中性粒细胞凋亡延迟及细胞因子释放在体外循环全身炎性反应中的作用.pdf

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1、塑j t 医堑至塑生鱼旦筮塑鲞箜鱼塑堕殛丛些趔鱼塑堂：地2 哩：! 尘垫：奠! ： 3 讨论 组蛋白去乙酰化酶( H D A C ) 抑制染色质结构异常调节所致 的髓系分化相关基因表达，是急性髓系白血病发病的重要因素 之一。已有多种H D A C 抑制剂已经进入I 期或期临床试验， 在治疗血液系统恶性肿瘤和实体瘤方面都有令人鼓舞的相关 报道。V I A 一直以来用于癫痫的治疗，毒副作用较小。它是短 链脂肪酸的一种，也属于H D A C 抑制剂。但是，V P A 用于白血 病治疗的临床试验笔者还未见报道，而且V P A 治疗白血病的作 用机制及其临床疗效尚待进一步研究。 为了进一步明确V P A

2、 的抗白血病作用，为V P A 应用于临 床治疗白血病提供有力的证据，本研究以I ( 5 6 2 细胞为靶细胞， 观察V P A 对K 5 6 2 细胞的影响。已另文报道高浓度剂量V P A 对K 5 6 2 细胞增殖抑制的的机制是通过诱导细胞凋亡实现的， 而本研究证实低浓度剂量V P A 可以诱导l ( 5 6 2 细胞向树突状细 7 4 5 胞分化的倾向，C D I a 、H I A - D R 、c 瓯、c 、c 及c D 8 6 表达均有 所增加，而且诱导的树突状细胞具有较强的抗原呈递功能和诱 导特异性细胞毒性T 淋巴细胞杀伤活性作用。因为小剂量 V P A 对白血病细胞有诱导分化作用

3、，所以V P A 有望成为一种高 效低毒的抗白血病药物。 参考文献 1 陈勤奋，谢彦晖，陈彤，等r h G M C S F 联合r h I L - 4 诱导慢性粒胞白血 病来源的树突状细胞上海医学，2 0 0 2 ，2 5 ：2 1 2 3 2 张庆九，李春晖，焦保华树突状细胞的特性及应用河北医药，2 0 0 4 ， 2 6 ：1 7 2 1 7 4 3 盂东梅，赵春亭，吴少玲，等急性髓细胞自血病细胞来源的树突细 胞的诱导及功能研究中国实验血液学杂志，2 0 0 4 ，1 2 ：6 2 5 - 6 3 1 4 严匡华，尤胜国，卞寿庚，等细胞因子体外诱导急性髓系白血病细 胞分化为树突状细胞中华血

4、液学杂志。2 0 0 3 ，2 4 ：3 6 5 3 6 8 ( 收稿日期：2 0 0 7 1 0 0 3 ) 中性粒细胞凋亡延迟及细胞因子释放在 体外循环全身炎性反应中的作用 赵志勇高永谦阎志军冯光兴何荣海于新江 【摘要】 目的探讨中性粒细胞( P M N ) 凋亡延迟和细胞因子释放对体外循环全身炎性反应的影响和 意义。方法3 0 例行体外循环( C P B ) 心脏直视手术病人分别于麻醉诱导后、C P B 结束时、C P B 后4h 、C P B 后 8h 、术后第ld 晨5 个时点采集静脉血。用全血细胞计数仪测定P M N 数量，流式细胞仪测定P M N 凋亡率变 化，E L I S A

5、 法测定血浆白介素6 ( I L - 6 ) 、白介素8 ( I L - 8 ) 浓度变化。结果P M N 凋亡率在C P B 期间明显降低， 与c P B 时间呈负相关。P M N 数量、I I ，6 、I L 8 血浆浓度在C P B 期间明显升高，与其凋亡率呈负相关，与C P B 时间呈正相关。结论C P B 期间细胞因子，6 、，8 释放增多导致P M N 的凋亡延迟，P M N 数量增加、生存 周期延长，从而加剧炎性反应扩散和组织损伤。 【关键词】中性粒细胞；细胞凋亡；细胞因子；体外循环；炎性反应 I n f l u e n c ea n ds i 印施c a I 髓o fn e u

6、 t r o p l l i la p o p t o s i sa n d 触a n e sO i ls y s t e n | l i ci n f l a n m m t o r yr e a c t i o nt o a I r d i 0 I 阻l l 】m a 硇I r yb y p a s sZ H A O Z h i y o n g ，G A O Y o n g q i a n ，Y A N z h i j 矾，da 1 D 印也，蕾m e ，l to f C a r d i a c S u r g e r y ，H e l d G e n e r a lH o s p i t

7、 a l ，S h i j i a z h u a n g0 5 0 0 5 1 【A b s t r a c t 】O b j e c t i v eT oi n v e s t i g a t et h ei n f l u e n c ea n ds i g n i f i c a n c eo fp o l y 啪甲h o n u c l e 盯n e u t r o p h i l ( P M N ) a p o p t o s i sa n dc y t o k i n e so ns y s t e m i ci n f l a m m a t o r yr e s p o n

8、s et oc a r d i o p u l m o n a r yb y p a s s ( C P B ) M e t h o d sT h e yp a t i e n t s u n d e r g o i n go p e nh e a r ts u r g e r yw i t h C P Bw e r es t u d i e d B l o o ds 舢p l 鹤w e r et a k e nf r o mt h ec e n t r a lv e r l o u 8l i n e p r e o p e r a t i v e l y ，a tt h et e r m i

9、 n a t i o no fC P B ，a t4ha n d8ha f t e rt h et e r m i n a t i o no fC P B ，a n do nt h ef r i s tm o m i n go f p o s t o p e r a t i o n T h en e u t r o p h i lc o u n t sw e r ep e r f o r m e db yb l o o dc e l lc o u n t e r N e u t r o p h i l sw e r ei s o l a t e d ，a n di t sa p o p t o

10、 s i s w a se v a l u a t e db yf l o wc y t o m e t r y T h ep l a s m ac o n c e n t r a t i o no fi n t e d e u k i n 一6 ( I L 6 ) a n di n t e d e u k i n - 8 ( I L 8 ) w e r e d e t e r m i n e db ye n z y m e - l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y s R e s u l t sT h em t e so fP M Na

11、p o p t o s i sw e r es i g n i f i c a n t l yr e d u c e d d u r i n gC P Bu n t i lt h ef r i s tm o r n i n go fp o s t o p e r a t i o n ，a n dt h er a t e a t4ha f t e rC P Bn e g a t i v e l yc o r r e l a t e dw i t ht h ed u r a t i o n o fC P B T h eP M Nc o u n t s ，t h ep l a s m al e v

12、e l so fI L - 6a n dI b 8w e r em a r k e d l yi n c r e a s e dd u r i n gC P B T h ep e a kl e v e l s o f I D 6a n dI L - 8c o r r e l a t e di n v e r s e l yw i t hP M Na p o p t o s i sr a t e ，a n dc o r r e l a t e d p o s i t i v e l y w i t ht h ed u r a t i o no fC P B C o n c l u s i o n

13、C y t o k i n e si n c r e a s es i g n i f i c a n t l yd u r i n ga n da f t e rC P B ，a n ds u p p r e s sP M Na p o p t o s i s ，i n c r e a s eP M Nc o u n t ， p r o l o n gt h ef u n c t i o n a ll i f e s p a no fP M N a n dp o t e n t i a t ea n dp r o l o n gt h es y s t e m i ci n f l a m

14、m a t i o nr e s p o n s ei n d u c e db yC P B 【K e yw o r d s 】n e u t r o p h i l ；a p o p t o s i s ；c ) ，t o k i n e ；c a r d i o p u l m o n a r yb y p a s s ；s y s t e m i ci n f l a m m a t o r yr e a c t i o n 作者单位：0 5 0 0 5 1 石家庄市，河北省人民医院心脏外科 论著 7 4 6 迥j I 匿垫2 坚生曼旦箍垫鲞箜鱼塑旦堂丛型世! 删：塑至坚：! 堕垫：塑

15、壁： 中性粒细胞( p o l y m o r p h o n u c l e a rr 跏叫，P M N ) 是炎性应的P B S 液( 0 0 1m m o l L ，p H7 4 ) 将P M N 制成l 1 旷I I | l 细胞 重要标志，在炎症的发生、发展和转归中起着重要作用。体外悬液待测，经涂片瑞氏染色分类，P M N 纯度 9 8 ，涂片台盼蓝 循环( e a r d i o p u l m o n a r yb y p a s s ，c P B ) 导致体内环境发生巨大变化，染色活细胞 9 5 。 P M N 凋亡及细胞因子释放亦发生改变，从而对全身炎性反应产1 4 指标检测

16、 生巨大影响。因此，选择我科行体外循环心脏直视手术的3 0 1 4 1P M N 数量测定：取外周全血0 1n d 用s y 嗽F - 8 2 0 型全 例患者，观察其围C P B 期P M N 数量、凋亡率、I L - 6 、I L - 8 水平的血细胞计数仪( E l 本T O A 公司) 测得P M N 数量和红细胞压积 变化，以了解P M N 凋亡改变及细胞因子的产生与C P B 全身炎( H e t ) 。由于C P B 期间血液稀释因素，P M N 数量由H e r 按如下 性反应之间的关系。公式进行校正：P M N 校正值= P M N 测得值( C P B 前H c t 值H

17、c t 1 资料与方法 测得值) 。 1 1 一般资料本组3 0 例中，男1 4 例，女1 6 例；年龄1 5 7 1 4 2P M N 凋亡率检测：取l 1 驴m lP M N 悬液Im l ，加入 岁，平均年龄( 2 0 1 9 ) 岁；体重1 0 6 3k g ，平均体重( 3 3 2 4 ) k g 。 2 0 阻R N a s e A 酶，3 7 水浴3 0m i n ，加入含O 1 T r i 姗X1 0 0 的 其中行室间隔缺损修补术9 例，冠状动脉旁路移植术6 例，二 碘化丙啶( P I ) 染液( 美国S i g m a 公司) 0 5 | I l l 混匀。至4 q C 避

18、光静 尖瓣置换术6 例，法四根治术5 例，主动脉瓣置换术4 例。无系置3 0m i n ，用F A C SV m t a g e 流式细胞仪( 美国B e e k t o n - D i c k i n s o n 统性疾病，近1 月内未应用过抗生素及对白细胞有细胞毒性的公司) ，光源为4 8 8n l n 的氩离子激光，上机前先以标准微球调整 药物( 如非甾体类药物) 或免疫抑制剂。仪器的变异系数 4 8 0s 。动脉流量8 0 一 较C P B 前明显降低( P O 0 5 、P 0 0 1 ) ，于术后第l 天晨恢 1 2 0m l k s 。m i n ，术中维持血压4 0 6 0r

19、a i nH g ( 1t o n in s = 复C P B 前水平。凋亡率与C P B 时间呈负相关( r = 0 4 5 2 1 ，P 0 1 3 3k P a ) 。血液中度稀释，浅中度降温。S t T h o m a s 液间断灌 O 0 5 ) ，见表l 。 注。停机后按1 ：l 用量以鱼精蛋白中和体内肝素。术中不用2 2P M N 数量P M N 数量在C P B 期间明显升高，并持续升高 激素、抑肽酶及全血，以免影响结果。C P B 时间为5 2 4 9 一 至术后第ld 晨( 与C P B 前相比P 0 0 1o 数量与其凋亡率呈 1 0 1 6 1m i n ，平均( 7

20、9 2 1 ) m i n o 负相关( r = 0 4 5 2 8 ，P 0 0 5 ) ，见表1 。 1 3 标本采集与处理分别于麻醉诱导后、C P B 结束时、C P B 2 3I L - 6 水平，6 的血浆水平在C P B 结束时、C P B 结束后4 、 后4h 、C P B 后8h 、术后第l 天晨5 个时点取外周静脉血标本8h 均较C P B 前明显增高( P 0 0 5 、P O 0 1 ) ，于术后第1d 4 “，加肝素抗凝( 血：肝素= 9 ：1 ) ，肝素化血不抗凝，lh 内进行晨恢复C P B 前水平。峰值水平与凋亡率呈负相关( r = 标本处理。 O 5 4 2 7

21、 ，P 0 0 1 ) ，并与C P B 时间呈正相关( r = 0 5 8 1 9 。P 用2 0 P R - 5 2 D 型低温高速离心机( 日本H f f A C H I 公司) 于 O 0 1 ) ，见表l 。 4 。C ，20 0 0 转m i n 离心1 0 m i n ，取血浆置于一8 0 。C 保存待测。取 2 4I L - 8 水平I D 8 的释放水平在C P B 结束时、C P B 结束后4 、 白细胞层和部分血浆与等量P B S 液混合，置于2r I l l 淋巴细胞分8h 均显著升高( 与C P B 前相比P O 0 5 、P 0 0 1 ) ，于术后第 离液( 北京

22、华美公司) 面上。于4 ，20 0 0 转m i n 离心2 0m i n ，弃 1 天晨恢复C P B 前水平。峰值水平与凋亡率呈负相关( r = 上清及淋巴细胞层，沉淀物即为P M N 。若混有较多的红细胞可 O 6 4 1 2 ，P 0 0 5 ) ，并与C P B 时间呈正相关( r ：O 5 6 9 4 ，P 用低渗蒸馏水去除红细胞。 O 0 5 ) 。见表l 。 表1 不同时点P M N 数、凋亡率、孙B a 、I L - 6 和I L - 8 的变化i ， 项目C P B 前C P B 结束时c P B 结束后4hc P B 结束后8h术后第1 天 P M N 数量( l 护L

23、) 3 7 1 4 7 2 4 7 1 1 0 4 8 9 5 , 4 - 3 3 1 2 84 - 3 9 P M N 凋亡率( ) 5 6 4 13 4 2 7 1 8 1 2 2 6 1 8 4 24 - 3 4 I L - 6 ( 耐m 1 ) 2 3 9 5 1 5 3 74 - 1 2 5 。1 4 8 3 4 - 3 0 2 。1 0 2 6 2 9 3 3 8 9 4 - 1 9 8 坠! l 匣型21 竺：! ：! ! ：! ! ! ：! ! ! ! ：! ：垄：! ：丝：! ：! ! ! ：! ! 丝：! ：! 竺：! ! ! ! ：! 注：与C P B 前比较P 0 oP

24、 0 0 1 3 讨论 C P B 中的许多因素如血液与C P B 管道直接接触、手术创 伤、器官缺血再灌注、术中温度改变等均可引起全身复杂的炎 性反应引。而促炎因子( 如I L - 6 、I L - 8 ) 增多和炎性细胞( 如 P M N 、巨噬细胞) 激活，是患者发生全身炎性反应的主要原 因。P M N 是主要的炎性损伤效应细胞其损伤效应主要通过 塑j 量匡药垫堕玺鱼旦筮塑鲞笙鱼塑坐鲤丛鲤趔删：磐至塑：型垫： 呼吸爆发和脱颗粒而实现。P M I 、I 凋亡被认为是炎症消散的关 键，是机体自我限制炎性反应的一种重要方式H J J ，但P M N 凋 亡非常容易被环境信号所调节改变。本研究结

25、果显示I N N 凋 亡于C P B 开始后明显降低，至术后第l 天晨恢复术前水平：而 其数量从C P B 前到C P B 结束后8h 与凋亡率呈负相关关系，且 P I V I N 凋亡率与C P B 持续时间呈负相关，这与C h e l l o 等1 的实验 结果相同。说明C P B 使P M b l 生存的循环环境发生巨大变化。 导致其凋亡受到抑制，受抑严重程度与C P B 持续时间呈正比。 凋亡受抑使P M N 不能按正常程序死亡和被及时清除，其生命 功能周期延长，数量增加，产生并释放多种炎性介质，使炎性反 应迁延并放大，组织损伤加重盯】。随着C P B 的结束，凋亡抑制 因素解除，P

26、姗凋亡率逐渐恢复C P B 前水平。 术后第l 天晨P M N 凋亡率基本恢复C P B 前水平，而其数 目却持续增多达到高峰，可能是由于机体对全身炎性反应发生 应激反应，是P M N 动员以及骨髓释放大量未成熟P N N 入血所 致。 本研究结果显示，l i t 6 、I L - 8 水平于C P B 开始后明显增高， 于C P B 后4h 达到高峰，并持续到术后第l 天晨恢复至c P B 前 水平，且其峰值与P M N 凋亡率呈负相关，与C P B 时间呈正相 关。I L - 6 的升高可致内源性介质的释放诱导急性期炎性反应 的发生挣1 。它可诱导其他免疫因子和内分泌因子的广泛释放， 所以

27、C P B 术后的I L - 6 水平明显升高，可看作“急性时相反应”的 一种表现。I L - 6 能导致血管活性物质的释放、肠壁血管收缩、 肠道通透性增加、肠道内毒素转移至血等炎性反应。正如B i t t l e 等【1 0 1 发现，l i t 6 可以延缓P I V l N 凋亡，保持大量P M N 的存活及其 生成氧的能力，导致器官功能的不良。 I L - 8 是P M N 最强有力的趋化激活因子，能激活P M N ，促进 C D i l b C D l 8 的高表达，增强附N 与内皮细胞的黏附，使被趋化 的P M N 容易进入炎性区域，脱颗粒，释放有毒产物，形成炎性 反应，参与组织炎

28、性损伤J 。研究结果表明，I L - 8 在组织中存 留时间长，并可通过抑制c a s p a s e 酶活性使C P B 期P M N 凋亡受 到抑制，延长、增强P b l N 的炎性效应u 引。 C P B 导致I L - 6 、I L - 8 等炎性介质的升高可持续到术后数小 时甚至更久n 3 J 】，这提示，C P B 启动炎性反应后，可以通过体内 多种炎性细胞和炎性介质的相互作用而导致炎症反应的级联 放大，即使引起炎性反应的原发因素( C P B 和缺血再灌注) 已经 去除，仍能在相当长的时期内维持机体的炎性反应状态。 C P B 中机体在缺血再灌注、补体激活、内毒素释放和其他 细胞

29、因子的作用等综合因素的影响下产生和释放大量炎性细 胞因子，如T N F - G t 、I I r 8 等m ，这些因素的综合作用可使 7 4 7 m I N 凋亡受到抑制，细胞活化，P V I N 生命功能周期延长，释放炎 性介质增加，使C P B 全身炎性反应迁延。随着C P B 结束，P M N 凋亡恢复正常，炎性反应得以控制。 由于凋亡是P l V l N 介导炎性反应终止的重要生物步骤。因 此，对C P B 中P M N 凋亡机制及其与细胞因子的关系作进一步 深入研究，将为监控和调节体外循环全身炎性反应，预防和治 疗应激性损伤开辟一条崭新的途径。 参考文献 1 付建峰，满昭熙体外循环对

30、先心病患儿肺顺应性的影响河北医 药，2 0 0 7 ，2 9 ：6 6 0 2W a nS ，k o e r e I L ，V i n e e n t 几I I l n a m m t o r yr e s l x t oc a n t i o l , u l m I a r y b ) p 日C h e s t ，1 9 9 7 ，1 1 2 ：6 7 6 - 6 9 2 3P a m i e kI ) A i V l eE E ，F u l l e r t o nD A ，e ta 1 C a r d i 唧d m l a r yb 懈r e n d e r s p m i 蚰乜越r i

31、s kf o rm u l t i p l eo r g a nf a i l u r ev i ae a d yn e u 自r 呷“lp r i n 咄a n dl a t e n e u h o p I I i ld i s a b i l i t y Js u r gR e s ，1 9 9 9 ，8 6 ：4 2 - 4 9 4S i m o nI K I 1 V e u t n , p h i | a p o p t i sp a t h w a y sa n dt h e i rm o d i f i c a t i o mi ni n f l a m - I n a t i o

32、 n 1 m m u n o iR e v 2 0 0 3 ，1 9 3 ：1 0 1 1 1 0 5V a nO y l , e T E 。S e d u m C N R e s o l u t i o no f i n f l a x n m a t i o n ：8 n e wp a r a d i g m f o r t h e p , , t h o 胖s i so fp e r i o d o n t a ld i s e a s e JD e n tR e s ，2 0 0 3 ，8 2 ：8 2 9 0 6Q l e l l oM ，M a s t r o r o i J e

33、a oP 。Q u i r i n oA 。e ta 1 I n h i b i t i o n0 f n e u t r o p h i la p o p t o s i s a f t e rc o r o n a r yb ) 1 H 翳O p e l a t i o l lw i t h 训i o p | l l m m a r yb ) p a 鼹A n nT h o m e s I l I I g ，2 0 0 2 ，7 3 ：1 2 3 1 2 9 7k g 帅M R ，O d e m u y i w aS O ，M 0 q l 埘R I k l d e f 8 t a n d

34、堍e x o e y t o s i si ni n l m m e m a di n f l a m m a t o r yc e l l s ：t h em o l e c u l a rb a s i sa fm e d i a t o rf l e t i o l l JA l l e r g y C l i nI r a m t m 0 1 2 0 0 3 ，1 1 1 ：9 2 3 - 9 3 2 8 Q u i r o 单M M ，M i y a g i s h i m aR ，H a e l d h e n1 1 2 。e la 1 T h ee f f e c to ft o

35、 b yt e m p e r a t u r eO nl e u k o c y t ek i n e t i e sa , , r i n g , ：a r d i o p u l r n a r yb y p a JT h o r a eC a r d i o v a s cs u | r g ，1 9 8 5 ，9 0 ：9 1 - 9B n d l l ) J ，S l l n d e l sJ ，R u m l e y A ，e ta 1 1 m o c t0 fa n g i o t e m i nc o n v e r t i n ge 目t z y m e i n h i b

36、 i t i o n0 1 1p o s t - c o r o n a r ya r t e r y 悃i n t e r l e u k i n6r e l e e r t2 0 0 2 ， 8 7 ：2 5 2 - 2 5 5 i 0B i f l l eW L ，M o o r eE E ，M o o r eF A ，e ta 1 I n t e d e u k i n - 6d e l a y s e u t , 叩I l i la p o p - t o s i s A r c hS u 曙，1 9 9 6 ，1 3 1 ：2 4 - 2 9 1 1T a k a h a s h

37、iT ，H a t oF 。Y a l m n e T ，e ta 1 A c t i v a t i o no f h u l n e u t r 呷h i lb ye y t o k i n e - 目k c t i v a t e de n d o t h e l i a le d l s C i t eR e s 。2 0 0 1 ，稿4 2 2 - 4 2 9 1 2W a nI Y ，A r i f i 从，W a nS ，e ta 1 B e a t i n g r tr e v a s e u l a f i 碰o nw i t hO Fw i t h o u t 髑I d i

38、 o p I - l l a l yb y p a ；E v a l u a t i o n0 fi n t l n m t o r yr e s p o n s ei n ap r o - f l i 3 d 2 t i v er a n d o m i z e d 咖I d y Jt h o m eC , a l d i o Y a s cS u 唱，2 0 0 4 ，1 2 7 ：1 6 2 4 - 1 6 3 1 1 3G r u n e n f e l d e rJ ，Z t l n dG t S e h o e b e d e i nA ，da 1 E x p r e s s i

39、o n0 fa d h e s i o nm o l e - c I l l a n dc y t o k i e s 加r ye a - t e l 3 , b ) r p a g r a t i n gd u r i n gn o r m o t h e r m i e a n dh y l , o d , 枷cc a r d i a ca r r e s t E a rJC a r d i o t h o r a cS u r g ，2 0 0 0 ，1 7 ：7 2 3 7 2 8 1 4A & i o n eR ，U 酬C T ，U n d e r w o o d 砌，e la I

40、I n f l a m m a t o r yr e s p o n s ea f t e rt i l l - o n a r yr e v a s c d a f i z 日t i o nw i t hO Fw i t h o u tc a r d i o l , u l m 埘悃A n n S L I 曙，2 0 0 0 ，6 9 ：1 1 9 8 1 2 0 4 1 5 W a n S ，1 V l a r e h a n t A ，D e s m e n tJ M ，e ta 1 H u m a ne y t o k i n er e s l m e s t oc a r d i a c t r a n s p l a n t a t i o na n de o l , o f l a r ya r t e r yb ) r p a 掣她JT h o r C A l l d i o v a s e S u r g ，1 9 9 6 ，1 1 1 ：4 6 9 - 4 7 7 ( 收稿日期：2 0 0 7 0 9 一0 4 )