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1、兽类学报，2006，26（1） ：59 -63 Acta Theriologica Sinica 东北梅花鹿初级卵母细胞的超微结构 马泽芳1 张林媛2 郑丁团2 刘焕奇1 （1 山东莱阳农学院动物科技学院，莱阳， 265200） （2 东北林业大学野生动物资源学院，哈尔滨，150040） 摘要：研究东北梅花鹿初级卵母细胞发育的超微结构变化，目的是为探索东北梅花鹿初级卵母细胞的发育规律 提供组织学和形态学依据。本研究于 2003 年和 2004 年的6 月初到8 月末取3 只、9 月中旬到10 月初取4 只，共 计 7 只健康经产2 3 胎的成年东北梅花鹿卵巢；卵巢经2. 5%戊二醛固定液固定后
2、，切取约1mm3的卵巢皮质和 直径0. 5 1. 5 mm 及1. 5 3 mm 的卵泡作为电镜观察用材料；该材料经0. 1M pH7. 2 的 PBS 漂洗、1%锇酸固定、 不同浓度乙醇脱水后，再经 Epon812 和丙酮等量混合液浸透，最后用 Epon812 包埋制块，并用半薄切片机切成 0. 5 2 m 半薄切片；再经亚甲基兰 - 天青染色后，在光镜下进行卵泡分类和卵母细胞定位；将经定位的材 料用超薄切片机切成厚度为 700 800 的切片，经醋酸铀和柠檬酸铅双重染色后，用透射电镜观察、记录并照 相。观察时将卵泡依其直径大小、透明带的形成、卵泡腔的出现等分为原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和
3、三级 卵泡 4 类。研究结果表明，在原始卵泡阶段，卵母细胞为较规则的圆形，质膜与卵泡细胞膜紧密相贴，有时形 成桥粒，细胞器多分布于近核区，高尔基体不典型，线粒体多为圆形，嵴较少；在次级卵泡阶段，2 4 层的卵 泡细胞局部开始形成透明带，4 层以上时形成薄的透明带，微绒毛斜伸入透明带内，方向不规律；在直径为 0. 5 1. 5 mm 的三级卵泡阶段，卵母细胞的透明带增厚，各种细胞器在皮质区内数量较多，皮质区内高尔基体的数 目增多，粗面内质网明显减少；在直径为 1. 5 3 mm 的三级卵泡阶段，卵母细胞的透明带继续加厚，微绒毛缩 短变弯，开始从透明带退出，许多皮质颗粒开始排列在卵母细胞膜下。 关
4、键词：东北梅花鹿；初级卵母细胞；发育；超微结构 中图分类号：R322. 2 文献标识码：A 文章编号：1000 -1050（2006）01 -0059 -05 Ultrastructure of the primary oocyte in Northeast sika deer（Cervus nip- pon hortulorum） MA Zefang1，ZHANG Linyuan2，ZHENG Dingtuan2，LIU Huanqi1 （1 Faculty of Animal Science and Veterinary Medicine，Laiyang Agricultural Coll
5、ege，Laiyang， 265200，China） （2 College of Wildlife Resources，Northeast Forestry University，Harbin，150040，China） Abstract：Seven 4 to 5 years old female Skia deer（Cervus nippon hortulorum）both in their reproductive and non-repro- ductive season were used to study the ultrastructural changes of the prim
6、ary oocytes during their development by using trans- mission electron microscopy. The ovarian tissues were treated according the requirement for the examination via electron mi- croscope. The follicles were divided into 4 groups according to their development. The results showed that at the primordi
7、al follicle stage，the oocyte was round and its plasma membrane closely adhered to the follicle cells，most organelles located were near the nucleus，the Golgi complex was not typical，and most mitochondria with fewer cristae were round. At primary and secondary follicle stage，follicles locally formed z
8、ona pellucida when they consisted of 2 to 4 layers of follicle cells，ir- regular microvili on the oocyte were present in the zona pellucida. At teriary follicle stage with a diameter of 0. 5 mm to 1. 5 mm，the zona pellucida became thick， the number of rough endoplasmic reticulum decreased obviously，
9、 and all kinds of or- ganelles and the Golgi complex increased number in the cortex. At the 1. 5 mm to 3 mm diameter follicle stage，the zona pellucida kept on increasing in its thickness，the microvili on oocyte became short and curving and started to withdraw from the zona pellucida，and a large numb
10、er of cortical granules began to laid beneath the plasma membrane of the oocyte. Key words：Development；Primary oocyte；Sika deer（Cervus nippon hortulorum） ；Ultrastructure 基金项目：黑龙江省归国青年留学基金资助项目（LC03C14） 作者简介：马泽芳（1962 - ） ，男，博士，教授，从事野生动物饲养与繁殖研究. E - mail：mazefang163. com 收稿日期：2005 -01 -14； 修回日期：2005 -0
11、8 -24 兽 类 学 报26 卷 梅花鹿（Cervus nippon）属于偶蹄目、鹿科的 反刍动物，在我国有 6 个亚种：东北亚种、华南亚 种、四川亚种、山西亚种、台湾亚种、河北亚种 （马泽芳，2000） ，各地所驯养的主要是东北亚种。 现在我国的野生梅花鹿主要分布在东北地区，特别 是长白山一带，但为数很少。 关于鹿卵母细胞发育的组织学方面的研究，在 国内，葛明玉（1982）对雌性梅花鹿生殖器官进 行了解剖学观测，方肇清等（1983）用组织学方 法对雌性东北马鹿生殖器官进行了研究，霍金富等 （1986）对雌性白唇鹿生殖器官进行了组织学研 究；在国外，山内昭二等（1981）对日本鹿卵巢 发育与
12、季节性变化进行了组织学研究，Asher 等 （1997）用超声波扫描对马鹿的有腔卵泡发育进行 了研究，Mcleod 等（2001）对马鹿有腔卵泡在卵 泡阶段的发育变化进行了研究。到目前为止，国内 外还没有对东北梅花鹿的初级卵母细胞发育的超微 结构进行研究。为此，本文采用电镜对东北梅花鹿 卵巢中初级卵母细胞的超微结构变化进行观察研 究，为探索东北梅花鹿初级卵母细胞的发育规律提 供组织学和形态学依据。 1 材料与方法 1. 1 材料 在吉林省双阳鹿乡镇，于 2003 年和 2004 年的 6 月初到 8 月末取 3 只，9 月中旬到 10 月初取 4 只，共计 7 只年龄 4 5 周岁、健康经产
13、2 3 胎的 成年东北梅花鹿卵巢。 1. 2 方法 1. 2. 1 电镜材料处理 将经颈动脉放血处死的东北梅花鹿卵巢尽快放 入平皿，立刻用刀片切成两半，迅速滴加少量冷的 2. 5%戊二醛固定液，再用新刀片和剪刀进行切取， 电镜取材的具体部位：1）取卵巢的皮质约1 mm3； 2）将直径 0. 5 1. 5 mm 和 1. 5 3 mm 左右的卵泡 分别从卵巢中切下。以上样品固定于 2. 5% 戊二醛 固定液中，并在 4保存。 1. 2. 2 电镜材料的制作 在 2. 5%戊二醛磷酸缓冲液中固定至少 24 h， 将卵巢皮质用双面刀片切成小块，用 0. 1M pH7. 2 的 PBS 漂洗 30 m
14、in（10 min/ 次）后，用 1% 锇酸 固定 1 2 h，再用0. 1M pH7. 2 的 PBS 漂洗30 min （10 min/ 次） ，然后用不同浓度乙 醇（ 分 别 为 50%、60%、70%、80%、95%、100%） 脱水，用 Epon812 和丙酮等量混合液浸透 3 h，Epon812 浸 透 2 h，最后用 Epon812 包埋。修块后，用半薄切 片机切成 0. 5 2 m 半薄切片。经过亚甲基兰 天青染色后，在光镜下进行卵泡分类和卵母细胞 定位。定位修好的材料用超薄切片机切成厚度为 700 800 的切片。经醋酸铀和柠檬酸铅双重染色 后，用透射电镜观察、记录并照相。
15、1. 2. 3 卵泡的分类 在本实验中，将卵泡依其直径大小、透明带的 形成、卵泡腔的出现等分为以下 4 类：1）原始卵 泡：排列在卵巢皮质外周，由单层扁平的卵泡细胞 包围着卵母细胞；2）初级卵泡：单层立方卵泡细 胞包围着卵母细胞，卵泡膜尚未形成，也无卵泡 腔；3）次级卵泡：2 4 层卵泡细胞包裹卵母细 胞，卵泡细胞和卵母细胞的体积均较初级卵泡大， 透明带形成，包在卵母细胞周围，卵母细胞有微绒 毛伸入透明带内，但尚未形成卵泡腔；4）三级卵 泡：卵泡腔形成，并出现卵丘，同时形成颗粒细胞 层。 2 结果 2. 1 原始卵泡的卵母细胞 卵母细胞为较规则的圆形，由单层扁平的卵泡 细胞包围，表面光滑，卵母
16、细胞膜与卵泡细胞膜紧 密相贴，有的形成桥粒连接（图 1） 。 图 1 原始卵泡的卵母细胞 2000 Fig. 1 The oocytes of the primary follicle， 2000 细胞器多分布于近核区，高尔基体不典型，由 扁平囊和小泡组成，或以小管的形式分布于核周 区，分泌面朝向质膜。线粒体数量较多，在细胞质 中呈散在分布，多为圆形，嵴较少，呈板状，有的 线粒体没有嵴（图 2） 。粗面内质网丰富，与线粒 体相伴，表面有核糖体附着。胞质中还见有少量分 散的滑面内质网小泡，含有内容物的卵黄。一些类 06 1 期马泽芳等：东北梅花鹿初级卵母细胞的超微结构 似于皮质颗粒的圆形小体开始
17、出现，此阶段卵母细 胞有一些囊泡。 细胞核大，核偏向一侧，核质大部分均质，不 规则的小块染色质较少。核仁为染色质丝不规则缠 绕而形成的网状结构，网眼的电子密度低（图 3） ， 偏向核的一侧。 图 2 原始卵泡的卵母细胞线粒体（无脊）25000 Fig. 2 The mitochondria of the oocytes from primary follicle， 25000 图 3 原始卵泡卵母细胞的核仁 15000 Fig. 3 The nucleus of the oocytes from primary follicle， 15000 2. 2 初级卵泡的卵母细胞 各种细胞器在卵母细胞
18、质中均匀分布。线粒体 数目增多，其基质电子密度增大（图 4） 。高尔基 体有的移向质膜下，形态趋于典型（图 5） 。皮质 颗粒、滑面内质网小泡及有界膜囊泡数目都增多。 在滑面内质网小泡之间，常见中等密度的皮质颗 粒。粗面内质网也增多。 此期细胞核仍位于卵母细胞一侧，核质变得更 均匀，很少见到染色质块。核仁偏位，核仁结构同 原始卵泡的卵母细胞，无明显变化。核孔明显，数 量较多，核内外有物质交换的迹象（图6） 。 2. 3 次级卵泡的卵母细胞 当卵母细胞外包有 2 4 层的卵泡细胞时，有 些卵母细胞与卵泡细胞之间局部开始出现透明带物 质，卵母细胞表面局部产生短而粗的微绒毛，微绒 毛伸入透明带内方向
19、不规律，透明带中微绒毛突起 的根部和卵母细胞内的高尔基体联系密切，没有透 明带的地方卵泡细胞和卵母细胞仍然紧密联系着。 当卵母细胞有4 层以上卵泡细胞包围时，已形成一 层薄而完整的透明带物质。以后随着透明带明显增 厚，微绒毛很多且长，垂直插入透明带中（图 7） 。 图 4 卵母细胞线粒体（电子密度增大嵴出现）15000 Fig. 4 The mitochondria of the oocytes， 15000 图 5 卵母细胞高尔基体 16500 Fig. 5 Golgi complex of the oocytes， 16500 图 6 卵母细胞核膜、核孔 43000 Fig.6 The n
20、ucleus membrane and nucleus orifice of the oocytes， 43000 16 兽 类 学 报26 卷 图 7 卵母细胞透明带及微绒毛 15000 Fig. 7 The zona pellucida and microvili of the oocytes， 15000 2. 4 三级卵泡的卵母细胞 2. 4. 1 直径为 0. 5 1. 5 mm 的卵母细胞 透明带比上一阶段有所增厚，许多卵泡细胞突 起穿过透明带，达到卵母细胞表面，其末端膨大嵌 入卵母细胞膜形成的与之相适应的凹陷中，并以桥 粒样的结构相连接。垂直伸入透明带中的微绒毛开 始变粗，比较密
21、集。 各种细胞器在胞质中散在分布，但在皮质区内 数量较多，细胞核周围细胞器少，皮质区内高尔基 体的数目增多，但结构仍不是很典型。线粒体聚集 成行，其电子密度增加。粗面内质网明显减少，滑 面内质网和囊泡数量增多，囊泡和线粒体关系密 切，形成环板层（图 8） 。皮质颗粒增多，多数皮 质颗粒从皮质区深部迁到皮质区外的浅部，但有的 仍成团分布，许多开始移到细胞膜下。皮质区内偶 尔见到少量的脂滴。 图 8 卵母细胞环层板 20000 Fig. 8 The board of circular layer of the oocytes， 20000 2. 4. 2 直径为 1. 5 3 mm 的卵母细胞 此
22、阶段的透明带继续加厚，微绒毛缩短变弯， 生长方向也变得没有规律，开始从透明带退出 （图 9） ，卵泡细胞突起仍然以类桥粒样结构与卵母 细胞膜凹陷相联接（图 10） 。 图 9 卵母细胞微绒毛缩短变粗 20000 Fig. 9 The shortening and thickening microvili of the oocytes ， 20000 图 10 卵母细胞透明带突起的类桥粒连接 16500 Fig. 10 The connecting desmosome of the protrusion from zona pellucida of the oocytes， 16500 胞质中大
23、多数的细胞器都分布在皮质区， 中央 区细胞器少， 线粒体、 高尔基体和滑面内质网等细胞 器集中在皮质区 （图 11） 。有少数的线粒体变为带 帽状， 这种线粒体一端侧面双膜凹陷， 形成一个与胞 质相通的外腔， 好像是线粒体的一端形成一帽状结 构， 这种线粒体电子密度很高， 大小不一， 形态差别 大。高尔基体数目较多， 高尔基体典型 （图12） 。 图 11 透明带腔隙 4200 Fig. 11 The lacuna of the zona Pellucida， 4200 26 1 期马泽芳等：东北梅花鹿初级卵母细胞的超微结构 图 12 卵母细胞高尔基体 16500 Fig. 12 Golgi
24、complex of the oocytes， 16500 滑面内质网常伸入线粒体外腔中，又往往与皮 质颗粒相伴。滑面内质网囊泡的数目增多，有的囊 泡内充满电子密度样物质，卵黄泡继续增多，位于 皮质区内，其主要成分为圆形小泡。皮质颗粒有的 散在分布，有的在皮质区成团分布，还有的已经迁 到质膜下。胞质中出现大量的脂滴，脂滴数量增 多，周围包着滑面内质网。许多皮质颗粒开始排列 在卵母细胞膜下。 细胞核靠近质膜，核仁内纤维中心更多，核仁 中低电子密度的区域直径增大。 3 讨论 Fair 等 （1997） 提出卵母细胞胞质也具有与精子 同样的获能现象， 在超微结构上主要表现为， 细胞器 结构重组， 胞
25、质内容物的改变等一系列复杂过程。 研究结果表明卵母细胞生长与许多细胞质中细胞器 的重定位和调整有关， 也与一些特殊结构如透明带 和皮质颗粒的发展进程有关。在东北梅花鹿卵母细 胞发育早期， 大多数细胞器分布在生发泡周围， 随着 卵母细胞生长， 高尔基体、 线粒体、 内质网、 皮质颗粒 等细胞器数量不断增加， 且向皮质区迁移， 在细胞中 央形成不含细胞器的 “透明区” ， 这在牛等其它动物 中也存在 （孙青原和秦鹏春， 1989） 。 线粒体在细胞代谢中起主导作用，其形态、数 量及分布的变化与细胞的代谢水平、增殖及分化密 切相关。东北梅花鹿大的有腔卵泡中也有少量帽状 线粒体，这可能是细胞内代谢旺盛
26、的标志。其它如 牛、山羊、绵羊等动物都存在此种线粒体，孙青原 和秦鹏舂（1989）认为这是反刍兽类卵母细胞共 有的特征，卵母细胞生长期线粒体的外移及增殖为 细胞内蛋白质的合成及分泌、卵母细胞及卵泡细胞 间的交换等活动提供能量，线粒体位置的变化使胞 质内的不同区域具有不同的 ATP 浓度，在静止期 卵母细胞中，线粒体聚集在细胞核的周围，可为局 部胞质内的翻译及核的转录提供较高的能量水平。 皮质颗粒是卵母细胞所特有的细胞器，卵母细 胞成熟时其在质膜下呈线状排列，这对于保证单精 入卵及胚胎正常发育具有重要意义。因而皮质颗粒 增加及沿质膜成线形分布被认为是卵母细胞成熟的 标志之一。东北梅花鹿的皮质颗粒
27、随着卵母细胞的 发育不断增多，而且向皮质区迁移，最后位于卵母 细胞膜下，这与牛、羊等情况类似（孙青原和秦 鹏春，1989；谭景和等，1992） 。 微绒毛是一种特化的结构，与细胞的物质交换 等功能有关。微绒毛有两个作用：一是增加细胞的 表面积，另外可以伸缩和摆动，它的运动可能对细 胞表面的液体起搅动作用，以利于物质的吸收。卵 母细胞通过微绒毛与卵泡细胞发生联系，从而进行 物质和信息传递。东北梅花鹿卵母细胞发育过程中 胞质膜的结构变化，由原始卵泡没有微绒毛，到 2 4 层次级卵泡时开始出现短而粗的微绒毛，逐渐 到 4 层以上次级卵泡时，微绒毛开始变得细长，到 0. 5 1. 5 mm 的三级卵泡
28、时，有的微绒毛开始变少 变粗，1. 5 3 mm 三级卵泡时，微绒毛开始缩短变 弯，有部分微绒毛已经退出透明带。 参考文献： Asher G W， Scott I C， ONeill K T， Smith J F， Inskeep E K， Townsend E C. 1997. Ultrasonographic monitoring of antral follicle develop- ment in red deer（Cervus elaphus） . Journal of Reproduction and Fertility，111：91 -99. Fair T，Hulshof S C
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