e n ；P r o l a e t i o m a ；B a

10、t ；P i t - I ；C M n e m e d i c i n e ，J i a n g r u s a n 转录因子是一类可以与D N A 上特异的调节元 件结合的蛋白质，它们在基因转录和细胞生长、分化 中起重要作用。雌激素受体( E R ) 和P i t 一1 是两种重 要的转录因子，对垂体催乳素( P R L ) 细胞的增生以 及P R L 基因的表达中起重要作用。雌激素( E ) 与垂 体P R L 细胞上的E R 结合，调节P R L 基因的表达，此 外，E 作用于下丘脑通过下丘脑神经递质多巴胺 ( D A ) 调节P R L 细胞的功能。雌激素的长期作用可 以使大鼠P R

11、L 细胞增生、P R L 分泌增多，最终形成 P R L 瘤。在雌激素诱发的大鼠P R L 瘤组织中P i t 。 基金项目】首都医学发展科研基金( 中医药类) ( 编号：2 0 0 1 2 1 ) ；武警总医院科研基金( 编号：w K H 2 0 0 5 0 r 7 0 ) 。 【作者简介】张韶峰，男，主治医师。 通讯作者】徐舂，女，从事垂体腺瘤发病机制的研究。 1 基因的表达增高，其表达量与雌激素作用的时间 成正相关，提示P i t 1 在雌激素诱发大鼠垂体P R L 细 胞分泌P R L 以及P R L 细胞的增生中起重要作用幢1 。 据文献报道，P i t 一1 基因在7 0 8 0

12、的人垂体腺瘤 中表达，其中主要在P R L 瘤中，表达量比正常垂体 组织高，提示P i t 一1 的异常或过度表达与人垂体P R L 瘤的发生发展有关”。3 。 以溴隐亭为代表的多巴胺受体激动剂是治疗垂 体P R L 腺瘤的经典药物，具有肯定的疗效，但是容 易复发。我国传统中医药对高P R L 血症的治疗取 得了满意的疗效，关于中药对垂体P R L 瘤的治疗， 目前仍处于研究阶段，动物实验结果显示：中药降 乳散明显抑制大鼠P R L 的分泌和P R L 细胞的增生， 作用效果与多巴胺受体激动剂相同，说明降乳散具 有抗P R L 瘤的作用J 。本研究以雌激素诱发的大 万方数据 4 5 6 中国实

13、验动物学报2 0 0 8 年1 2 月第1 6 卷第6 期A c t a 汕A n i mS c iS i n D e c e m b e r ，2 0 0 8 。V 0 1 1 6 ，N o 6 鼠P R L 瘤为研究对象，通过分析P i t 1 表达以及中药 对P i t 一1 表达的作用，探讨降乳散抗高P R L 血症以及 P R L 瘤的机制。 1 材料和方法 1 1 实验动物 雄性W i s t a r 大鼠由解放军总医院实验动物中心 提供。合格证号：G D l 4 9 2 2 9 4 。在控光鼠房中分笼 饲养，温度1 8 2 0 ，湿度4 3 ，食用标准饲料，饮 瓶装自来水。 1

14、2 主要试剂 乙烯雌酚( D E S ) ( 北京益民制药厂) ，大鼠P R L 抗原、标准品和一抗由美国N H P P 的D r P a r l o w 惠 赠。免疫组化试剂盒( 美国Z y m e d 公司产品) ，1 2 5 碘化钠( 英国A m e r s h a m 公司) 。R N A 提取试剂盒 ( P r o m e g a 公司) ，R T - P C R 试剂盒( P r o m e g a 公司) 。 1 3 方法 1 3 1 大鼠P R L 瘤模型的制备：成年雄性W i s e r 大鼠，分为两组，P R L 瘤组( n = 1 4 ) ，于其背部中线尾 骨上约3e m

15、 偏左处作一约l c m 长纵形切口，游离皮 下组织，将一含有乙烯雌酚2 0r r I g 的硅胶管( 长2 e m ，内径1 5l n n l ，外径2 4 1m i l l ) 植入皮下；对照组( n = 4 ) 皮下植入空白硅胶管。埋管8 周后，两组各处 死4 只动物，将P R L 瘤组剩余动物的硅胶管取出， 然后随机分2 组，安慰剂组( n = 5 ) ：给予自来水灌 胃，降乳散组( n = 5 ) ：用降乳散灌 1 5m g ；，( k g d ) ，指 干燥中药的重量 ，用药4 周后处死动物。乙醚麻醉 大鼠后，于心脏穿刺取血，分离血清于一7 0 。C 保存， 打开颅骨，翻开脑组织，

16、摘下垂体，称重后将一半冻 于液氮中，另一半放于4 多聚甲醛中固定。 1 3 2 血清P R L 水平的放免测定：用氯胺T 法标 记P R L 抗原，取少量标记混合物做纸层析，计算标 记百分比为4 4 9 ，用不同稀释度的P R L 抗体测定 标记抗原的免疫活性，选择1 ：2 80 0 0 的P R L 抗体浓 度作标准曲线，测定样品。灵敏度为0 5 8 8 州L ，批 内C V 为7 4 ，批间C V 为1 3 7 。 1 3 3 组织学及免疫组织化学观察：垂体组织采 用A B C 免疫组化方法显示垂体组织P R L 蛋白的表 达和分布。石腊切片脱腊后用3 H 2 0 ：室温孵育5 1 0m

17、i n ，蒸溜水冲洗，用l B S A P B S 室温作用2 0 m i n ，以封闭非特异性结合位点，倾去血清，滴加抗大 鼠P R L 抗体( 浓度为1 ：1 0 0 0 ) ，同时用P B S 代替一抗体 做为对照，4 过夜后，滴加生物素标记的羊抗大鼠抗 体( 1 ：2 0 0 ) ，室温3h ，然后滴加辣根过氧化酶标记的 三抗S 一刖H R P ( 1 ：2 0 0 ) 室温孵育3h ，行D A B 显色。 1 3 4 用R T - P C R 方法分析大鼠垂体组织中P i t 1 的表达量：用异硫氢酸胍一步法提取垂体组织总 R N A ，用反转录方法合成模板e D N A ，用P e

18、 R 方法扩 增大鼠P i t 1 基因片段，上游引物为5 C A C C T C G G C T G A T A C C r I T I T - 3 ，下游引物为5 G 1 胛G C T C C C A C ，I - I 哪C 3 。扩增产物为6 1 6 b p 。扩 增条件：9 4 变性1 m i n ，5 4 退火1 m i n ，7 2 延伸 1 5 m i n ，共进行3 0 个循环。以B a e t i n 做内对照，上 游引物为5 C G T I “ G A C A T C C G T A A A G A 3 ，下游引物 为5 A G C C A C C A A T C C A

19、C A C A G 3 ，扩增产物是1 7 3 b p 。用琼脂糖凝胶电泳方法检测扩增产物，用计算 机图像分析系统测定样本灰度值，以口a c t i n 作为内 参照，计算相对含量。见图1 。 注：M ：m a r k e r ；Z ：中药降乳散组；N C ：阴性对照；C ：对照组； A ：安慰剂组 图1 大鼠P i t - 1 的R T - P C R 产物电泳图 N o t e ：M ：m a r k e r ；Z ：J i a n g n a g r o u p ；N C ：n e g a t i v ec o n t r o lg r o u p ； C ：c o n t r o lg

20、 r o u p ；A ：p l a c e b og r o u p F i g 1E l e c t r o p h o r e t i cp h o t o g r a p ho fR T - P C Rp r o d u c t s o fP i t - l ( 6 1 6b p ) 1 4 统计学处理 实验结果以平均数标准差来表示，用S P S S 统 计软件处理数据，两组间比较采用t 检验，多组间比 较采用方差分析和F 检验。 2结果 2 1 各组大鼠垂体重量的比较 P R L 瘤组垂体重量为( 7 0 8 5 6 ) m g ，明显高于 对照组( t = 2 1 8 5 7 ，P

21、 0 0 0 1 ) 。降乳散组大鼠垂体 重量比安慰剂组有明显下降( t 值分别为一2 0 3 3 2 ， P 0 0 0 1 ) ，但仍高于对照组( t 值为8 3 2 1 ，P 0 0 0 1 ) 。 2 2 各组大鼠血清P R L 水平的变化 P R L 瘤组大鼠血清P R L 为( 58 7 4 2 9 8 7 7 ) g m L ，明显高于对照组( t = 1 5 7 8 7 ，P 0 0 0 1 ) ；降乳 散组的血清P R L 水平比安慰剂组有明显下降( t 值 为一1 3 5 5 8 ，P 0 0 0 1 ) 。 2 3P i t 1m R N A 在垂体组织中的表达量 P i

22、 t 1m R N A 在P R L 瘤组大鼠垂体组织中的表 达量明显高于对照组( t = 1 4 3 4 2 ，尸 0 0 0 1 ) ，P i t 1 m R N A 水平在安慰剂组和P R L 瘤组之间无明显差别 ( t = 1 6 4 4 ，P = 0 1 0 4 ) 。P i t 1m R N A 在降乳散组中 表达水平比安慰剂组有所下降，统计学差别显著( t 万方数据 中国实验动物学报2 0 0 8 年1 2 月第1 6 卷第6 期A c t aL a b l L l t l i mS e iS i n ，D e c e m b e r ，2 0 0 8 ，V d 1 6 ，N o

23、 64 5 7 参数 治疗前B e f o r et r e a t m e n t 对照组PRL瘤组 C o n t r o lg r o u p ( n = 4 ) P r o l a e t i n o m ag r o u p ( n = 4 ) 治疗后A f t e i - t r e a t m e n t 安慰剂组中药组 P l a c e b og r o u p ( n = 4 ) J i a n g r u n ng r o u p ( n = 4 ) 注：。：与对照组比，P 0 0 0 1 ；+ ：与P R L 瘤组相比，P O 0 0 1 ；6 ：与安射剂组相比，P O

24、 0 0 1 N o t e ：。：懈c o n t w lg r o u p ，P O 0 0 1 ；。：缚p r o l a e t i n o n mg r o u p ，P O 0 0 1 ；：懈p l a b og r o u p ，P O 0 0 1 3 讨论 转录因子在垂体细胞的分化中起着关键的作 用，根据转录因子的不同，将垂体细胞分化通路分为 3 种：促肾上腺皮质激素上游转录结合元素( C u ，I E ) 决定A C T H 细胞的分化；类固醇原因子1 ( S F 1 ) 决定 促性腺激素细胞的分化；P i t 1 决定垂体P R L 、G H 、 T S H 细胞的分化1

25、。P i t 1 是垂体特异的转录因子， 在其他转录因子的协同作用下，以细胞特异性的形 式调节G H 和P R L 基因启动子的活性。在P R L 基因 近端启动子区和远端增强子区各存在4 个P i t 一1 蛋 白结合位点和1 个雌激素受体反应元件( E R E ) ，P R L 基因的正常表达需要P i t 1 蛋白与雌激素雌激素受 体复合物的协同作用，此外，P i t 1 通过作用于下丘 脑多巴胺受体控制P R L 细胞的增生。我们曾研究 发现雌激素受体和P i t 一1 在雌激素诱发的大鼠P R L 瘤组织中的表达明显增高怛t s J 。本研究在雌激素长 期作用下，出现大鼠垂体P R

26、L 细胞增生，P R L 分泌 增多，最终出现高P R L 血症和P R L 瘤，P i t 1 在雌激 素诱发大鼠P R L 瘤中的表达也明显增高。说明P i t 1 在P R L 瘤的形成中起重要作用。 近年来，中药对高P R L 血症的治疗取得了比较 满意的疗效【9 1 训。治疗高P R L 血症的常用中药主要 有：麦芽、当归、柴胡、芍药、甘草、菟丝子、仙灵脾 等。现代药理学研究表明，麦芽含有麦角类物质，具 有拟多巴胺激动剂样作用，抑制P R L 分泌；当归含 挥发油、维生素B 1 2 、叶酸，具有抗贫血和提高雌激 素水平的作用；柴胡主要含有三霈类中性皂甙和少 量挥发油，具有止血止痛和扩

27、张末梢血管的作用；甘 草主要含有甘草酸，甘草次酸，甘草甙等，具有解痉。 解毒建胃和拟肾上腺皮质激素样作用；仙灵脾具有 性激素样作用，以兴奋性腺，促进卵巢分泌的功能为 主。 本研究用的中药降乳散由生麦芽、柴胡、白芍、 当归、仙灵脾、穿山甲、郁金、夏枯草等1 2 味中药组 成，在临床上，治疗高P R L 血症所致的不孕不育，取 得了满意的疗效。我们以往的研究以及本研究均显 示中药降乳散明显抑制大鼠P R L 的分泌和P R L 细 胞的增生，说明降乳散具有抗P R L 瘤的作用。其作 用机制如何? 根据我们以往的经验，在雌激素作用 8 周后，大鼠P R L 肿瘤已经形成，所以在8 周后两组 各处死

28、4 只动物，根据大鼠垂体重量以及血清P R L 水平，证实已经形成肿瘤。然后给予药物干预，结果 显示：降乳散治疗1 个月后，大鼠P R L 瘤重量以及 血清P R L 水平均明显降低，与此同时，降乳散对大 鼠P R L 瘤表达P i t 1 具有一定的抑制作用，提示降乳 散抑制P i t 1 的表达是其抗P R L 瘤的机制之一。 参考文献 1 徐春，李江源，黄兆坚诺果宁、培高利特和降乳散对乙蔗酚 诱发的大鼠泌乳素瘤防治作用的初步研究 J 军医进修学院 学报，2 0 0 0 ，2 1 ( 2 ：1 2 3 2 徐春，王晖雌激素诱发大鼠催乳素瘤机制的研究 J 肿瘤防 治研究。2 0 0 7 ，3

29、 4 ( 1 ) ：1 8 【3 Y a m a d aS ，T a k a h a s h iM ，H a r aM e ta 1 P i t 1g e n ee x p r e s s i o ni n h u m a np i t u i t a r ya d e n o m a su s i n gt h er e v e l B et r a n s c r i p t i o np o l y m e n t s e c h a i nr e a c t i o nm e t h o d J C l i nE n d o e r i n 0 1 1 9 9 6 。4 5 ：2 6

30、3 2 7 2 4 H a m a d aK ，N i s h iT ，K u r a t s uJ ，e ta 1 E x p r e s s i o na n da l t e r n a t i v e s p l i c i n go fP i t lm e s s e n g e rr i b o n u e l e i ca c i di np i t u i t a r ya d e n o m a s J N e u n m u r g e r y ，1 9 9 6 ，3 8 ：3 6 2 3 6 6 5 K o b a y a s h iI ，O k aH ，N a r i

31、t a k aH ，e la 1 E x p r e s s i o no f P i t - 1a n d 尊口w t l I h o r m o n e - r e l e a s i n gh o r m o n er e c e p t o rn d l N Ai nh u m a np i t u i t a r y n d e n o r a M ：d i f f e r e n c ea m o n gf u n c t i o n i n g ，s i l e n t ，a n d o t h e r n o n f u n c t i o n i n ga d e n o m

32、 a s J E n d o c rP a t h 0 1 ，2 0 0 2 。1 3 ( 2 ) ：8 3 9 8 6 徐春，梁力武中药降乳散对乙烯雌酚诱发的大鼠泌乳素瘤 抑制作用的研究 J 中华中医药杂志，2 0 0 7 ，2 2 ( 1 ) ：3 7 7 O a a m u r aR Y ，E g a s h i mN ，M i y a iS ，e ta 1 M o l e c u l a rp a t h o l o g yo ft h e p i t u i t a r y D e v e l o p m e n ta n df u n c t i o n a ld i f f e

33、r e n t i a t i o n o f p i t u i t a r y a d e n o m a s J F r o n tH o r mB e s ，2 0 0 4 3 2 ：2 0 3 3 8 徐春，李江源，黄兆坚雌激素受体基因在已烯雌酚诱发的大 鼠泌乳素瘤中的表达 J 中华内分泌代谢杂志，2 0 0 1 ，1 7 ( 1 ) ： 4 7 5 0 9 】金晶，周忠明中医药治疗高催乳素血症的研究进展 J 湖北 中医院学报，2 0 0 6 ，8 ( 2 ) ：“一6 5 1 0 雷丽逍遥散加减治疗高泌乳素血症的临床观察 J 湖北中 医杂志，2 0 0 3 ，2 5 ( 8 ) ：1 4 1 5 【收稿日期】2 0 0 8 4 7 0 4 万方数据