东南沿海海域细菌谱及其优势菌伤口感染能力的研究.pdf

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1、第 二 军 医 大 学 学 报 A c a dJS e c M i l M e d U n i v 2 0 0 5D e c ;2 6(1 2)1 3 6 5 论 著 东南沿海海域细菌谱及其优势菌伤口感染能力的研究 马 骢1, 韩善桥1, 郝秀红1, 蒋学兵1, 李艳君1, 虞积耀2 (1.海军总医院检验科, 北京1 0 0 0 3 7; 2.海军总医院病理科) 摘要 目的：了解东南沿海海域细菌分布之特征, 观察致病菌的伤口感染特征。方法：经大范围海水采集后行海洋细菌增 菌培养、 分离、 鉴定及药物敏感性分析, 同时进行单一优势细菌的小鼠毒力实验和伤肢感染实验, 并行组织病理光镜检查。结 果：

2、( 1) 共分离出3 4种2 0 3株细菌, 其中弧菌科1 5 9株(7 8. 3 3%) , 肠杆菌科2 4株(1 1. 8 2%) , 非发酵菌1 5株(7. 3 9%) , 革兰阳 性球菌3株(1. 3 7%) , 厌氧菌2株(0. 9 9%) 。(2)对2 1种抗生素的敏感性依次为亚氨培南、 奈替米星、 左氟沙星、 庆大霉素、 环丙沙星、 复方新诺明, 对头孢唑啉和氨苄西林敏感性差。(3)4种优势弧菌的细菌毒力实验发现, 小鼠肠、 肺、 肝、 肾脏组织细 胞水肿、 变性、 灶性坏死。毒力强度依次为副溶血弧菌、 溶藻弧菌、 海鱼弧菌、 霍利斯弧菌, 副溶血弧菌可致败血症。(4) 通过建

3、立小鼠伤肢感染模型, 观察优势弧菌的伤口感染能力, 发现实验鼠皮下及横纹肌内有大量炎性细胞浸润, 并可形成蜂窝织炎。 结论：菌谱调查结果涵盖了该海域及海岸带细菌分布的特征。动物实验数据证实了4种优势弧菌的毒力和伤口感染能力。 关键词 东南沿海海域; 副溶血弧菌;溶藻弧菌;海鱼弧菌;霍利斯弧菌; 毒力; 感染 中图分类号 R3 7 8 文献标识码 A 文章编号 0 2 5 8 - 8 7 9 X(2 0 0 5)1 2 - 1 3 6 5 - 0 3 A c t e r i u ms p e c t r u mo fS o u t h e a s tC h i n aS e aa r e aa

4、n dw o u n di n f e c t i o na b i l i t yo fd o m i n a n tb a c t e r i a MAC o n g 1,HANS h a n - q i a o1,HAO X i u - h o n g1, J I ANG X u e - b i n g 1,L IY a n - j u n1, YUJ i - y a o 2( 1. D e p a r t m e n to fL a b o r a t o r y M e d i c i n e,N a v yG e n e r a lH o s p i t a l,B e i j i

5、 n g1 0 0 0 3 7,C h i n a;2. D e p a r t m e n to fP a t h o l o g y,N a v yG e n e r a lH o s p i t a l) A B S T R A C T O b j e c t i v e:T oi n v e s t i g a t et h eb a c t e r i as p e c t r u mi nS o u t h e a s tC h i n aS e aa r e aa n dt ol e a r nt h ew o u n di n f e c t i o n c h a r a c

6、 t e r so f t h em a i np a t h o g e n i cb a c t e r i a .M e t h o d s:B a c t e r i aw e r ec u l t u r e d,i s o l a t e da n di d e n t i f i e df r o m w i d e l yc o l l e c t e ds e a w a t e ra n dw e r es u b j e c t e dt oa n t i b i o t i c ss e n s i t i v i t yt e s t s .T h ed o m i

7、n a n tb a c t e r i aw e r eu s e ds e p a r a t e l yf o rv i r u l e n c ea n dw o u n d i n f e c t i o ne x p e r i m e n t s i nm i c e . T h ep a t h o l o g i c a l c h a n g e sw e r eo b s e r v e dw i t hm i c r o s c o p e . R e s u l t s:T h eb a c t e r i a i n c l u d e d3 4s p e - c

8、i e sa n d2 0 3s t r a i n s:1 5 9(7 8. 3 3%)s t r a i n so fv i b r i o s,2 4(1 1. 8 2%)e n t e r i cb a c i l l i,1 5(7. 3 9%)n o n f e r m e n t e r s,3(1. 3 7%) g r a mp o s i t i v ec o c c u sa n d2(0. 9 9%)a n a e r o b e . T h eo r d e ro fb a c t e r i as e n s i t i v i t i e s t oa n t i

9、b i o t i c sw a s i m i p e n e m n e t i l m i c i n l e v o f l o x a c i n g e n t a m i c i nc i p r o f l o x a c i n c o m p o u n ds u l f a m e t h o x a z o l e .T h eb a c t e r i ah a dp o o r i n s e n s i v i t yt oc e f a z o l i na n d a m p i c i l l i n .V i r u l e n c ee x p e r

10、i m e n t so f 4d o m i n a n t v i b r i o ss h o w e de d e m a,d e g e n e r a t i o na n dn e c r o s i s i nt h e i n t e s t i n e,l u n g,l i v e r, a n dk i d n e yo fm i c e,w i t ht h eo r d e ro f v i r u l e n c eb e i n gV.p a r a h a e m o l y t i c u sV.a l g i n o l y t i c u sV.d a

11、m s e l aV.h o l l i s a e. V.p a r a h a e m o l y t i c u sc o u l dc a u s es e p t i c e m i a .T h er e s u l t so f i n f e c t i o u sa b i l i t yo ft h e4d o m i n a n tv i b r i o ss h o w e dt h a tv i b r i o s c o u l dc a u s e t h ew o u n d i n f l a mm a t o r yo fm i c e . I n f l

12、a mm a t o r yc e l l sw e r e f o u n ds u b c u t a n o u s l ya n d i nt h e s t r i p e dm u s c l e s,f o r m i n g i n t oc e l l u l i t e s . C o n c l u s i o n:T h ec h a r a c t e r so fb a c t e r i as p e c t r u mi nS o u t h e a s tC h i n aS e aa r e ah a sb e e ni n v e s t i g a t

13、e d .T h ev i r u - l e n c ea n dt h ew o u n d i n f e c t i o na b i l i t yo f t h e4d o m i n a n tv i b r i o sh a v eb e e nt e s t e d i nm i c e . K E Y WO R D S S o u t h e a s tC h i n aS e aa r e a;v. p a r a h a e m o l y t i c u s;v.a l g i n o l y t i c u s;v.d a m s e l a;v.h o l l i

14、 s a e;v i r u l e n c e;i n f e c - t i o n A c a dJS e cM i lM e dU n i v, 2 0 0 5,2 6(1 2) :1 3 6 5 - 1 3 6 7 作者简介 马 骢(1 9 5 3 -) , 女( 汉族) , 硕士, 主任技师. E - m a i l:n a v y j y k1 6 3. c o m 由于海洋具有高盐、 高钠、 低温、 寡营养等特点, 海 洋微生物不同于陆地, 以嗜盐菌为主。远海、 近海与口 岸因海洋生态环境的差异, 同样的海深可存在不同的 海洋细菌。随着海浪海涌的活动和日照对海平面温度 的影响,

15、 不同海深亦存在不同海洋微生物。本课题对 东南沿海海域进行较大范围细菌菌谱调查和抗生素敏 感性分析, 为有效选用抗生素提供实验依据。 1 材料和方法 1. 1 海水采集 2 0 0 1年41 0月, 距岸边0. 3 9 3. 1 0海里, 共采集3 6处。用无菌海水采样器采集 海水, 取海洋面下3 01 0 0c m深处的海水, 每处2 份, 每份5 0 0m l, 共1 0 2份海水。 1. 2 培养基和试剂 增菌培养基: 碱性蛋白胨水, 嗜盐菌增菌液,R V S肉汤, 营养肉汤, 厌氧菌增菌液 ( 法国生物梅里埃) ,G I O L I T T IC ANT ON I肉汤( 英 国O X

16、O I D) 。分离培养基:T C B S琼脂, 血平板, 麦 康凯平板,B A I R D - P AR K E R琼脂( 英国O X O I D) , 1 3 6 6 第二军医大学学报 2 0 0 5年1 2月, 第2 6卷 中国兰平板,S S平板,C D C厌氧血平板( 中国药品 生物制品检定所) 。 1. 3 细菌分离和鉴定 取海水2 2 5m l , 加入2 5m l 增菌液, 3 568h, 取表面培养物接种于分离培养 基, 3 5,1 82 4h, 按种应用V I T E K全自动微生 物分析仪( 法国) ,GN I、G P I鉴定卡进行鉴定。 1. 4 优势细菌毒力和伤口感染力

17、实验 溶藻弧菌、 副溶血弧菌、 海鱼弧菌、 霍利斯弧菌均取自东南沿 海。二级昆白小鼠, 雄性, 体质量1 61 8g( 京动许 可9 9 0 0 1) 9 5只, 体质量2 02 2g时进行实验。实 验环境: 无菌层流室, 清洁级。 1. 4. 1 细菌毒力实验 分别于小鼠腹腔内注入单 一种实验用细菌制备的细菌悬液, 实验细菌浓度为 1 0 6C F U /m l。 1. 4. 2 伤口感染实验 小鼠左大腿切割伤后固定 浸泡于含单一细菌的人工海水4 56 0m i n, 小鼠打 捞出水后按组分笼饲养。 1. 4. 3 组织病理学检查 处死小鼠, 取脏器和伤肢 放入1 0%甲醛溶液中固定, 制作

18、病理切片, 石蜡包 埋、 制片、 切片、H - E染色, 光镜观察。 1. 4. 4 实验菌一致性确认 核酸指纹图分析确认 细菌一致 性 ( 军事医学科学 院 五 所) , 所 用 引 物: r e p 1 -5 I I I I C GI C GI C A T C IG G C I C GI C TTATC I GG C CTA C AT G TAA G C T C C T G G G GAT T C A CAAG TAA G T G A C T G G G G T G AG CG3 。 1. 5 优势细菌抗生素敏感性分析 药敏纸片种类: 青霉素、 苯唑青霉素、 复方新诺明、 万古霉素、 克拉

19、霉 素、 头孢唑啉、 环丙沙星、 红霉素、 四环素、 庆大霉素、 氨苄西林、 优力新、 头孢呋新、 头孢他啶、 头孢噻肟、 头孢哌酮、 氨曲南、 亚胺培南、 阿米卡星、 左氧氟沙 星、 氯霉素、哌拉西林、 奈替米星( 英国O X O I D) 。 药敏实验方法(K - B法) : 制菌悬液, 涂布于M - H琼 脂平板上, 放置药敏纸片, 3 5,1 82 4h, 依照抑菌 圈的大小判断药敏结果。 2 结果和讨论 2. 1 海洋细菌菌谱分布情况 关于海洋细菌学的 研究, 国外已有较多报道 1,2, 我国微生物工作者曾 对沿海地区某些口岸海水进行过细菌分布的分析, 先后报道有1 0多种弧菌 3,

20、4。本研究对东南沿海海 域海洋细菌种类检出情况见表1。共分离出3 4种 2 0 3株细菌, 其中弧菌科1 5 9株(7 8. 3 3%) , 肠杆菌 科2 4株( 1 1. 8 2%) , 非发酵菌1 5株(7. 3 9%) , 革兰 阳性球菌3株( 1. 3 7%) , 厌氧菌2株(0. 9 9%) 。 从海洋细菌种类分析, 弧菌科为主, 主要是溶藻 弧菌, 其次为沙鱼弧菌、 海鱼弧菌、 副溶血弧菌、 霍利 斯弧菌。这4种弧菌占该海区海洋细菌比例的 4 4. 4 7%, 成为优势弧菌, 广泛分布于海洋、 海口和近 海岸。这些弧菌均为革兰阴性兼性厌氧菌, 无芽胞, 菌体有鞭毛, 氧化酶阳性。肠

21、杆菌科主要为大肠埃 希菌、 非发酵菌、 铜绿假单胞菌。本次还分离到金黄 色葡萄球菌、 溶血葡萄球菌、 气球菌、 无害芽胞梭菌、 黏液真杆菌。调查虽未检出沙门菌属、 志贺菌属及 O1群、O1 3 9群霍乱弧菌, 但加强对这些细菌的监测是 一项长期而重要的工作, 对于防止此类细菌所致传 染病的发生与流行都具有重要意义。 表1 东南沿海海域海洋细菌种类分布 T a b1 B a c t e r i as p e c t r u mi nS o u t h e a s tC h i n aS e aa r e a n(%) F a m i l yn a m e (G e n u s) S p e c

22、i e sn a m eS t r a i n s V i b r i oV.a l g i n o l y t i c u s4 5(2 2. 1 7) V.c a r c h a r a e2 1(1 0. 3 4) V.d a m s e l a1 4(6. 9 0) V.p a r a h a e m o l y t i c u s1 3(6. 4 0) V.h o l l i s a e1 2(5. 9 1) V.f l u v i a l i s1 1(5. 4 2) V.c h o l e r a en o n - 0 1,1 3 9g r o u p1 0(4. 9 3) V.

23、m e t s c h n i k o v i i6(2. 9 6) V.c i n c i n n a t i e n s i s5(2. 4 6) V.v u l n i f i c u s3(1. 4 8) V.f u r n i s s i i1(0. 4 9) V.m i n i c u s1(0. 4 9) A e r o m o n a sA.c a v i a c5(2. 4 6) A.s o b r i a5(2. 4 6) A.h y d r o p i l a4(1. 9 7) A.s c h u b e r t i i1(0. 4 9) P l e s i o m o

24、n a sP.s h i g e l l o i d e s2(0. 9 9) E n t e r o b a c t e r i a c e a eE s c h e r i c h i a c o l i1 5(7. 3 9) E n t e r o b a c t e r c l o a c a c2(0. 9 9) P a n t o e aa g g l o m e r a n s2(0. 9 9) C i t r o b a c t e rf r e u n d i i2(0. 9 9) K l e b s i e l l a o x y t o c a2(0. 9 9) H a

25、f n i aa l v e i1(0. 4 9) N o n f e r m e n t e r sP.a e r u g i n o s a5(2. 4 6) P.a l c a l i g e n e s4(1. 9 7) S h e w a n e l l ap u t r e f a c i e n s2(0. 9 9) P.s t u t z e r i1(0. 4 9) S t e n o t r o p h o m o n a sm a l t o p h i l i a1(0. 4 9) F l a v o b a c t e r i u mo d o r a t u m2(

26、0. 9 9) G r a m - p o s i t i v eb a c t e r i aS.a u r c u s1(0. 4 9) S.h e a m o l y t i c u s1(0. 4 9) A e r o c o c c u s1(0. 4 9) A n a e r o b eC l o s t r i d i u mi n n o c u u m1(0. 4 9) E u b a c t e r i u ml i m o s u m1(0. 4 9) T o t a l2 0 3(1 0 0) 2. 2 优势细菌毒力实验 2 . 2 . 1 一般状况 各组动物注菌后,

27、即刻出现腹部 颤抖, 精神萎靡, 当日阴性对照组逐渐恢复实验前状 态, 实验细菌组和阳性对照组, 注菌后6h发生呼吸 1 3 6 8 第 二 军 医 大 学 学 报 A c a dJS e c M i l M e d U n i v 2 0 0 5D e c ;2 6(1 2) 急促、 毛色灰暗、 弓背、 竖毛现象, 4 8h后动物精神状 态有所好转, 7 2h恢复至注前水平, 阴性对照组无明 显变化。 2. 2. 2 病理组织学变化 肠: 黏膜水肿、 糜烂、 肠绒 毛血管内皮肿胀, 血管内白细胞聚集。肝脏: 肝细胞 胞质浊肿、 疏松、 嗜酸变性、 灶性坏死、 库普弗细胞增 生。肾脏: 肾小球

28、血管充血、 肾小管混浊变性, 肾间 质水肿。肺: 肺微血管内皮肿胀、 白细胞聚集, 肺泡 水肿、 微血栓形成和灶状肺萎陷。损伤轻重依次为: 副溶血弧菌、 溶藻弧菌、 海鱼弧菌、 霍利斯弧菌。 副溶血弧菌是引起急性胃肠炎的常见病原菌, 本 次研究发现该菌不仅引起肠道感染, 还可致肠道外感 染- - -菌血症。溶藻弧菌过去认为分为两个生物型: 1型- - -副溶血弧菌,2型- - -溶藻弧菌,1型是致病 菌, 2型依细菌量的多少可能致病, 也可能不致病。 现在认为溶藻弧菌是一个独立的种, 对人类有致病作 用, 可引起肠道外感染。溶藻弧菌在海水中的比例为 2 2 . 1 7 %, 感染的概率高, 因

29、此, 不可低估该菌的致病 能力和致病作用。海鱼弧菌是近年新认识的病原菌 之一。美国疾病控制中心曾将这类弧菌称为E F - 5菌 群。近年认为, 该弧菌对人具有感染性, 因此被列为 致病性弧菌之一, 是“ 人鱼共患” 的病原菌 5。霍利斯 弧菌也是最近发现的一种新的病原性弧菌。其毒性 因素主要为肠毒素, 可引起肠道感染, 致病机制少见 报道。海洋中广泛存在着以上4种细菌, 在夏秋季 节, 极易从海水和鱼类或贝类中分离出来。 2. 3 优势细菌伤口感染实验 2. 3. 1 一般状况 实验组致伤浸泡后, 小鼠精神萎 靡、 呼吸急促、 弓背、 竖毛, 以副溶血弧菌组症状重, 持续时间长达7 2h, 其

30、次为溶藻弧菌组持续2 4、 4 8 h后接近伤前水平。 2. 3. 2 伤 口 情 况 实 验 组 伤 口 感 染 阳 性 率 达 1 0 0%, 副溶血弧菌组1 2h血液培养阳性。伤口分 泌物细菌与浸泡前细菌生化反应一致, 经核酸指纹 图分析证实。 2. 3. 3 病理组织学改变 实验组和阳性对照组伤 肢均表现有组织细胞变性、 肿胀、 蜂窝织炎等炎性改 变, 阴性对照组为阴性。 实验鼠死后多个脏器的组织压片培养均有浸泡 菌生长, 说明实验鼠曾发生菌血症, 可能因采样时间 和采血量等原因, 未能获得阳性血培养结果。海鱼 孤菌具有组织侵入力, 是人鱼共患病菌, 1 9 8 4年美 国休斯顿一名6

31、 1岁男性被鱼骨刺伤, 手肿胀变黑, 最后感染扩散到胸肩部, 并发D I C, 9d后死亡, 从手 部大疱液中分离出海鱼弧菌 6。本研究的4种实验 菌1 0 0%发生伤口感染, 以伤口红肿程度和分泌物 的多少排序副溶血弧菌和溶藻弧菌组最重。霍利斯 弧菌是4种弧菌中感染力较轻的弧菌, 它是2 0世纪 9 0年代中后期发现的病原性弧菌, 主要引起人类腹 泻。本实验发现该菌也可引起小鼠伤口感染, 该结 果与毒力实验结果一致。 2. 4 对2 3种抗生素敏感性分析 海洋弧菌对亚胺 培南、 奈替米星、 左氧沙星及头孢哌酮/舒巴坦敏感 率为1 0 0%, 对头孢他啶、 头孢噻肟、 庆大霉素、 环丙 沙星、

32、 复方新诺明、 四环素、 氯霉素、 替卡西林/克拉 维酸的敏感率在9 0. 4 5%9 7. 4 5%, 对头孢唑啉和 氨苄西林敏感率差, 仅为2 5. 4 8%和2 7. 3 9%。 海洋中革兰阳性球菌对氨苄西林、 复方新诺明、 万古霉素、 红霉素、 四环素、 庆大霉素6种抗菌药物 的敏感率为1 0 0%, 青霉素、 克拉霉素、 头孢唑啉、 环 丙沙星的敏感率6 7%。 海洋中肠杆菌对头孢他啶、 环丙沙星、 氨曲南、 亚胺培南、 阿米卡星、 庆大霉素、 左氧氟沙星、 奈替米 星的敏感率为1 0 0%, 头孢噻肟、 头孢哌酮、 哌拉西 林/他唑巴坦的敏感率为9 3. 7%, 四环素、 头孢唑

33、啉、 氨苄西林的敏感率较低, 均在6 5%以下。以氨 苄西林最低, 仅为2 5%。 海洋中非发酵菌对头孢他啶、 亚胺培南、 哌拉西 林、 他唑西林、 舒哌酮的敏感率高达1 0 0%, 庆大霉 素、 环丙沙星、 头孢哌酮、 阿米卡星、 左氧氟沙星、 奈 替米星的敏感率为9 0%, 对氨苄西林和头孢唑啉的 敏感率最低, 分别为2 0%和0。 参 考 文 献 1 T a r d yJ a c q u e n o dC,M a g o tM,P a t e lB K.D e s u l f o t o m a c u l u m h u l o p i l u ms p . n o v,ah a l

34、o p h i l i cs u l f a t e - r e d u c i n gb a c t e r i u mi s o - l a t e df r o mo i lp r o d u c t i o nf a c i l i t i e sJ.I n tJS y s tB a c t e r i o l, 1 9 9 8,4 8(P t2) :3 3 3 - 3 3 8. 2 B h u p a t h i r a j uVK,M c I n t e r n e y M J,W o e s e C R,e t a l. H a l o a n a e r o b i u m K

35、 u s h n e r is p,n o v .a no b l i g a t e l yh a l o p h i l i c, a n a e r o b i cb a c t e r i u mf r o mo i lb r i n eJ.I n tJS y s tB a c t e r i o l, 1 9 9 9,4 9(P t3) :9 5 3 - 9 6 0. 3 吴 玲, 张景隆, 倪语星, 等.我国沿海五省市致病性弧菌的分 布调查及病原学研究J.中华流行病学杂志,1 9 9 8,1 9(5) :3 0 1 . 4 刘秀梅, 邵守峰, 薛丰松.自腹泻病人、 海水、 海产品中

36、分离出麦氏孤 菌及其毒素原性的研究J.中国卫生检验杂志,1 9 9 8,8(6) :3 5 9 . 5 C l a r r i d g e J E,Z i g h e l b o i m - D a u mS . I s o l a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no f t w oh e m o l y t i cp h e n o t y p e s o fV i b r i od a m s e l aa s s o c i a t e dw i t ha f a t a l w o u n d i n f e c t i o nJ.JC l i nM i c r o b i o l,1 9 8 5,2 1(3) :3 0 2 - 3 0 6 . 6 杨正时.海鱼弧菌感染J.国外医学流行病学传染病学分 册,1 9 8 9, (2) :8 1 - 8 3. 收稿日期 2 0 0 5 - 0 6 - 2 7 修回日期 2 0 0 5 - 1 1 - 0 7 本文编辑 贾向春, 曹 静