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1、作者单位： !“#$ 北京， 海军总医院儿科 基础实验诊断研究 人神经干细胞异种移植示踪检测分析 尹国才% 栾佐% 胡晓红% 屈素青% 张晓鸥% 卜笑松% 钱阳明 % %【摘要】 % 目的% 摸索人胎脑神经干细胞 （） 的特异性免疫反应检测及 345+1 的荧光观察。结果% 体外培养 获得典型人胎脑神经干细胞球。345+1 能高效标记神经干细胞， 标记的阳性率 ?， 标记分子可 伴随干细胞增殖、 迁移和分化， 但不进入细胞突起， 仅位于胞体。:0./7 检测结果显示： 在大脑皮层的颗粒层有阳性反应细胞， 彼此间有 连接发生。结论% 可用 345+1 对体外培养获得的 可用于检测移植细胞的成神经
2、元分化及神经元间发生的连接。 9;2 A*)=*(8 ，1; #)BC $;2;=)D /*E*23 FGGGHI，J1*2) 【560( * ;P;+* QR; SG- 8-,2 .B 98J.8F, .:） ） ，.? 8H 等） 因插入到细胞 G4C 分子内， 而影响细胞生命活动， 故用于示踪干细胞命 运评价不理想。本研究采用一种被广泛用于血液细 胞标记的 ;? 荧光素标记 +4AB 细胞膜， 并与常 用免疫组化法对比进行体外培养和新生鼠缺血缺氧 性脑病模型的移植研究， 以分析 +4AB 细胞命运， 探 索简易可靠的示踪检测方法。 材料和方法 I/ 试剂和仪器： IJ KK 小鼠抗人神经
3、元标志神 经丝 +45 单抗 （货号： LCMNOP） 和 IJ NK 抗人细胞 核特异性抗体 C? 试剂盒 （A$-, 公司） 。AQ2?4 型动物脑微型立体定 位仪 （日本 4CQHA=HRS 公司） 。其余试剂和设备参 考文献 I。 / +4AB 的培养与鉴定： 取孕龄 IP 周流产人胚 胎前脑组织， 无菌条件下， 机械分散并过细胞筛制备 成细胞悬液， 台盼蓝拒染法计数活细胞量。接种 0N 培养瓶， 活细胞终浓度为 N T IKNU ,!。所用培 养液为添加 SR5 （K ? 标记： 按 ;? 试剂盒说明 书操作。取 ? 6 的培养物， 分散细胞， 按程序标记细 胞后， 用含 SR5 V
4、 5R5的 4培养液悬浮细胞， 荧光 和相差倒置显微镜下分别观察标记细胞和总细胞， 计数标记细胞百分比。继续培养标记细胞， 观察标 记细胞球的形成和增大。 P/ 新生鼠缺氧缺血性脑病模型的制作与细胞 脑室途径移植： IP 只生后 Y 6 同窝 AG 大鼠， 体重 IX IY -， 模型制作参考文献 。死亡 只， 存活 率为 N。按移植细胞情况， 将 I 只模型鼠分为 X 组： 细胞未标记的免疫组化染色组 （P 只） 、 ;? 标记组 （P 只） 和不移植细胞的阴性对照组 （P 只） 。 损伤后第 P 天 （出生后第 II 天） ， 幼鼠体重 IO P -， 在微型立体定向仪上用微量注射器穿刺左
5、侧 脑室， 植入细胞球， 细胞量约为 N T IKNU 只。细胞悬 浮液为含人血浆纤维连接蛋白 （5 a I/ K ,， LW aI/ K aI/ X ,， Gb aX/ N aP/ N ,。 N/ 移植细胞示踪检测： 在移植术后P、 Y、 IP 6 活 体心脏灌注 P 多聚甲醛固定鼠脑， 分别行冠状或 矢状 方 式 对 全 脑 制 作 石 蜡 切 片， 片 厚 K !,。 ;? 标记组的切片直接荧光显微镜观察， 脑组织 中有红色荧光的细胞为阳性。免疫组化染色组切片 用间接荧光免疫染色， 切片经微波沸水浴处理 N Y ,$ V 、 45 V 、 R!B V ， 表明细胞球能分化成神经元、 星形
6、胶质细胞和少突 胶质细胞。用 ;? 标记体外培养 ? 6 小神经干 细胞集 落 （ 数 十 个 细 胞 构 成） ， 其 标 记 阳 性 率 cON。 继续培养， 能形成新的 ;? V 细胞球， 球 体不断增大 （图 IM） ， 体外观察 X? 6， 神经球仍保持 明显的荧光阳性。诱导分化培养后， 可观察到标记 和未标记细胞球都向外周移出细胞， 迁移的细胞生 NN中华检验医学杂志 KK? 年 X 月第 O 卷第 X 期E B+$)， 黄绿色） 分布在受 体鼠大脑额叶皮层； 0： 移植后 , -，*89:6)， 黄绿色） 分布在受体鼠大 脑海马区；)： 移植后 ? -， 受体 鼠大脑皮层颗粒层内
7、移植细胞 的成神经元分化， 红色 （=)） 细胞为 *89:6;$， %“$： “+$!“;$D 1(678. +;， 1“,： %*$!%*+D “尹国才， 栾佐， 闫凤青， 等D 纤维连接蛋白促进人神经球内干细 胞的迁移D 中华神经医学杂志， ),-， “： +;)!+;$D -8AB H#，53B87 UV，(6OO/8. 5W，BA 8ID=2J76.B?A2. N76/6ABF F7X2X8I 8.9 /2K78A26. 6O N72/87R .B78I FAB/ ?BIIF A78.FNI8.AB9 2.A6 A3B A78/8A2?8IIR 2.S7B9 /6FB J782.D #BII 78.FNI8.A8A， ),)， %： )+1!);-D * 卷第 1 期 #32. E L8J HB9， H87?3 ),*，6I );，46 1