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1、论著 文章编号： 1000-5404 （2005） 12-1204-04 人趋化因子 ELC 的克隆与表达 罗福康1， 沈大斌2， 郑红2（第三军医大学：1新桥医院检验科， 重庆 400037，2西南医院实验研究中心， 重庆 400038） 提要：目的克隆人趋化因子 ELC 基因， 表达并初步纯化 ELC 融合蛋白。方法从扁桃体中提取总 RNA， 再进行 RT-PCR， 扩增 ELC 成熟蛋白基因， 并在 5和 3分别添加 Nco和 EcoR酶切位点， 通过这两个酶切位点重组于 pET32a （ + ） 载体上， 转化 E. coli DH5， 筛选阳性克隆， 酶切鉴定， DNA 测序检测插入
2、序列的正确性， 缺失突变获得 ELC 天然蛋白 表达载体 pET32a （ + ） /ELC， SDS-PAGE 分析其表达， Western blot 验证融合蛋白。大量表达并初步纯化 ELC 融合蛋白。结果 成功克隆了 ELC 基因， 表达并初步纯化得到 ELC 融合蛋白。结论构建的 ELC 硫氧还蛋白融合表达载体以可溶性蛋白 的方式表达 ELC 硫氧还蛋白。 关键词：ELC； 融合表达； 载体； 缺失突变； Western blotting； 蛋白纯化 中图法分类号：R392.11；R394-33 文献标识码：A Gene cloning and expression of human
3、chemokine ELC LUO Fu-kang1，SHEN Da-bin2，ZHENG Hong2（ 1Department of Clinical Laboratory，Xinqiao Hospital，Chongqing 400037，2Center of Ex- perimental Research，Southwest Hospital，Third Military Medical University，Chongqing 400038，China） Abstract：ObjectiveTo clone human chemokine ELC and express the ELC
4、 fusion protein. MethodsTotal RNA from human inflammatory tonsil was extracted and the cDNA was generated with reverse transcription. Mature ELC gene was amplified with PCR and Ncoand EcoRsites were added to the 5 and 3 terminal respectively， and then cloned into pET32a （ + ） . E. coli DH5was transf
5、ormed with the recombinant plasmid，and positive clones were selected. The inserted DNA was verified by enzyme digestion and DNA sequencing. The fusion expression vector of mature ELC was formed with deletion mutation. ELC expression was analyzed by SDS-PAGE and Western blotting and the ELC fusion pr
6、otein was purified. ResuItsHuman chemokine ELC was successfully cloned and the fusion protein was expressed and purified. ConcIusionThe ELC fusion protein was expressed with solubility. Key words：ELC；fusion expression；vector；deletion mutation；Western blotting；protein purification 趋化因子是由小分子分泌蛋白组成的一个大
7、的细 胞因子超家族， 是能够诱导白细胞作定向运动的细胞 因子， 在病原体的清除、 炎症反应、 移植排斥、 造血、 血 管生成、 肿瘤转移、 HIV 感染等过程中发挥着重要作 用 1， 2 。ELC Epstein-Barrvirus-inducedmolecule 1 （EBI-1）ligand chemokine ， 又名 MIP3， 组成性表达于 次级淋巴组织， 主要表达细胞为次级淋巴组织 T 细胞 区基质细胞和 DC （dendritic cell） 细胞， 对初始型 T 细胞 和活化的 B 细胞有强烈的趋化作用， 诱导表达相应受 体 CCR7 的这两类细胞进入次级淋巴组织， 由 DC
8、细胞 提呈抗原， 激活 T 淋巴细胞 3， 4 。在免疫排斥反应过 程中， DC 基金项目： 国家自然科学基金资助项目 （30170900） Supported by the National Natural Science Foundation of China （30170900） 作者简介： 罗福康 （1974 - ） ， 男， 四川省彭山县人， 硕士， 医师， 主要从事趋化 因子方面的研究。电话：（023） 68774695， E-mail：luofukang2002 通讯作者： 郑红， 电话：（023） 65460552， E-mail： 收稿日期： 2004-10-12； 修回日
9、期： 2004-12-15 细胞向 T 淋巴细胞提呈抗原是免疫排斥反应发生的关 键环节。为了阻止或减轻免疫排斥反应的发生， 我们 希望得到 ELC 受体 CCR7 的拮抗剂， 以减缓或阻止 T/ B 淋巴细胞进入次级淋巴组织 T 细胞区。为此， 本研 究构建了 ELC 的融合蛋白表达载体， 表达并纯化得到 ELC 融合蛋白， 为后续的研究工作奠定基础。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1标本扁桃体来自西南医院耳鼻喉科慢性扁桃体炎 患者手术摘除的扁桃体。 1.1. 2质粒及菌株E. coli. DH5本室保存， E. coli. BL21trxB （DE3） ， 大肠杆菌表达质粒 pET32a
10、 （ + ） ， 购自美国 No- vagen 公司。 1.1. 3试剂总 RNA （tRNA） 提取试剂 Tripure Isolation Reagent （德国 Roche 公司） ， 逆转录试剂盒 Improm-RT System， 高保真热稳定 DNA 聚合酶 Tli， 琼脂糖， 胶回收试剂盒， 限制性 内切酶 Nco、 EcoR， T4 连接酶 （美国 Promega 公司） ， 质粒提 取试剂盒 （德国 Roche 公司） ， IPTG （Sigma 公司） ， 羊抗人 ELC 多 4021 第 27 卷第 12 期 2005 年 6 月 第三军医大学学报 ACTAACADEMI
11、AEMEDICINAEMILITARISTERTIAE Vol. 27，No. 12 Jun. 2005 抗 （R&D 公司） ， 兔抗羊二抗 （辣根过氧化物酶标记）（中山公 司） 。TALON 金属离子 （Co2 +） 亲和层析树脂 （CLONTECH 公 司） ，AKTA Explorer 高 效 层 析 系 统、Hiprep26/10 除 盐 柱、 Hiprep16/10 CM FF 弱阳离子交换柱 （英国 Amersham Pharmacia 公司） ， 其它化学试剂均为分析纯。 1.2方法 1.2.1总 RNA 提取标本收集后立即分成 100 200 mg 的 小块， 液氮冻存 2
12、h， 取出放 - 70 冻存。总 RNA 提取采用德 国 Roche 公司的 Tripure Isolation Reagent， 按操作说明进行。总 RNA - 70 保存。 1.2. 2逆转录 （Reverse transcription，RT）RT 采用美国 Promega公司的 Improm-RT System， 模板为提取的总 RNA， 引 物为 Oligo （dT） 15 ， 逆转录酶为 Improm-Reverse Transcriptase， 25 退火 5 min， 42 逆转录 1 h， 70 灭活逆转录酶 15 min。 - 20 保存备用。 1.2.3PCR根据 Gen
13、Bank 公布的 ELC mRNA 序列 （登录号 AB000887） ， 设计上游引物为5-CATGCCATGGCTGGCACCAATG- ATGCTGAAG-3，下 游 引 物 为 5-CGGAATTCTTAACTGCTGCGG- CGCTT-3。上游引物位于 ELC 序列起始密码子 ATG 下游 63 bp， 成熟蛋白起始位置， 下游引物至终止密码子 TAG。同时在 5引入 Nco位点， 3引入 EcoR位点。以 RT 产物为模板， 按 2 U/反应加入 Tli 高保真 DNA 聚合酶， 常规 PCR 条件进行扩增。 反应条件： 94 预变性 5 ， 然后按如下参数进行 40 个循环：
14、94 ， 1 min， 52 ， 1 min， 72 ， 2 min。最后一个循环结束后 72 延伸 5 min。 1.2.4PCR 产物回收纯化、 质粒提取PCR 产物回收纯化采 用美国 Promega 公司的 Wizard!SV Gel and PCR Clean-Up System， 质粒提取采用德国 Roche 公司的 High Pure Plasmid Isolation Kit， 按操作说明进行。 1.2.5酶切反应、 连接、 转化按文献 5 进行。 1.2.6阳性克隆的挑选对阳性克隆进行酶切验证 （Nco、 EcoR双酶切） ， 挑选 3 个含插入片段的质粒送上海基康公司以 S-
15、Tag 、 T7 启动子引物同时测序， 以保证整个融合蛋白基因的正 确性。测序正确的重组质粒命名为 pET32a （ + ） /ELC （ + 3） 。 1.2.7缺失突变为了使融合蛋白经肠激酶酶切后得到 ELC 天然蛋白， 我们针对肠激酶位点与天然蛋白基因间的 3 个 氨基酸设计了 1 对特异性缺失突变引物， 正向： GGTACCGAC- GACGACGACAAGGGCACCAATGATGCTGA； 反向： CCATGGCTGCTG CTGCTGTTCCCGTGGTTACTACGACT，突 变 反 应 按Stratagen QuickChange!突变试剂盒操作说明进行。PCR 反应： 在
16、200l PCR 管中依次加入 10 Reaction Buffer 5l， pET32a （ + ） /ELC （ + 3）模板（20 ng/l）1l， 正向、 反向引物 （均为 125 ng/l） 各 1 l， dNTP mix 1l， 加入灭菌 Milli-Q 纯水至 50l， 最后加入 PfuUl- tra 高保真 DNA 聚合酶 （2.5 U/l）1l， 混匀后进行扩增， 条件 为： 95 预变性30 s， 然后95 30 s， 55 1 min， 68 6.5 min， 18 个循环。冰浴备用。阳性对照反应： 在 200l PCR 管中依次 加入 10 Reaction Buffe
17、r 5l， pWhitescript 质粒 （5 ng/l）2 l， 正 向、 反向引物 （均为 100 ng/l） 各 1.25l， dNTP mix 1l， 加入灭 菌 Milli-Q 纯水至 50l， 最后加入 PfuUltra 高保真 DNA 聚合酶 （2.5 U/l） 1l， 混匀后进行扩增， 条件为： 95 预变性 30 s， 然后 95 30 s， 55 1 min， 68 5 min， 12 个循环。冰浴备用。 消化模板： 在 PCR 反应产物中加入Dpn（10 U/l）1l， 轻轻 吹打几次混匀反应液， 瞬时离心后立即放入 37 孵育 1 h。反 应结束后冰浴备用。转化 XL
18、1-Blue 感受态细菌： 冰上化冻 XL1-Blue 感受态细菌， 将 1l Dpn消化后的 PCR 反应产物加 入 50l 感受态细菌， 轻轻混匀后冰浴 30 min， 然后 42 热休克 45 s， 冰浴 2 min， 然后加入 0.5 ml 预热到 42 的 NZY+ 培养基， 37 、 250 r/min 摇动培养 1 h。然后 pET32a （ + ） /ELC （ + 3） 突 变反应管 250l/板铺板于 100g/ml 氨苄平板， pWhitescript 阳 性对照反应铺板于 100g/ml 氨苄、 80g/ml X-gal、 20 mmol/L IPTG 平板， 放入 3
19、7 孵箱培养 16 h 以上。挑选阳性克隆扩 增、 提取质粒测序， 测序由上海申友公司完成。突变后的质粒 命名为 pET32a （ + ） /ELC。 1.2.8pET32a （ + ） /ELC 在大肠杆菌中的表达以 pET32a （ + ） /ELC 质粒转化感受态大肠杆菌 BL21trxB （DE3） 。将 1.5 ml 过夜培养的菌液转入 50 ml 培养液 37 摇瓶培养， 待悬液 D （600）达到 0.55 时， 留 1 ml 菌液电泳， 再加入 IPTG （终浓度为 1 mmol/L） ， 继续培养 3 h， 取 3 ml 菌液离心， 将沉淀悬于 1/10 倍 培养体积的 PB
20、S 中， 超声裂菌， 离心， 取上清和沉淀与前述样品 同时进行 SDS-PAGE 电泳。 1.2.9目的蛋白的表达将含有重组原核表达质粒 pET32a （ + ） /ELC 的大肠杆菌 BL21trxB （DE3） 接种于 100 ml 含 50g/ml 氨苄青霉素、 15g/ml 卡那霉素的 LB 培养液中， 37 、 250 r/ min 摇动培养过夜。将振荡过夜的菌液按 5%分别接种于 2 L 含 50g/ml 氨苄青霉素、 15g/ml 卡那霉素的 LB 培养液中， 37 、 250 r/min 摇动培养 3 4 h， 直至 D （600） 为 0.6 0.8。加入 诱导剂 IPTG
21、至终浓度 1 mmol/L。37 、 250 r/min 继续摇动培 养 3 h。4 、 3 000 g 离心 15 min 收集细菌。PBS 洗涤 1 次。 每升发酵菌以 100 ml PBS 重悬， - 80 冻存。次日将冻存菌液 于 37 冻融裂解， 以 BioNeb 挤压式细胞破碎仪， 100 psi，挤压 4 次， 以去除裂解菌液的粘性。4 ， 15 000 g 离心 20 min， 分别 收集上清和沉淀， 各取少量用于 SDS-PAGE 电泳。 1.2.10融合蛋白的金属 （Co2 +） 亲和层析以 TALON 金属 亲和树脂进行纯化， 方法参照 Clontech 公司说明书。留样
22、 SDS- PAGE 电泳。 1.2.11除盐以 50 mmol/L Tris HCl 缓冲液， pH 8.0 除盐， 除去洗脱产物中的 NaCl 和咪唑。除盐柱为 Hiprep26/10 Desalt- ing， 流速为 5 ml/min， 上样 3 ml/min， 收集洗脱下的蛋白峰。 1.2.12弱阳离子交换层析按蛋白等电点的不同分离蛋 白。弱阳离子交换层析柱为 Hiprep16/10 CM FF， 平衡液为 20 mmol/L Tris HCl 缓冲液， pH 8.2， 洗脱液为 20 mmol/L Tris Hcl 缓冲液， pH 8.2， 1 mol/L NaCl。流速为 5 ml
23、/min， 上样 3 ml/min。 连续梯度洗脱液 （0% 100%） 洗脱， 20 柱床体积 （CV） ， 收集洗 脱下的蛋白峰。取样电泳。 2结果 2.1总 RNA 提取 提取出的总 RNA 经 1%琼脂糖电泳鉴定， 可看到两条清晰 的条带， 分别为 28S 和 18S， 28S:18S 约为 2:1。 5021第 12 期罗福康， 等.人趋化因子 ELC 的克隆与表达 2.2RT-PCR 扩增产物经 1%琼脂糖电泳鉴定， 得到一条长度在 200 300 bp 的 ELC 成熟蛋白 DNA 扩增产物 （图 1） 。 1：ELC PCR product；2：100 bp DNA marke
24、r 图 1 琼脂糖凝胶电泳分析 ELC PCR 产物 Fig 1Electrophoresis of ELC PCR product on agarose gel 2.3pET32a （ + ） /ELC 质粒的构建 PCR 产物经 Nco、 EcoR分别单酶切并纯化后与同样 Nco、 EcoR分别单酶切并纯化的 pET32a （ + ） 载体相连接， 构 建 ELC-Trx 融合表达质粒。连接产物转化感受态 E. coli.DH5， 氨苄青霉素抗性 LB 平板筛选， 采用 Nco、 EcoR双酶切鉴定 阳性重组子， 取 3 个含插入片段的阳性克隆进行 DNA 测序分析 （测序图略） ， 缺失
25、突变后再进行 DNA 测序 （测序图略） ， 结果显 示插入的 ELC 基因、 硫氧还蛋白基因与 GenBank 报道完全一 致。 2.4pET32a （ + ） /ELC 质粒在 E. coli. BL21trxB （DE3） 中的表达 发酵菌在用 IPTG诱导与未诱导样中表达量差异明显， 所表达 的融合蛋白大部分以可溶性蛋白形式存在。SDS-PAGE 电泳结果 表明 ELC-Trx 融合蛋白大小约27 103， 与理论值 27.1 103基本一 致 （图2） 。Western blot 证实表达的为 ELC融合蛋白 （图3） 。 1：Proteins in lysate of fertil
26、ized bacteria （not induced） ； 2：Proteins in pre- cipitation of induced fertilized bacteria （3 h after IPTG induction） ；3：Pro- teins in supernatant of induced fertilized bacteria （3 h after IPTG induction） ； 4：Flowpath of metal affinity chromatography；5：Elution of metal affinity chromatography；6：Peak
27、 1 of elutions of cation exchange；7：Marker 图 2 SDS-PAGE 分析融合蛋白表达 Fig 2SDS-PAGE analysis of ELC fusion protein 1：Marker； 2： Proteins in lysate of induced fertilized pET32a （ + ） /BL21trxB （DE3） （3 h after IPTG induction） ； 3： Proteins in lysate of induced fertilized pET32a （ + ） /ELC/BL21trxB （DE3） （
28、3 h after IPTG induction） 图 3 ELC 重组蛋白的 Western blot 分析 （羊抗人 ELC 多抗血清为一抗） Fig 3Western blot analysis of recombinant ELC fusion protein 2.5ELC 融合蛋白的初步纯化 融合蛋白经 TALON 金属亲和树脂吸附后， 融合蛋白占总 蛋白的 65% 80%以上。除盐后经弱阳离子交换， ELC 融合蛋 白得到有效纯化 （图 2） 。 3讨论 ELC 主要由次级淋巴组织 T 细胞区基质细胞和 DC 细胞表达， 诱导表达相应受体 CCR7 的初始型 T 细 胞和活化的 B
29、 细胞进入次级淋巴组织。ELC 生物学功 能的发挥依靠其受体 CCR7 介导， 表达 CCR7 的主要为 DC 和 T 细胞。因此， ELC 是 DC 和 T 细胞进入次级淋 巴组织 T 区的重要趋化因子。目前， 国内外尚少有关 于 ELC 与移植免疫排斥关系的研究， 对与 ELC 的研究 多集中在以下几方面： ELC 是一种强有力的肿瘤抑 制剂， 转染了 ELC 的肿瘤细胞通过招募 NK 细胞和 CD4+细胞可明显抑制肿瘤细胞生长 6 ； 体外实验表 明， ELC 可抑制 CML 白血病细胞的生长 7 。Annun- ziato等 8的实验结果提示 ELC 参与了 T 细胞成熟过 程中的阴性
30、选择。在免疫排斥反应过程中， DC 细胞向 次级淋巴组织提呈抗原是免疫排斥反应发生的关键环 节。为了阻断或减轻免疫排斥反应的发生， 我们希望 得到 ELC 受体 CCR7 的拮抗剂， 以阻止或减缓 DC 细胞 进入次级淋巴组织， 从而阻止或减少 T 细胞的活化。 本研究成功构建了 ELC 表达载体， 可稳定地大量表达 ELC 融合蛋白， 在此基础上可利用基因突变技术筛选 CCR7 的拮抗剂， 为研究趋化因子 ELC 在移植免疫学 中的功能奠定基础。我们在研究中构建了 ELC 融合 蛋白的原核表达载体， 该融合蛋白在优化的宿主菌中 主要以可溶性形式存在于细菌裂解液上清中， 经纯化 得到 ELC
31、融合蛋白。研究中我们初步建立了 ELC 融 合蛋白表达、 纯化的操作流程， 并纯化得到 ELC 融合 蛋白。构建的 ELC 融合蛋白表达载体为构建 ELC 突 变体并进一步获得 ELC 的拮抗剂奠定了基础。目前 6021第三军医大学学报第 27 卷 国内外尚少有关于 ELC 与移植免疫排斥关系的报道， 我们目前和后续的工作将对此研究领域进行积极的探 索， 期望可得到特异性强的免疫抑制剂应用于抗移植 排斥反应， 延长移植物存活时间。 参考文献： 1David J，Mortari F. Chemokine receptors - A brief overview J . Clin Appl Imm
32、unol Rev，2000，1 （2） ：105 - 125. 2Horuk R. Chemokine receptors J . Cytokine Growth Factor Rev， 2001， 12 （7） ：313 - 335. 3Ngo V N，Tang H L，Cyster J G. Epstein-Barr virus-induced molecule 1 ligand chemokine is expressed by dendritic cells in lymphoid tissues and strongly attracts naive t cells and acti
33、vated b cells J . J Exp Med，1998， 188 （1）：181 - 191. 4Luther S A，Tang H L，Hyman P L，et al. Coexpression of the chemokines ELC and SLC by T zone stromal cells and deletion of the ELC gene in the plt/ plt mouse J . Proc Natl Acad Sci U S A， 2000， 97 （23） ： 12694-12699. 5J 萨姆布鲁克， DW.拉萨尔 著， 黄培堂 译. 分子克隆
34、M . 第 3 版. 北京： 科学出版社， 2002. 68 - 113. 6Braun S E，Chen K，Foster R G，et al. The CC chemokine CK-11/MIP- 3/ELC/Exodus 3 mediates tumor rejection of murine breast cancer cells through NK cells J . J Immunol，2000，164 （8） ：4025 - 4031. 7 Hromas R，Cripe L，Hangoc G，et al. The exodus subfamily of CC chemokin
35、es inhibits the proliferation of chronic myelogenous leukemia pro- genitors J . Blood，2000，95 （4） ：1506 - 1508. 8 Annunziato F，Romagnani P，Cosmi L， et al.Macrophage-derived chemokine and EBI1-ligand chemokine attract human thymocytes in different stage of development and are produced by distinct sub
36、sets of medullary ep- ithelial cells：possible implications for negative selection J . J Immunol， 2000，165 （1） ：238 - 246. （编辑王红 = ） 文章编号： 1000-5404 （2005） 12-1207-01个案与短篇 慢性乙型肝炎肝硬变与肝癌患者血清可溶性 Fas ligand 水平检测 Detection of the serum soluble Fas ligand in patients with chronic hepatitis B，liver cir- rho
37、sis and hepatocarcinoma 曾晓波， 陈军， 苏先狮， 蒋永芳， 何艳（中南大学湘雅二医院传染科， 长沙 410011） Fas/Fas 配体 （Fas ligand，FasL） 是目前研究较为广泛的诱导 细胞凋亡分子， 研究发现， 可溶性 FasL 分子也有诱导靶细胞凋 亡的作用 1 。为研究可溶性 FasL 分子在肝病患者中的作用， 我 们对慢性乙型肝炎、 肝硬变、 肝癌患者血清的可溶性 FasL 水平 进行了检测， 为探讨可溶性 FasL 分子对各种肝病肝细胞凋亡的 调控作用提供帮助。 1材料与方法 1.1病例选择与试剂 选用 2003 年 1 - 2 月中南大学湘雅
38、二医院传染科住院患者 22 例， 其中慢性重度病毒性肝炎 （乙型） 12 例， 肝炎肝硬变 （活 动期） 6 例， 男性 14 例， 女性 4 例， 平均年龄 （38.5 11.2） 岁， 诊 断标准遵照 2000 年 9 月西安中华医学会传染病与寄生虫病学 分会、 肝病学分会联合修订 病毒性肝炎防治方案 。选用 2002 年 6 月至 2003 年 1 月中南大学湘雅二医院肝胆外科住院患者 16 例， 经病检确诊为肝细胞癌， 均为男性患者， 平均年龄 （49.5 19.7） 岁。另选 6 名健康者为正常对照。人 FasL 定量 EIA 试 剂盒购自 MBL。 作者简介： 曾晓波 （1960
39、- ） ， 男， 湖南省娄底市人， 硕士， 副教授， 主要从事临 床肝病方面的研究。电话： 13308452846 通讯作者： 陈军， E-mail： 收稿日期： 2005-04-05； 修回日期： 2005-05-26 1.2主要仪器 酶标仪： LABSYSTEMS， Wellscan K3 全自动酶标仪。 1.3方法 参照操作说明书严格执行， 每个样品检测两次。 1.4统计学处理 数据用-x s 表示， 采用 SPSS 10.0 统计软件行独立 t 检验。 2结果 慢性肝炎、 肝硬变、 肝癌患者血清的可溶性 FasL 水平比较 见表 1。统计学分析表明， 肝癌患者血清的可溶性 FasL 水
40、平与 慢性肝炎、 肝硬变患者比较， 均存在显著性差异 （P 0.05） 。 表 1 慢性肝炎、 肝硬变、 肝癌患者血清的可溶性 FasL 水平比较 组别n血清可溶性 FasL 浓度 （pg/ml） 肝癌162 759.07 365.65 慢性肝炎12 3 186.30 362.25* 肝硬变6 3 782.00 1 051.63* 正常对照6 3 521.25 1 562.25* *：与肝癌组比较，P 0.05 3讨论 可溶性 FasL （soluble Fas ligand，sFasL） 最先由 Tanaka 等 1 （下转 1210 页） 7021 第 27 卷第 12 期 2005 年 6 月 第三军医大学学报 ACTAACADEMIAEMEDICINAEMILITARISTERTIAE Vol. 27，No. 12 Jun. 2005