三种染色方式下四种核酸染料的灵敏度比较.pdf

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1、成l o u m a 都lo f 聪M e 院d i e a l 学C o l l e 报s e 猢妇3 ( 1 ) Q 神M 。、I 论著 三种染色方式下四种核酸染料的灵敏度比较 刘阳1 ，杨淑霞1 ，李敏惠1 ，胡松1 ，任文娟2 ，邹 强1 。 ( 成都医学院1 科研中心；2 医学检验系0 6 级检验本科一班，成都6 1 0 0 6 3 ) 【摘要】目的探讨补镁对高脂高糖膳食诱导大鼠肥胖模型形成的影响及作用机制。使用染胶法、染样品 法及后染法比较溴化乙锭( E B ) 与3 种新型核酸染料G o l d V i e w n a1 1 、G o l d V i e w 及D N AG r

2、l 弛n 染色D I 、I A 的灵敏度。方 法在琼脂糖凝胶电泳中，分别在3 种染色方式下使用4 种核酸染料对凝胶中的D N A 进行染色，观察并分析电泳 结果。结果核酸染料比较结果：G o t d V i e w n al I 的灵敏度最高，D N AG i 既n 的灵敏度与E B 相当，C o l d V i e w 的灵敏 度略低于皿。染色方式比较结果：使用染胶法的灵敏度最高，后染法次之，染样品法最低。结论三种新型核酸 染料完全可以替代E B ，用于琼脂糖凝胶电泳D N A 染色。使用新型核酸染料建议采用染胶法染色D N A 。 【关键词】琼脂糖凝胶电泳；核酸染料；溴化乙锭 【中图分类号

3、】R 一3 3【文献标识码】A【文章编号】1 6 7 4 2 2 5 7 ( 2 0 0 8 ) 0 1 一0 0 2 0 一0 4 C o m p m - a t i v eA n a l y s i so ft h eS e n s i t i v i t yo fF o u rN u c l e i cA c i do y e sS t a i n i n gD N Ab yT h r e e S t a i n i n gM e t h o d s L I I IY a n g ，Y A N GS h u x i a I ，L Il V I i n h u i l ，删s D l l

4、g I ，l I E NW e n j u a n 2 ，Z O UQ i a , 1 9 1 ( 1 C e n t e ro f R e s e a r c ha n d 翻孵翻倒獭溉。2 C a s sO n eG r a d e2 0 0 6 ，删o y a b o r a t o r yM e d 豇n e ，C h e n g d uM e d a d 咖， 6 1 0 0 8 3 ，c h , , a ) A 蛔峨d ：O b j e c t i v eI “ oc o m p a r et h e 艇m s i t i v i t yo fe l h i d i mb z o

5、m i d e ( E B ) a n dt h r e et y p e so fn e wn u c l e i ca c i dd y e ：G o l d V i e w n a 1 1 ，G o l d V i e wa n dD N AG r e e ns t a i r 崦D N Ab yt h r e e 或a i l l i I l g 班吐h D d s ：p r e s t a i n i n gg e lm e t h o d ，p r e s t a i m gs a m p l em e t h o da n d p 0 曲咖洒l l gm e t t l o d

6、M e t h o d sF o u rn u c l e i ca c i dd y e s 慨r e e dt os t a i nD N AI e s p 蒯v e l yb yt h r e es t a i r l i I l gm e n t h o d si na g a r o g e l 越哟p l l o 地豳a n dt h er e s u l t s 讹陀o l 张n v e da n d 锄a l y z e d 1 蚓伍T h ec , o m p a 枷v er e s u l to fn u c l e i ca c i dd y e ：t h es e n

7、s i t i v i t y 矗 G o l d V i e w n aI I i sh i g h 耐o fa l l ；t h es e m i t l v i t i e so fD N AG r e e na n dE Bl n ei nt h es t l m ed e g 胱；t h es e n s i t i v i t y0 fC o l a V i e wi sl e s s I h a nE B T h ec o l n p m 6 v er e s u l to f 或“n gm e t h o d _ , T I l es e n s i t i v i t yo

8、f 曲岫D N Ab yp 髓血1 1 9 耐m e t h o di sh i g h 臼to ft h e l h r e ea n d 吨姻i I l ：i 1 1 9m e t h o di sh i 曲瞳t h a np l 精纽访i I l gs a m p l en 纠h D d 。C o l l d l l l 商O nT h e s et h r e et y p e so fn 哪n u d e i ca c i dd y e 锄 s u l 铽J l l l l ef o r 髓聃ag e n e r a la y et os t a i nD I 、I Ai na g

9、a r o g e ld e e t r o p h o r e m I ti sr e e o m 唑n d o dt o 峨胁“n i I l gg e lm e t h o d w h e nu s i n gn 鲫t y p eo fn u c l e i ca c i dd y e K e yw o 瞌：a g a m s eg e le l t h o p h o r e s i s ；n u c l e i ca c i d , i r e ；E t h i d i u mb m n i d e 溴化乙锭( E B ) 曾是琼脂糖凝胶电泳中使用 最为普遍的核酸染料，被广泛应用于观

10、察、检测核 酸，具有操作简单、快速及灵敏度高等特点 1 l 。但 收疆日期2 0 0 7 1 2 2 5修回日期2 0 0 8 一O l 一2 9 基金项目四川省教育厅资助项目( 2 0 0 6 A 1 3 4 ) 。成都医学院科 技基金项目( 0 6 劢0 0 6 0 0 1 ) 作者简介刘，日( 1 9 8 0 一) ，男。成都市人，项士，助教， 从事分子生物学研究。T e l ：0 2 8 6 8 2 8 9 憾3E 一皿丑：s e u i m 5 1 8 1 2 6 c l o m 。通讯作者E m a i l q i l m g 啦仞 g r n a i l c o n l 作为一种

11、强诱变剂，E B 具有高致癌性。废弃的E B 染液易污染环境，必须进行净化处理，给实验研究 人员带来诸多不便1 。 近年来陆续推出了多种新型核酸染料，比如 G o l d V i e w n a1 I ，G o l d V i e w ，D N AG r e e n 等。这些核酸 染料的灵敏度是否高于E B ，能否替代E B 广泛用于 D N A 的染色是人们关心的问题。 有研究显示E B 染色D N A 使用后染法比较 好2 。那么，新型核酸染料使用染胶法、后染法还 是染样品法的检测灵敏度最高，最实用呢? 万方数据 刘阳，等三种染色方式下四种核酸染料的灵敏度比较 2 1 本文在3 种染色方式

12、下分别使用4 种核酸染料 对凝胶中的D N A 进行染色。在3 种染色方式下比 较4 种核酸染料的灵敏度，为相关实验中选择合适 的核酸染料和染色方法提供参考。 1 材料与方法 1 1 主要试剂 电泳级琼脂糖购自西班牙B I O S C I E N C E 公司。 分子量标准D L1 50 0 0 + 20 0 0 购自T a k a r a 公司。E B 为S i g m a 公司产品，工作浓度为0 5t , e , n a 。G o l d V i e w n aI I 型核酸染料( 50 0 0 ) 购自北京博大泰克 生物基因技术有限责任公司，工作浓度为l G o l d V i e w

13、( 2 00 0 0 ) 为北京赛百盛基因技术有限 公司产品，工作浓度为1 ；D N AG r e e n ( 1 00 0 0 ) 为天泽基因工程有限公司产品，染胶与染样品 的工作浓度为1 ，后染的工作浓度为1 0 ；其余 试剂均为国产分析纯。 1 2 主要仪器 B i o P a d 电泳系统及凝胶成像系统。 1 3 方法 1 3 1 染胶法同时制备四块1 琼脂糖凝胶。在 凝胶凝固前，分别加入4 种染料。待凝胶冷却凝固 后，放入同一电泳槽中。于不同泳道中分别加入 0 5r i g 、1n g 、2n g 、5T l g 、1 0T l g 、2 0n g 及5 0I l g 的 D L1

14、50 0 0 + 20 0 0 使用5 V e r n 的电压进行电泳， 最后用凝胶成像系统观察拍照。 1 3 2 染样品法同时制备四块不加染料的l 琼 脂糖凝胶。待凝胶冷却凝固后，放入同一电泳槽 中。将分别将0 5n g 、1n g 、2n g 、5I l g 、1 0l 】g 、 2 0n 圾5 0n g 的D L1 50 0 0 + 20 0 0 与4 种染料混合， 避光1 0r a i n 然后于不同泳道中加入。使用5 V e r a 的电压进行电泳，最后用凝胶成像系统观察拍照。 1 3 3 后染法同时制备四块不加染料的1 琼脂 糖凝胶。待凝胶冷却凝固后，放入同一电泳槽中。 于不同泳道

15、中分别加人0 5n g 、1n g 、2n g 、5I l g 、 l Ol l g 、2 0l l g 及5 0I l g 的D L1 50 0 0 + 20 0 0 使用 5 V e r a 的电压进行电泳。电泳后将凝胶分别浸入用 1 T A E 稀释的4 种不同染液中。按照说明书要求， G o l d V i e w n a 、G o l d V i e w 、D N AG r e e n 及E B 避光染 色的时间分别为6 0r a i n 、3 0m i l l 、3 0r a i n 、3 0m i n D N AG r e e n 染色完毕后还需用1 T A E 脱色3 0r a

16、 i n 最后用凝胶成像系统观察拍照。 2 结果与分析 2 1 染胶法 染胶法的结果( 图1 ) 表明四种染料使用该法 的灵敏度均最高，其中G o l d V i e w n aI I 能检测到的 D N A 含量约为0 5n g ；E B 能检测到的D N A 含量约 为1n g ；G o l d V i e w 与D N AG r e e n 能检测到的D N A 含 量约为2 唱 图l使用染胶法比较4 种核酸染料染色D N A 的灵 敏度 使用D N AG r e e n ( A ) ，G o l dv i e w n aI I ( B ) ，G o l dv i e w ( C ) 与

17、E B ( D ) 染色不等量的D L1 5 0 0 0 + 2 0 0 0 每个泳道的 D N A 上样量为：( 1 ) 0 5 n g ，( 2 ) l n g ，( 3 ) 2 n g ，( 4 ) 5 n g ，( 5 ) l o n g ，( 6 ) 2 0 唱，a n d ( 7 ) S O n s 飚1C 哪叩盯萱s o n0 f t h es u m v t t yd f o u rm l d e 薹ca c i d a r e s 舳g D N Ab yp n 或醯晌唱窘e l m 删 D i l u t i o n so fD L1 5 0 0 0 + 2 0 0 0w e

18、 r es t a l l e db yD N AG r e e n ( A ) ，G o l dv i e w n aI I ( B ) ，G o Mv i e w ( C ) o rE l l ( D ) T h e D N Al o a dp e rl a n eW a S ：( 1 ) O 5 n g 。( 2 ) l n g ，( 3 ) 2 n s ， ( 4 ) 5 n g ，( 5 ) 1 0 n g ，( 6 ) 2 0 a s ，a n d ( 7 ) S O n s 2 2 后染法 后染法的结果( 图2 ) 表明四种染料使用该法 的灵敏度低于染胶法。其中G o l d V

19、 i e w n aI I 能检测到 的D N A 含量约为l a g ；E B 能检测到的D N A 含量约 为2n g ；D N AG r e e n 与C , o l d V i e w 能检测到的D N A 含 量约为5I l g 万方数据 成都医学院学报2 0 0 8 年3 月，3 ( I ) 图2使用后染法比较4 种核酸染料染色D N A 的灵 敏度 使用D N AG r e e n ( A ) ，G o l dv i e w n aI I ( B ) ，G o l dv i e w ( C ) 与皿( D ) 染色D L l 5 0 0 0 + 2 0 0 0 每个泳道的D N

20、A 上样 量为：( 1 ) O 5 n g ，( 2 ) l n g ，( 3 ) 2 n g ，( 4 ) 5 n g ，( 5 ) 1 0 n s ，( 6 ) 2 0 n s ，a n d ( 7 ) 5 0 1 1 9 r l g 2C m l e a r L s mo ft h es e n s i t i v i t y0 ff o u rn u c l e i ca d d d y e ss t a n 啦D N Ab yp o s t a a t a t u g 窖dm e t h o d D i l u t i o n s0 fD L l 5 0 0 0 + 2 0 0 0w

21、 e r es t a i n e db yD N AG r e e n ( A ) ， G o l dv i e w n aI I ( B ) 。G o l dv i e w ( C ) o rE B ( D ) T h eD N A l o a d p e rl a n eW a g ：( 1 ) 0 5 n g ，( 2 ) l n g ，( 3 ) 2 n g ，( 4 ) 5 n g ，( 5 ) l O n g ，( 6 ) 2 0 n g ，a n d ( 7 ) 5 0 g 2 3 染样品法 染样品法的结果( 图3 ) 表明四种染料使用该 法的灵敏度最低。其中G o l d V

22、 i e w n a1 I 能检测到的 D N A 含量约为2n g ；E B 与D N AG r e e n 能检测到的 D N A 含量约为5n g 、G o l d V i e w 能检测到的D N A 含 量约为1 0I l g 3 讨论 G o l d V i e w n a 是国内近年来推出的新型核酸染 料，与S Y B RG r e e nI 同属花青类染料。S Y B RG r e e n I 是几年前推出的一种高灵敏度【3 J g 不具有强致突 变性H J 的核酸染料，但由于其高昂的价格限制了它 的广泛使用。上述实验表明G o l d V i e w n a 的灵敏度 高，同

23、时具有花青类染料不具强致突变性的优点， 价格也比S Y B RG r e e nI 便宜数倍。虽然其稳定性不 如E B 3 且反复冻融效果变差，但只需要一2 0 。c 避 光保存和分装使用即可。 图3 使用染样品法比较4 种核酸染料染色D N A 的灵 敏度 使用D N AG r e e n ( A ) ，G o l dv i e w n aI I ( B ) ，G o l dv i e w ( c ) 与E B ( D ) 染色D L l 5 0 0 0 + 2 0 0 0 每个泳道的D N A 上样 量为：( 1 ) 0 5 n g ，( 2 ) l n g ，( 3 ) 2 n s ，(

24、 4 ) 5 n g ，( 5 ) 1 0 I l g ，( 6 ) 2 0 I l g ，a n d ( 7 ) 5 0 n s 飚3C l 聊咩l s 0 ft h es e 耐v l t y0 ff o u rm l e l e i ca c i d d y e ss t a h t u gD N Ab yl m s t a 啦s a m p l em e t h o d D i l u t i o mo fD L l 5 0 0 0 + 2 0 0 0w 呲s t a i n e db yD N AG r e e n ( A ) ， G o l dv i e w n a ( B ) ，

25、G o l dv i e w ( C ) 瞳E B ( D ) T h eD N A l o a d p e rl a n eW a g ：( 1 ) O 5 n g ，( 2 ) l n g ，( 3 ) 2 n g ，( 4 ) 5 n g ，( 5 ) 1 0 n s ，( 6 ) 2 0 n s ，a n d ( 7 ) 5 0 n g D N AG r e e n 是国内最近才推出的新型核酸染 料。它的灵敏度与E B 相当但背景略高于E B ，但该 染料的价格比G o l d V i e w n aI I 还便宜且稳定性比较 好，4 0 C 避光保存即可。 G o l d V i e

26、 w 是国内较早使用的新型核酸染料，它 的灵敏度比E B 略低且背景太高。不适合做微量的 D N A 检测。但该染料稳定性也比较好，4 。C 避光保 存即可，价格是这三种染料中最便宜的。 这些新型核酸染料均可替代E B 广泛使用，从 而减少大量使用E B 对人体的危害和对环境的污 染。使用者可以根据自己的需要选择合适的染料。 染色方法比较可以看出：染胶法的检测灵敏度 万方数据 刘阳，等三种染色方式下四种核酸染料的灵敏度比较 最高；后染法的检测灵敏次之；染样品法的检测灵 敏度最低，不适合做微量D N A 检测。此外，后染 法用于新型核酸染料很不合适。花青类染料用于后 染法需要将染料用1 的电泳缓

27、冲液稀释到聚丙烯 容器中，在避光条件下该溶液最多可以在2 4 小时 内被使用且染2 3 块凝胶后其灵敏度会降低，结 果略。这样的结果导致染料的巨大消耗，成本太 高。D N AG r e e n 用于后染的工作浓度为1 0 ，也就 是染料用量提高1 0 倍即成本增加1 0 倍，而且在染 色半小时后，由于其高背景还需要脱色半小时，延 长了实验时间。既往有研究推荐使用后染法的原因 是染色的D N A 带型平直不扭曲 2 | 。我们的实践经 验得出，电泳时控制合适的电压和上样量，新型核 酸染料使用染胶法也能达到同样效果。故使用新型 核酸染料染色D N A 时推荐采用染胶法。 参考文献： 1 L u n

28、 nG ，S q n o n e 功E t h i d i u mb r o m i d e ：d e 咖u 而帆a n dd e c o n t i - n a t i o no fs o l u t i o u a s J A I l a lB i o c h e m ，1 9 8 7 ，1 6 2 ( 2 ) ：4 5 3 4 5 8 2 王林果，蒋玲艳2 种核酸染色方法的比较 J 生物技术通 讯，2 0 0 6 ，1 1 ( 1 7 ) ：9 2 4 9 2 6 3 K a r i s e nF ，鼬棚瑚，N e s l a n d 删S Y B Rg r e e nID I 、I A

29、 砌i n i 鸣i n c l 陀a f l e 8t h ed d 蒯s e n s i t i v i t y0 fv i x u s e sb yp o l y m e a 蛳d l e i n 瑾曩c 妇 J JV i m iM 蛐，2 0 0 2 ，5 5 ( 1 ) ：1 5 3 1 5 6 4 蛳V L ，Id w l 循T E ，Y u eS c 0 唧赢o f S Y B R G 嗍In n c l e l e a c i d 耐s t a i n - , t 蹭m i d t ya n de * J a i d i u mb l m i d e - , t a 剃e i

30、t yi nt h e S e l m o n d l a m n m l i m lm l e r o m er e v e l “ B en l u t a l i o n 町( m t 髓t ) J 1 I h I t a tR e s ，2 0 0 2 ，4 3 9 ( 1 ) ：3 7 4 7 ( 上接第1 9 页) 间运动引起血浆中I L 一6 升高有关，而长时间运动本 身不直接引起体温升高，至少白天体温升高与动物活 动无直接关系，因为白天大鼠处于睡眠状态而很少活 动，体温却出现升高反应。值得注意的是本实验发 现，长时间的自愿运动训练能明显提高大鼠对I P S 致 热效应的敏感性。

31、这种现象是长时间运动训练导致动 物的体温调定点升高而引起的一种适应性反应，还是 体温调节功能的异常表现，值得进一步研究。 参考文献： 1 D i m l v l l oC A I n f 翻( 1 l ，F e v e r ，a n dh 嘈挪啦E lb d 0 舢P y 1 “ 0 1 咿1 8 - “ S o m ec I m p t 8 - I I I v ea l a g e a J E n d ml l e s ，2 0 0 4 ， l O ( 4 ) ：1 2 2 【2 】 F a nt t ，C o o kJ A b l o l e e u l a rM e d l m l i

32、n ，dE n d o t o x i nT o l e r m e e J E n d o t o x i nR e s ，2 0 0 4 ，1 0 ( 2 ) ：7 1 8 4 3 B e n t eK P M a r kF M m e l e d e r i v e dI n t d e u k i n 一6 一AP o m I i b l e L i n kb 时嗍吼e l e t a lt , l m e l e ，A d i p o e eT m i e ，L i v e r ，n n dB r a i n J B r a i nB d l a vI n m m ，2 0 0 5

33、，1 9 ( 5 ) ：3 7 1 3 7 6 r 4 J , m l o n i rII t ，s d Ij e d i l l gP ，0s l z u ws l 【i ，e ta M u s c l eC l l t l l r l l c o l i o n sI n d n e e i n m t e u l d n 一6m R N AP r o 血硎i nR a tS k e l e t a lM m e l e s J J 酬2 0 0 0 ，5 2 8 ( P 1 1 ) ：1 5 7 1 6 3 5 O s t r o w 出K ，P u 2 1 d eT ，A B pS ，

34、da f C h e m o k i n A r e 蒯i n a f t e rs h E 】【妇 J F a i rJA p p ln l 徊0 l ，2 0 0 1 ，斟 ( 3 ) ：2 4 4 2 4 5 6 刘艳黄元汛运动和营养补充对白细胞介素的影响 J 中国临床康复，2 0 0 6 ，1 0 ( 4 4 ) ：1 4 6 1 4 8 7 杨永录，方军A ! PV 受体阻断剂对昼光和暗光中正常大鼠体 温的影响 J 中国病理生理学杂志，砌，1 9 ( 1 ) - 8 3 8 6 8 S u o m oN ，S e l a t m d aS ，S l a i d o0 凸肌睁i nA

35、m b i e r aT e m p e i - a t u r e a tt h eO n s e to f 1 1 砣皿他粤岫R 髑弘舢嘲i nE x e l _ c i S e t r a i n e dB a t s J h 吐JB i o m e t e o r o l ，2 0 0 0 ，4 3 ( 4 ) ：1 6 9 1 7 1 9 李沧海，霍海如。姜廷良利用基因敲除小鼠研究发热机制 的进展 J 中国病理生理杂志，2 0 0 2 ，1 8 ( 9 ) ：11 5 1 一 l1 5 6 1 0 杨永录，扬镇，赖雁，等外周胆碱能神经在大鼠应激性体 温过高反应中的可能作用 J 中国病

36、理生理杂志，2 0 0 7 ， 2 3 ( 5 ) ：l0 1 7 一l0 1 8 。l 1 欢迎订阅成都医学院学报 成都医学院学报是经国家新闻出版署批准，四川省教育厅主管、成都医学院主办的面向国内外公 开发行的综合性医学学术期刊。国际刊号：I S S N l 6 7 4 2 2 5 7 ，国内刊号：C N5 1 1 7 0 5 R ，C O D E N ：C X Y ， H A M 。本刊已被中国学术期刊综合评价数据库、中文科技期刊数据库和中华首席医学网等多家 数据库全文收录。 本刊主要刊登基础医学、临床医学、预防医学、口腔医学、药学及相关领域的新理论、新成果、新技 术、新方法、新经验，适用于基础、临床、科研人员及相关医务工作者阅读。本刊为季刊，大1 6 开本， 逢季末出版。2 0 0 8 年每期定价l O 0 0 元，全年4 0 0 0 元份。本刊为自办发行，欲订阅者，请与本刊编辑 部联系。 万方数据