中空纤维生物反应器的构建及其体外灌流实验.pdf

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1、中空纤维生物反应器的构建及其体外灌流实验 舒桂明1 , 2宋继昌1 , 2杜智1 , 2李涛2张金卷1 , 2 崔润海2付丽2吕文岚2毕海英2 1 (天津市第三中心医院 肝胆外科,天津3 0 0 1 7 0 ) 2 (卫生部人工细胞工程技术研究中心,天津3 0 0 1 7 0 ) 摘要设计原代培养的乳猪肝细胞构建生物反应器,并观察肝细胞生长特点,进行体外灌流实验。采用改良的 原位胶原酶灌流法分离乳猪肝细胞及间质细胞,在中空纤维舱的纤维外间隙中共培养,并间断旋转抑制细胞贴壁。 用该生物反应器建立人工肝系统,对肝硬化病人的腹水进行体外灌流实验。结果表明,乳猪原代肝细胞平均产量为 ( 6 . 2 9

2、 0 . 3 7 ) 1 0 8细胞, 肝细胞的活性为8 4 %;在纤维外间隙内间断转动培养3h后肝细胞聚合成球。电镜可见, 多个肝细胞聚合成团生长,培养的肝细胞有功能性结合,并向组织型转化。测定中空纤维舱内连续4 8h培养液尿素 浓度,证实肝细胞聚合体有很好的尿素合成功能。体外灌流后,生物反应器组腹水总胆红素下降, AS T升高,与对照 组相比有显著性差异。生物反应器组葡萄糖浓度下降,对照组无显著变化,两组间有显著性差异。通过本组实验,证 实了我们设计的生物反应器所构成的生物型人工肝( B AL )是有效的。 关键词生物反应器生物型人工肝中空纤维舱肝细胞培养体外实验 D e s i g no

3、 f aHo l l o w - f i b e rB i o r e a c t o ra n dP e r f u s i o nS t u d yi nV i t r o S h uG u i mi n g 1 , 2 S o n gJ i c h a n g 1 , 2 D uZ h i 1 , 2 L i T a o 2 Z h a n gJ i n j u a n 1 , 2 C u i R u n h a i 2 F uL i 2 L We n l a n 2 B i Ha i y i n g 2 1 ( De p a r t me n t o fHe p a t o b i l

4、 i a r yS u r g e r y , T i a n j i nT h i r dC e n t r a l Ho s p i t a l , T i a n j i n 3 0 0 1 7 0 , C h i n a ) 2 ( Ar t i f i c a l C e l l E n g i n e e r i n ga n dT e c h n o l o g yR e s e a r c hC e n t e ro fP u b l i c He a l t hMi n i s t r y , T i a n j i n 3 0 0 1 7 0 , C h i n a ) A

5、 b s t r a c tT h i sa r t i c l ep r e s e n t st h ed e s i g n o fab i o r e a c t o ru s i n gh o l l o w f i b e rme mb r a n ea n di s o l a t e d h e p a t o c y t e so f s u c k l i n gp i g s , a n dt h ee x p e r i me n t a l s t u d yo fi t se f f i c a c yi nv i t r o .L i v e rc e l l s

6、we r eh a r v e s t e df r o m s u c k l i n gp i g swi t hc o l l a g e n a s ep e r f u s i o ni ns i t u , a n dp a r e n c h y ma la n dn o n - p a r e n c h y ma lh e p a t o c y t e swe r ec o - c u l t u r e di nah o l l o wf i b e r mo d u l ewh i c hwa s r o t a t e ds p o r a d i c a l l y

7、 .B i o a r t i f i c i a l l i v e r ( B AL )wa s d e v e l o p e du s i n gt h i s b i o r e a c t o r , a n dt h eB ALwa sp e r f u s e dwi t ha s c i t e so fp a t i e n t ss u f f e r i n gf r o m l i v e rc i r r h o s i s .T h ey i e l do fv i a b l e h e p a t o c y t e swa s( 6 . 2 9 0 . 3

8、7 ) 1 0 8c e l l s , a n dc e l lv i a b i l i t ywa sg r e a t e rt h a n8 4 %. He p a t o c y t e sa g g r e g a t e dt o mu l t i - c e l l ss p h e r o i d sa f t e rb e i n gr o t a t e de v e r yt h i r t ymi n u t e sf o rt h r e eh o u r s .T h eh e p a t o c y t e si nt h eb i o r e a c t o

9、 r c o u l ds y n t h e s i z eu r e a .T o t a lb i l l i r u b i n wa sd e c r e a s e d , a n dAS T wa ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e di n t h eg r o u po f b i o r e a c t o r , a sc o mp a r e dwi t ht h a t i nt h ec o n t r o l g r o u p .G l u c o s ed e c r e a s e di nt h eg r o

10、 u po f b i o r e a c t o r , wh e r e a s t h e r e wa sn os i g n i f i c a n td e s c e n ti nt h ec o n t r o l g r o u p ; a n dt h ed i f f e r e n c eb e t we e nt h et wog r o u p swa ss i g n i f i c a n t .T h e a b o v er e s u l t sd e mo n s t r a t et h a t t h i sb i o r e a c t o ri

11、se f f e c t i v ef o rd e c r e a s i n gt o t a l b i l i r u b i na n dg l u c o s e . Ke yw o r d s B i o r e a c t o rB i o n a r t i f i c i a l l i v e rHo l l o wf i b e rme mb r a n eL i v e rc e l l sc u l t u r ei nv i t r o 1 引言 原代肝细胞培养的技术突破,为生物型人工肝 ( B i o a r t i f i c i a l l i v e r

12、, B AL )提供了有高度活性的肝细 胞源,从而使体外替代肝功能的设想变为现实。肝细 胞为粘连依赖性细胞 1 ,必须提供细胞-细胞或细胞 - 基质间的粘连才能使细胞生存并表达肝特异性功 能;肝细胞三维空间生长,能充分表达肝细胞功能。 实验证明,细胞聚合球中肝细胞的功能要好于三明 治培养或传统单层培养中的肝细胞 2 ,而细胞聚合 成多细胞球时微载体并非必须因素 3 , 4 。我们在分析 了多种细胞培养和生物反应器的优缺点基础上,利 用生物反应器三维空间和膜的通透性特点,设计了 生物反应器,来培养原代肝细胞、间质细胞,观察肝 生物医学工程学杂志 JB i o me dE n g = = = =

13、= = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = 2 0 0 6 ; 2 3 ( 1 ) :1 6 6 1 6 9 细胞的生长代谢情况,并应用它对肝硬化病人的腹 水进行了体外灌流试验,以验证人工肝的代谢功能。 2 材料与方法 2 . 1 实验动物 杂种乳猪2 4只,体重1 1 . 5k g ,每组4只,共 分6组。 2 . 2 试剂和设备 试剂: I V-型胶原酶、表皮生长因子( E G F ) 、

14、胰高 糖素( S i g ma公 司) ;Wi l l i a m sE培养 液( WE M) ( G i b c o公司) ; 胰岛素、地塞米松(药用规格) ;细胞 分离液所用药品为分析纯;试验用水为三蒸水。 仪器: T AB AI L NA- 1 2 2 DC O2培养箱; T OS H- I B A 4 0 - R F全自动生化分析仪; J H 1 0 1 0透射电子 显微镜。 2 . 3 乳猪肝细胞的分离 用改良的原位胶原酶灌流法消化乳猪的肝脏, 获得肝细胞悬液。5 0 g条件下离心3次获得肝实 质细胞,将上清液在1 5 0 g条件下再次离心清洗3 次,所得的间质细胞团加入到肝实质细胞

15、中进行共 培养。培养液采用Wi l l i a msE培养液,补充胰岛素 0 . 2U/ ml 、表皮生长因子1 0n g / ml 、胰高糖素5 0 n g / ml 、氟美松1 0 -8mo l / L 、 青霉素1 0 0U/ ml 、链霉 素1 0 0 g / ml 。 2 . 4 生物反应器的构建 采用宁波亚太的血浆I I级分离器作为生物反 应器,截流相对分子量为7 50 0 0 ,材料为聚丙烯腈 (德国造) 。将4只乳猪的肝细胞和间质细胞置入纤 维 外间隙中(容积为1 5 0ml ) ,湿化的体积分数为 9 5 %空气、体积分数为5 % C O2培养箱中培养,每 3 0mi n旋转

16、中空纤维舱1次, 维持3h后持续培养, 从中空纤维舱的纤维内流出少许培养液,作肝功能 测定和热原试验。每1 2h更换培养液1次。 2 . 5 体外生物型人工肝辅助装置的构建 取乙型肝炎后肝硬化病人的腹水5 0 0ml ,置于 无菌锥形瓶中, 3 7恒温并吹氧,连接转流泵,泵取 腹水进入生物反应器后回流入锥形瓶,进行体外灌 流观察(见图1 ) 。 2 . 6 体外灌流实验 体外灌流试验分为两组:一组为对照组( n = 6 ) ,中空纤维舱的纤维外间隙中无肝细胞,但加入 1 5 0ml的培养液; 另一组为生物反应器组( n =6 ) , 纤维外间隙内含有肝细胞聚合团。腹水灌流速度为 5 0ml /

17、 mi n ,持续灌流1h ,于灌流前、灌流后取腹水 送检,测定 T B I L(总胆红素) 、 G l u (葡萄糖) 、 AS T (谷草转氨酶)的浓度。 图1体外灌流模式图 F i g1 S c h e ma t i cd r a w i n go f p e r f u s i o ni nv i t r o 2 . 7 统计学分析 数据用均数标准差( x - s )表示,应用配对t 检验进行差异比较。 3 结果 3 . 1 肝细胞分离、培养情况 乳猪实质肝细胞平均产量为( 6 . 2 9 0 . 3 7 ) 1 0 8细胞, 肝细胞的活性(台盼兰拒染法)为8 4 %,间 断转动培养3

18、h后肝细胞聚合成球,积聚于中空纤 维间隙内。用吸管吹吸后,取细胞团光镜、电镜检查, 光镜可见肝细胞聚合成团(见图2 ) ,取出的细胞最 小的为双细胞集团,电镜检查可见,多个肝细胞聚合 成团生长,肝细胞核结构清晰,见有核仁,核染色质 较丰富,常染色质、异染色质分布尚正常,胞浆基质 内可见少量糖原颗粒,毗邻肝细胞尚未分离。细胞部 分间隙加大,可见窦间隙和微绒毛(见图3 、图4 ) 。实 验结果表明,培养肝细胞有功能性结合,并向组织型 转化。 3 . 2 肝细胞功能测定及热源试验 从中空纤维舱内1 2 、 2 4 、 3 6 、 4 8h取培养液测定 尿素浓度,结果显示舱内的肝细胞聚合体有很好的 尿

19、素合成功能,且呈逐渐上升的趋势(见图5 ) 。 3 . 3 体外灌流前后T B I L 、 G l u 、 A S T检验 结果见表1 。经灌流后,生物反应器组腹水中总 胆 红 素 下 降,与 对 照 组 相 比 有 显 著 性 差 异( t = 3 . 8 7 9 , P0 . 0 5 ) 。生物反应器组AS T升高( t = 5 0 . 3 5 , P0 . 0 5 ) ,而对照组无显著变化,两组间有 显著性差异( t =5 0 . 0 3 7 ,P0 . 0 5 ) 。生物反应器组 葡萄糖浓度下降 ( t =4 . 5 7 6 ,P0 . 0 5 ) ,对照组的 761 第1期舒桂明等。

20、 = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = 中空纤维生物反应器的构建及其体外灌流实验 葡萄糖浓度无显著变化,两组间有显著性差异( t = 4 . 7 2 1 7 , P0 . 0 5 ) 。 此种中空纤维舱的滤液,热原试验为阴性。 图2肝细胞聚合成团(台盼兰染色, 1 0 0 ) F i g2 He p a t o c y t es p h e r o i d ( T y p

21、 a nb l u e , 1 0 0 ) 图3肝细胞聚合球超微结构( 50 0 0 ) F i g3 U l t r a s t r u c t u r eo f h e p a t o c y t es p h e r o i d ( 50 0 0 ) 表1生物反应器和空舱灌流前后T B I L 、 G l u 、 A S T的变化 T a b l e1 C h a n g eo f T B I L , G l u , A S Tb e f o r ea n da f t e rp e r f u s i o n B e f o r ep e r f u s i o nAf t e r p

22、 e r f u s i o n T B I L4 3 . 1 9 6 4 . 6 2 6B i o r e a c t o r3 6 . 2 7 7 4 . 2 1 3 * C o n t r o l4 0 . 9 6 5 4 . 9 4 5 * G l u7 . 6 3 0 . 8 1B i o r e a c t o r7 . 1 8 0 . 7 9 * C o n t r o l7 . 6 7 0 . 7 5 AS T1 7 . 3 3 3 . 0 1B i o r e a c t o r4 0 1 1 7 . 4 4 * C o n t r o l1 6 1 . 7 9 B i o

23、r e a c t o rg r o u pv sC o n t r o lg r o u p , P 0 . 0 5 ; * B e f o r e p e r f u s i o nv sAf t e r p e r f u s i o n , P 0 . 0 5 图4肝细胞聚合球超微结构( 2 80 0 0 ) F i g4 U l t r a s t r u c t u r eo f h e p a t o c y t es p h e r o i d ( 2 80 0 0 ) 图5培养液尿素浓度 F i g5 C o n c e n t r a t i o no f u r e ai

24、 nc u l t u r eme d i a n 4 讨论 生物型人工肝是细胞生物学和膜工程学的结合 产物,采用原代培养的动物肝细胞或人类肝肿瘤细 胞作为生物成分,以中空纤维舱作为生物反应器的 载体。现有的技术已经对这两方面进行了深入的研 究。现在理论认为约需2 0 0g 5 肝实质细胞才能替代 肝脏的功能。然而应用胶原膜、胶原凝胶、胶原三明 治培养技术培养肝细胞,很难达到如此大量的肝细 胞。T a g u c h i等 6 的胶原三明治生物反应器仅含有 6 . 5 1 0 7肝细胞。微载体肝细胞聚合球培养能很好 地 解 决 这 个 问 题,细 胞 浓 度 可 以 达 到 1 0 7细 胞/

25、 ml 7 。 研究证明,多细胞聚合球中的肝细胞功能好于 861 生 物 医 学 工 程 学 杂 志第2 3 = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = 卷 其它的培养方法 2 ,但是微载体法培养肝细胞损失 细胞数量很大,达到4 3%6 6% 8 。最近的研究证 实肝细胞聚合成球,只需抑制细胞贴壁即可,微载体 不是必须条件 3 , 4 。中空纤维舱的选择应考虑培养细 胞的贴壁率

26、、膜通透性和免疫隔离。G e r l a c h等 4 应 用三维编织的中空纤维舱,在其外间隙置入肝细胞, 经间断摇动后,肝细胞聚合成多细胞球。本研究是在 中空纤维舱中直接加入高浓度的肝实质细胞和间质 细胞(实质细胞浓度达到1 . 6 1 0 7细胞/ ml ) , 经培 养后细胞聚合成球,并能表达出良好的功能;透射电 子显微镜观察了这种聚合球的超微结构,证实了这 些细胞间有细胞间连接的存在及间质细胞的存在。 文献报道,间质细胞能够为实质细胞提供细胞外基 质,可提高肝细胞特异性功能的表达 9 ,所以我们设 计的B AL中加入了非实质肝细胞。另外,本研究采 用的中空纤维舱,它是由聚丙烯腈材料制成

27、的,载流 的相对分子量为7 50 0 0 ,细胞贴膜率5 3%,其通透 膜的截流相对分子量在理想的相对分子量之内( 5 0 0 0 0 1 0 00 0 0 ) ,能使肝功能衰竭病人血液中的代谢 废物如氨、芳香氨基酸、胆红素等进入人工肝装置, 被体外人工肝装置中肝细胞代谢、解毒而排除体外, 而培养的肝细胞合成的产物如白蛋白、凝血因子可 以进入病人血液,病人相对大分子量的免疫球蛋白 不能通过中空纤维膜,使异种细胞免受免疫损害。 为证实这种装置的安全性,我们将中空纤维里 流出的细胞培养液做了热原实验,证实没有热原。 R o z g a等 1 0 1 3 应用单种纤维的中空纤维舱制 成B AL已经临

28、床应用,证实了其安全性和有效性。 本实验为检验生物反应器的代谢功能,采用乙型肝 炎后肝硬化病人的腹水进行体外灌流实验。实验结 果显示对照组、生物反应器组灌流后T B I L均降低, 应 用生物反应器较空舱灌流降低更为明显( P 0 . 0 5 ) 。生物反应器使腹水中的葡萄糖含量下降,证 明了肝细胞摄入并消耗葡萄糖的作用。初步结果证 实B AL可代替肝脏,具有肝脏合成、解毒功能。不足 之处,我们的体外灌流试验只进行了1h ,腹水中的 毒性物质损害了肝细胞。因为腹水中的AS T显著升 高,而AS T以细胞浆性和线粒体两种同工酶的形式 存在,其显著升高说明除肝细胞胞浆的损害外,也损 害了大量的线粒

29、体,线粒体是产生能量合成 AT P 的主要场所, AT P的减少,肝细胞面临崩解死亡。文 献报道 1 1 , 1 3 , 1 4 的临床实验证实,这种类型的生物反 应器可以持续应用6 7h 。深入细致的工作和进一 步的临床实验,还需在今后工作中进行研究。 5 结论 通过体外灌流实验,证实了我们设计的生物反 应器所构成的生物型人工肝( B AL )是有效的,为临 床应用奠定了基础。 参考文献 1E z e l l R M, T o n e rM, He n d r i c k sK, e t a l .E f f e c t o f c o l l a g e ng e l c o n f i

30、g u r a t i o no nt h ec y t o s k e l e t o ni nc u l t u r e dr a th e p a t o c y t e s . E x pC e l l R e s ,1 9 9 3 ; 2 0 8 :4 4 2 2S a k a i Y, Na r u s eK, Na g a s h i maI , e t a l .F u n c t i o n a l s t a b i l i t yo f p o r c i n eh e p a t o c y t es p h e r o i d si nv a r i o u sc u

31、 l t u r es y s t e msu n d e r 1 0 0 % p o r c i n ea n dh u ma np l a s mac o n d i t i o n s .Ar t i fOr g a n s , 1 9 9 6 ; 2 0 ( 1 ) :5 6 3S u r a p a n e n iS ,P r y o rT ,Kl e i n MD ,e ta l .R a p i dh e p a t o c y t e s p h e r o i d f o r ma t i o n :o p t i mi z a t i o n a n d l o n g t

32、 e r m f u n c t i o n i n p e r f u s e dmi c r o c a p s u l e s . AS AI OJ , 1 9 9 7 ; 4 3 :M8 4 8 4G e r l a c hJ , S c h n o yN, S mi t hMD , e ta l .He p a t o c y t ec u l t u r e b e t we e nwo v e nc a p i l l a r yn e t wo r k s : ami c r o s c o p ys t u d y .Ar t i f Or g a n s , 1 9 9 4

33、 ; 1 8 ( 3 ) :2 2 6 5Uc h i n oJ ,Ma t s u s h i t aM.Ar t i f i c i a ll i v e r :s t r a t e g i e sf o rt h e r e s c u eo f p a t i e n t swi t hl i v e r f a i l u r e . AS AI OJ , 1 9 9 4 ; 4 0 ( 1 ) :7 4 6T a g u c h i K, Ma t s u s h i t aM, T a k a h a s h i M, e t a l .D e v e l o p me n t

34、 o f a b i o a r t i f i c i a l l i v e r wi t h S a n d wi c h e d - c u l t u r e d h e p a t o c y t e s b e t we e nt woc o l l a g e ng e l l a y e r s .Ar t i f i c i a l Or g a n s , 1 9 9 6 ; 2 0 ( 2 ) :1 7 8 7We n e r R G,Me r kW,Wa l zF .F e r me n t a t i o nwi t hi mmo b i l i z e d c e

35、 l l c u l t u r e s .Ar z n e i mi t t e l f o r s c h u n g ,1 9 8 8 ; 3 8 ( 2 ) :3 2 0 8Mi y o s h i H, Ya n a g i K, F u k u d aH, e t a l .L o n g - t e r mp e r f o r ma n c e o fa l b u mi ns e c r e t i o no fh e p a t o c y t e sc u l t u r e di nap a c k e d - b e d r e a c t o r u t i l i

36、 z i n gp o r o u sr e s i n .Ar t i f Or g a n s , 1 9 9 6 ; 2 0 ( 7 ) :8 0 3 9Ko i k eM, Ma t s u s h i t aM, T a g u c hK, e t a l . F u n c t i o no f c u l t u r i n g mo n o l a y e rh e p a t o c y t e sb yc o l l a g e ng e lc o a t i n ga n dc o c u l t u r e wi t hn o n p a r e n c h y ma

37、l c e l l s .Ar t i f Or g a n s , 1 9 9 6 ; 2 0 ( 2 ) :1 8 6 1 0R o z g aJ , P o d e s t a L , L e p a g e E , e t a l .C o n t r o l o f c e r e b r a l o e d e ma b y t o t a lh e p a t e c t o my a n d e x t r a c o r p o r e a ll i v e r s u p p o r ti n f u l mi n a n t h e p a t i cf a i l u

38、r e . T h eL a n c e t , 1 9 9 3 ; 3 4 2 :8 9 8 1 1Wa t a n a b e F D , Mu l l o n C T P , He wi t tWR ,e ta l . C l i n i c a l E x p e r i e n c ewi t hab i o a r t i f i c i a l l i v e ri nt h et r e a t r me n t o f s e v e r e l i v e r f a i l u r e . An nS u r g , 1 9 9 7 ; 2 2 5 ( 5 ) :4 8

39、4 1 2Ke l l yJ H,S u s s ma nNL .T h e h e p a t i c e x t r a c o r p o r e a l l i v e r a s s i s t d e v i c ei nt h et r e a t me n t o f f u l mi n a n t h e p a t i cf a i l u r e .AS AI OJ , 1 9 9 4 ; 4 0 ( 1 ) :8 3 1 3Ne a z i lD F ,R o z g aJ ,Mo s c i o n iAD ,e ta l . Us eo fan o v e l b

40、 i o a r t i f i c i a ll i v e ri nap a t i e n twi t ha c u t el i v e ri n s u f f i c i e n c y . S u r g e r y , 1 9 9 3 ; 1 1 3 ( 3 ) :3 4 0 1 4Ne a z i lD F ,R o z g aJ ,Mo s c i o n iAD ,e ta l . Us eo fan o v e l b i o a r t i f i c i a ll i v e ri nap a t i e n twi t ha c u t el i v e ri n s u f f i c i e n c y . S u r g e r y , 1 9 9 3 ; 1 1 3 ( 3 ) :3 4 0 (收稿: 2 0 0 3 - 0 9 - 0 1 修回: 2 0 0 4 - 0 8 - 3 1 ) 961 第1期舒桂明等。 = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = 中空纤维生物反应器的构建及其体外灌流实验