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1、收稿日期:2005_02_26 基金项目:广州市科技攻关项目(2002Z3_E4102) A Key Science and Technology Research Project of Guangzhou Muni_ cipality (2002Z3_E4102) 作者简介:李 琳(1975_),女,讲师,电话020_61648235,E_mail: li75lin 通讯作者: 富 宁, 第一军医大学免疫学教研室, 教授, 电话:020_ 61648221,E_mail: 与海洛因有完全交叉反应的抗吗啡单抗的制备 李 琳 1,刘 洁2,朱 平2,徐江平1,富 宁2(南方医科大学1 药理学
2、教研室,2免疫学教研室,广东 广州510515) 摘要:目的 制备吗啡的单克隆抗体(mAb)并鉴定抗体的特性。 方法6_琥珀酰化吗啡与Blue carrier(BC)载体蛋白交联 制备6_琥珀酰化吗啡酯(M_6_S_BC),用其免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤,经筛 选和3次克隆化,从制备的腹水中纯化单克隆抗体。 结果 获得4株杂交瘤细胞G1、G3、H4和B1,其分泌单抗的亚型均 为IgG1型。 经ELISA鉴定,该单克隆抗体可结合游离的吗啡、海洛因及可待因,而且对海洛因的结合优于吗啡,该单抗 不与非阿片类药物结合。 结论 所制备的吗啡单克隆抗体可特异性结合
3、吗啡等阿片类药,将为建立体外吗啡及海洛因的 非同位素检测方法奠定基础。 关键词:吗啡;单克隆抗体;竞争性抑制 中图分类号:R965 文献标识码:A 文章编号:1000_2588(2005)07_0833_04 !“#$%“.-)23 Morphine_6_succinyl was conjugated with Blue carrier (BC) in the presence of carbodi imide. BALB/c mice were immunized with the holoantigens (M_6_S_BC) and Freund adjuvant, and hybrid
4、oma was generated with mouse spleen cells and Sp2/0 myeloma cells. After 3 fusions and cloning, 4 hybridoma cell lines secreting monoclonal antibodies to morphine were obtained and the mABs purified from the mouse ascites followed by characterization with enzyme_linked immunosorbent assay (ELISA). )
5、*/0=3()* The anti_morphine mAbs can bind with the opioids, especially heroin, and can be useful for sensitive detection of opioids. ?#6 4)“38 morphine; monoclonal antibodies; competitive inhibition 吗啡是阿片 _ 受体激动剂, 是临床上常用的强 效镇痛药之一,但由于其成瘾性较高,严重限制了其 临床应用和治疗效果,其致依赖的潜能使它得以作为 毒品在社会上滥用。阿片类物质主要滥用的种类为海 洛因,而海洛
6、因与吗啡结构相似,海洛因又称二乙酰 吗啡,其吗啡母环上的羟基发生乙酰化,其进入体内 后经酶解生成吗啡而发挥其药理作用。 目前对于阿片类毒品的检测, 多通过测定生物样 品中吗啡的含量来判定患者是否服用阿片类物质。常 用的毒品的检测方法有色谱法和免疫学方法。通过色 谱法检测主要包括薄层色谱法1、气相色谱法2、高 效液相色谱法3、气质联用色谱法4等。色谱法虽能精 确定量,但其前处理过程较为繁琐,且检验较为费时, 免疫化学方法则简单易行。 放免分析法5(RIA)及红 血球凝聚法等都是测定生物样品中吗啡含量的高效 方法,ELISA方法近年来迅速发展成为用于测定药物 含量的微量分析方法, 被检样品无需进行
7、前处理,可 直接用于测定,这是其它分析方法所不能及的,其特 异性强、灵敏度高,目前正愈来愈多地用于生物液体 标本中微量物质的测定,其中包括对各种毒品成分的 测定。 本研究中,我们制备了抗吗啡的特异性单克隆 抗体(mAb),以期寻找简单、经济、定量、有效地检测 生物样品中吗啡含量的方法。 1 材料及仪器 1.1 药品与试剂 PEG(4000)(Merk产品);IMDM培养基、新生牛 血清、HAT和HT(Gibico_BRL公司产品)、弗氏完全 及不完全佐剂(FCA,FIA)、碳二亚胺(DECI)、抗Ig 亚型分型血清 (均为Sigma公司产品);HRP标记羊 抗鼠IgG(北京鼎国生物技术有限公司
8、); 盐酸吗啡 (青海制药厂),海洛因(中国药品生物制品检定所); Blue carrier载体蛋白(BC, Pierce公司)。 2005;25(7) 第一军医大学学报(J First Mil Med Univ)833 表1 M-6-S-BC抗原与小鼠抗吗啡抗体的结合 Tab.1 Binding of anti-morphine antiserum with M-6-S-BC(490 nm) 表2 杂交瘤细胞融合率及抗体产生阳性率 Tab.2 Preparation of the hybridoma ell strains se reting M-6-S-BC mono lonal anti
9、bodies(%) M-6-S-BC: holoantigens Coating reagents Concentration(g/ml) 201052.51.25 BC0.0980.0740.1030.1120.137 PBS0.0450.0760.0540.0690.098 M-6-S-BC1.6651.3211.0640.9840.844 ItemsResults Total wells with cell fusion576576576 Hybridoma cell wells576540530 Cell fusion ratio100%93.7%92.1% Antibody-posi
10、tive wells1154 Antibody positivity ratio1.9%0.9%0.7% 1.2 实验动物与细胞系 Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞在含10%新生牛血清IMDM 培养体系中培养(免疫学教研室保存);雌性BALB/c 小鼠,8周龄,SPF级(本校实验动物中心)。 1.3 方法 1.3.1 免疫原的制备及其交联程度的检测参照文献 7方法制备吗啡碱,与过量琥珀酸酐反应生成6-琥 珀酰化吗啡碱 (M-6-S)。 在DECI存在条件下,将 M-6-S直接与BC载体蛋白交联,制备琥珀酰吗啡酯 (M-6-S-BC)。 将其以5 g/ml浓度包被酶标条5 ,以 自制的鼠抗吗啡抗血清为一
11、抗进行交联性的检测。 1.3.2 杂交瘤细胞株的建立 1.3.2.1 动物免疫 用M-6-S-BC作为免疫原, 基础免 疫共5次,间隔3周,每次抗原用量为50 g/只。 初 次用弗氏完全佐剂(FCA)混合乳化,皮下多点(68 点),以后用弗氏不完全佐剂(FIA),腹腔注射。 每次 免疫后1周,ELISA法测血清抗体效价,于融合前3 d 尾静脉注射抗原加强免疫,抗原用量100 g/只。 1.3.2.2 细胞融合 8 取免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0 细胞按常规方法进行融合,经HAT选择性培养基培 养,6-琥珀酰吗啡 BSA酯 (M-6-S-BSA)5g/ml包 被,以间接ELISA法筛选阳性克隆,
12、再通过有限稀释 法进行三次亚克隆筛选出能稳 定 分 泌 抗 吗 啡 的 mAbs的杂交瘤细胞株,扩大培养后,常规制备mAbs 腹水,以HItrap ProteinG柱纯化腹水。 1.3.3 mAb抗体特性鉴定 1.3.3.1 Ig亚类测定参照Sigma公司试剂盒(ISO-1) 说明书进行检测。 1.3.3.2 抗体效价测定以6-琥珀酰吗啡BSA酯 (M-6-S-BSA)5 g/ml包被酶标条,4 过夜,5%脱脂 奶粉37 封闭2 h,加入不同稀释度的各株mAbs腹 水或纯化单抗,HRP-羊抗鼠IgG为检测抗体,邻苯二 胺底物显色,酶标仪读取D490值。 1.3.3.3 Biotin标记单抗及鉴
13、定1.14 mg/ml mAbs 877 l ,经 PBS透析过夜,加入35 l 6 mg/ml Biotin 溶液,混匀,冰上放置2 h,PBS透析过夜。 以M-6-S- BSA 5 g/ml包被,4 过夜,5%脱脂奶粉37 封闭 2h,加入不同倍比稀释度(10、5、2.5、1.25、0.625 g/ml)的Biotin标记单抗,Aviding-HRP IgG为二抗, 显色及测定同1.2.3.2。 1.3.3.4 抗吗啡mAb的竞争性抑制实验包被及封闭 方法同1.2.3.2,Biotin标记单抗20.156 g/ml与不 同浓度(20、10、5、2.5、1.25 g/ml等)的吗啡、海洛因、
14、 可待因、可卡因及哌替啶体外等体积混合,温育10 min 加入包被孔中,Aviding-HRP IgG为检测抗体,显色及 测定同1.2.3.2,计算抑制率,抑制率(A阳性对照孔 -A样品孔)/A阳性对照孔100%。 1.3.3.5 抗吗啡抗体与多种化学物质的交叉反应 包 被及封闭方法同1.2.3.2,Biotin标记单抗20.156 g/ml 与不同浓度(100、50、25、12.5、6.25 g/ml等)的氯丙 嗪、阿托品、阿司匹林体外等体积混合,温育10 min 作为一抗加入包被孔中,Aviding-HRP IgG为二抗,显 色及测定同1.2.3.2,检测各物质抑制作用强弱。 2 结果 2
15、.1 免疫原的制备及检测 盐酸吗啡投料3 g,M-6-S终产品为1.6 g, 终产 率为53%,ELISA检测发现,M-6-S-BC具有良好的 免疫原性,与自制鼠抗血清有较好的结合能力,测得 的D(“)值较高,对照孔BC的A值较低,说明该蛋白 不能与抗血清特异性结合,此交联物具备了吗啡的抗 原性,结果见表1。 2.2 杂交瘤细胞系的建立 共进行了3次融合, 融合率均在90%以上。 经 ELISA法初筛、复筛、克隆化,得到4株可稳定分泌抗 吗啡的杂交瘤细胞株, 分别命名为G1、G3、H4和B1 (表 2)。 2.3 mAb的效价及Ig亚类测定 免疫酶联法检测亚类的结果显示,4株抗吗啡的 mAb的
16、亚型都属于IgG1型。ELISA实验测定腹水及 单克隆抗体的效价较高,单抗G1的抗体效价较高为 0.625 g/ml, 故选用G1标记Biotin,Biotin-G1与包 第一军医大学学报(_ First Mil Med niv) 第25卷834 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1052.5 1.25 0.63 0.31 0.16 0.08 0.04 0.02 0.01 The concentration(g/ml) Percentage of inhibition(%) morphine heroin codeine cocaine pathidine 图1
17、 阿片类药物对单抗结合吗啡的抑制 Fig.1 Inhibition of the opioids and non-opioid drugs on binding between mAb G1 and M-6-S-BSA 被抗原(M-6-S-BSA)结合程度较高,其中D(!)值为1 左右的抗体浓度为0.156 “g/ml, 抗体效价可达到39 ng/ml,可确定0.156 “g/ml为下一步抑制实验的浓度。 2.4 不同药物对mAb G1结合吗啡的竞争性抑制9 结果显示:三种物质对包被抗原和Biotin标记的 单克隆抗体Biotin-G1的结合均有不同程度的抑制 作用,其中海洛因的抑制作用最强,
18、吗啡及可待因的 IC50值在0.1560.078 “g/ml之间,海洛因的IC50值在 0.0390.0195 “g/ml之间, 海洛因对抗原抗体结合的 抑制作用明显强于其他两种物质(图1)。 该结果提示 单抗G1所识别的是吗啡、海洛因和可待因的共同表 位;上述结合不被非阿片类物质如哌替啶、可卡因等 抑制,其抑制率均低于20%,证明了G1识别阿片类 药物表位的特异性。 2.5 抗吗啡抗体与多种化学物质的交叉反应 3种大浓度的化学物质如氯丙嗪、阿托品及阿司 匹林,与单抗Biotin-G1的交叉反应结果显示,它们 对Biotin-G1与包被抗原的抑制作用均较小,抑制率 均低于20%。 该结果进一步
19、证实单抗G1所识别的是 阿片类物质表位的特异性。 3 讨论 单克隆抗体的制备对于半抗原药物分子的免疫 学检测十分必要。Rahbarizadeh等10人制备了高亲和 力的抗吗啡单克隆抗体, 并采用青霉素酶标记的 ELISA方法进行检测,但在国内尚无该单抗及其用单 抗建立的检测系统。 由于吗啡为小分子半抗原,相对 分子质量仅为285,只有与载体相联才有可能成为完 全抗原。 本实验采用化学方法制备6位偶联复合物, 即M-6-S-BC, 主要基于吗啡具有氢化吡啶菲的绸环 母核,3位的酚羟基、6位的醇羟基活性较强, 首先采 用一氯醋酸钠法11和琥珀酸酐法7合成琥珀酰吗啡 半酯,在EDCI催化下,与大分子
20、载体蛋白交联成为 完全抗原,从而引起机体免疫应答。 以往的工作中7, 蛋白载体均选用与人血清白蛋白极高同源性的牛血 清白蛋白(BSA ),如Wainer等12采用琥珀酸酐法合 成琥珀酰吗啡, 在碳二亚胺作用下与BSA偶联得到 吗啡酯, 并将得到的6位偶联复合物(M-6-S-BSA), 将其免疫家兔, 也得到吗啡特异性抗体。 而本研究选 用新型载体蛋白(BC)系源自海洋动物蛋白,与人体 蛋白完全无交叉性; 而在鉴定抗体时则采用BSA载 体以避免抗载体抗体的影响。本实验采用敏感而特异 的ELISA进行检测, 实验中所获抗体均是针对阿片 类物质的,而非阿片类的物质及其他镇痛药不能抑制 该单抗与吗啡抗
21、原的结合, 提示该单抗特异性良好; 另一值得注意的现象是:该抗体可与海洛因和可待因 反应,而且对海洛因的结合甚至强于吗啡,这提示单 抗G1所识别表位为阿片类药物的保守结构,即共同 表位。上述性质这对于我们将来制备单克隆抗体检测 试剂盒,用于阿片类物质的检测,防止假阳性结果出 现提供了有力的保证。 免疫化学测定方法的建立,有赖于特异性强和高 效价的抗体,因其特异性依赖于抗体的性质,抗体和 受体识别位点不同,抗体识别更精细,以抗体为基础 建立起来的检测方法具有更高的灵敏度和特异性。目 前用于检测吸毒人员的吗啡检测试剂盒敏感度为 300 ng/ml, 显然对检测低浓度阿片类药物的敏感性 仍有差距,因
22、此制备高特异性、高亲和力的抗体是尤 为重要的。 本文用吗啡交联蛋白作为抗原免疫小鼠, 取脾细胞进行细胞融合, 该法制备的抗体亲和力高, 竞争抑制作用敏感,用于检测游离海洛因的敏感性可 达3919.5 ng/ml , 适于进一步制备检测试剂盒,用于 测定样本中低浓度吗啡;而且由于其结合海洛因的高 亲和力,可用于动物模型的体内实验。 参考文献: 1Plotkowiak Z, Popielarz-Brzezinska M, Luczak J,!et al. Quality assessment of morphine hydrochloride solutionsJ. Acta Pol Pharm,
23、 2004, 61(2): 103-6. 2Hida M, Mitsui T, Tsuge S,!et al. Rapid and sensitive determination of morphine in street opium samples by thermal desorption gas chromatography using a microfurnace pyrolyzerJ. J Sep Sci, 2004, 27(12): 1030-2. 3Fernandez P, Vazquez C, Morales L, et al. Analysis of opiates, co-
24、 caine and metabolites in urine by high-performance liquid chro- matography with diode array detection (HPLC-DAD)J. J Appl Toxicol, 2005, 25(3): 200-4. 4Sabzevari O, Abdi Kh, Amini M, et al. Application of a simple and sensitive GC-MS method for determination of morphine in the hair of opium abusers
25、J. Anal Bioanal Chem, 2004, 379(1): 120-4. 第7期李 琳,等.与海洛因有完全交叉反应的抗吗啡单抗的制备835 5Narongchai P, Sribanditmonkol P, Thampithug S, et al. The duration time of urine morphine detection in heroin addicts by radioim_ munoassayJ. J Med Assoc Thai, 2002, 85(1): 82_6. 6Akbarzadeh A, Mehraby M, Zarbakhsh M, et al
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29、on reaction test for morphine in urineJ. Forensic Sci Int, 1996, 81: 125_32. 12Wainer BH, Fitch FW, Rothberg RM, et al. The structure of mor_ phine momohe misuccinateJ. Science, 1972, 178: 647_8. = 第一军医大学学报(J First Mil Med Univ) 2005;25(7) 收稿日期:2005_04_12 作者简介: 李君久 (1965_), 男, 硕士, 副主任医师, 电话:0769_ 26
30、76137,主要研究方向:微创外科 选择性保脾术治疗小儿外伤性脾破裂的临床分析 李君久,覃 谦(东莞东华医院普外科,广东 东莞223001) 摘要:目的 为了避免免疫功能下降和继发感染的发生,在小儿外伤性脾破裂时采用选择性保脾术治疗。 方法 采用选择 性保脾术治疗16例小儿外伤性脾破裂,度伤8 例、 度伤5 例、 度伤3例,其中1例合并有左膈肌破裂。 结果 本组 16例保脾术均获成功,术后恢复顺利痊愈出院,随访结果,疗效满意。 结论 在外伤性脾破裂行保脾术中必须遵循“抢救 生命第一,保留脾脏第二“的原则。 手术成功的关健在于适当掌握手术适应征和术式的选择。 关键词:外伤;小儿脾破裂;选择性保脾
31、术 中图分类号:R657.6 文献标识码:B 文章编号:1000_2588(2005)07_0836_01 本院于1995年1月至2005年1月的10年间,共收治外 伤性脾破裂318例,在21例小儿外伤性脾破裂中,施行选择 性保脾术16例,收到良好效果,现报告如下。 1 临床资料 1.1 一般情况 本组16例小儿外伤性脾破裂,其中男11例,女5例,年龄 最小2.5岁,最大12岁。 致伤原因:坠落伤8例,拳击伤2 例, 跌倒伤3例,自行车撞伤2例,汽车辗压伤1例。 致伤后15例 均有不同程度的腹痛,低血压和腹膜刺激征;均经B超探查提 示脾破裂。1例汽车辗压伤为2.5岁女孩,伤后休克,呼吸困 难,
32、紫绀,病情危重。16例腹腔穿刺均抽到不凝血。 1.2 外伤性脾破裂的分类 Buntain原将脾损伤分为7种类型1(, 后来总结了文献,又 提出了新的四型分类方法2(。 但同济医科大学同济医院在Gall 和Sheele分级方法的基础上又增加了血管离断情况, 使选择 性保留脾脏的术式的选择更趋合理化:1级无血管损伤;2级 有脾小梁) 亚段) 段血管离断;3级一支脾叶动脉或脉离断;4 级是脾动脉主干或其全部叶动脉离断。 而我们依据脾实质及 血管的损伤情况,习惯分为4 度: 1度为单个的脾组织浅裂伤, 深度1 cm,长度5 cm;3度是脾组织局部呈星形裂伤,脾组织部分分 离,已累及脾门,但脾门血管无损
33、伤;4度伤为脾门损伤,脾动) 静脉主干损伤,或脾包膜广泛剥离,包膜下泛积血,脾实质严 重挫裂伤或全脾粉碎性损伤。 1.3 脾损伤情况及保脾术式 本组16例中,1度伤8例, 上级和下极横裂伤各4例,未 伤及全层,无脾门血管受累;2度伤5例,上)下极纵型裂伤各 2例,均为全层裂伤,脾组织部分分离,但未完全离断,无脾组 织挫伤;另1例为脾外面中间近脾前缘脾组无脾组织失伤;另 1例为脾外面中间近脾前缘脾组织呈现*+字形裂伤,创缘及 创底脾组织有挫伤,深度1 cm,长度5 cm;3度伤3 例, 2例 脾下极呈星形裂伤,裂伤脾组织呈粉碎状,下极血管及脾结肠 韧带血管受损。 另1例为汽车辗压伤,脾上)下极呈
34、星形破损, 同时伴有左膈肌从肋角处向剑突方向破裂,长约10 cm(本例 按Buntain新四型分类可划为B,。8例1度伤均作脾修补 术, 5例2度伤中2例切除脾上极,2例切除脾下极,1 例* + +字 形裂伤作修补填塞带蒂大网膜,3例度伤中2例作下极脾切 除, 1例作上)下极同时切除,保留脾门部分,修补隔肌,左胸置 闭式引流。16例均于左膈下置软皮管引流,72 h内拨除膈下引 流管。1例左胸闭式引流, 水封瓶玻璃管水柱波动在 1 cm以 下,引流量小于50 ml/d,也同时拔除。 2 结果与随访 本组16例保脾术,均痊愈出院,近期恢复良好,未见再度 腹腔内出血和延迟性脾破裂的征象,无1例发生膈下感染。 出 院随访达6年以上者8 例, 4年以上5 例, 3例随访超过2 年。 患儿均成长健康。 (下转839 页) 836