人生长激素的时间分辨荧光免疫分析及其诊断试剂研制.pdf

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1、第 2 7 卷 第 4 期 2 0 0 6年7月 中山大学学报( 医学科学版) J O U R N A L O F S U N Y A T - S E N U N I V E R S I T Y ( M E D I C A L S C I E N C E S ) V o 1 . 2 7 J 曰 y No . 4 2 0 0 6 技术研究 人生长激素的时间分辨荧光免疫分析及其诊断试剂研制 杭建峰 (1 . 南方医科大学生物技术学院 ， 吴英松 ， 徐伟文 ， 周志聪2 ， 黄 颖3 ， 李 明 广东 广州5 1 0 5 1 5 ; 2 . 广州市达瑞抗体工程技术有限公司， 广东 广州5 1 0

2、6 6 3 ; 3 . 中国药品生物制品检定所， 北京1 0 0 0 5 0 ) 摘 要: 【 目 的】 利用时间分辨荧光免疫分析( t i m e - re s o l v e d fl u o ro i n m i u n o a s s a y , T R F I A ) 技术， 建立人生长激 素( h u m a n g ro w t h h o r m o n e , h G H ) 的快速检测方法并研制其诊断试剂。【 方法】 采用双抗体夹心法( 一株抗G H 的单抗用于包被微孔板， 另一株抗G H的单抗用于E u 3 . 标记) 建立h G H - T R F I A , 结果】

3、h G H - T R F I A的线性测 量范围为0 . 1 X 1 0 - 3 - 1 O O X I O - 3 U 几， 灵敏度为0 . 0 3 6 x 1 0 - 3 U / L ， 批内和批间的变异系数分别为5 . 3 % - 8 . 6 % 和7 . 6 % - 1 2 . 8 %。与促甲状腺激素( T S H ) , 卵泡生成素( F S H ) 、 人胎盘催乳素( L H ) 和黄体生成素( H P L ) 均无交叉反应。 将4 3 份血清标本用本法与Wa ll a c 试剂盒同时检测相关系数( r ) 为0 . 9 5 7 . 结论】 h G H - T R F I A可作

4、为一种具 有灵敏度高、 特异性强和测量范围宽的新方法， 用于临床G H水平的测定。 关键词: 生长激素; 时间分辨荧光免疫分析; 试剂 中图分类号: R 3 9 2 . 3 3 ; R 4 4 6 .6 1文献标识码: A文章编号: 1 6 7 2 - 3 5 5 4 ( 2 0 0 6 ) 0 4 - 0 4 7 2 - 0 4 T i me - r e s o l v e d F l u o r o i mmu n o ass a y o f H u ma n G r o w t h H o r mo n e a n d P r e p a r a t i o n o f I t s D

5、i a g n o s t i c R e a g e n t H A N G T a n - f e n g , W U Y i n g - s o n g , X U W e i - w e n , Z H O U Z h i - c o n g 2 , H U A N G Y i n g 3 ， L I M i n g ( 1 . S c h o o l o f B i o t e c h n o l o g y , S o u t h e rn M e d i c a l U n i v e r s i t y , G u a n g z h o u 5 1 0 5 1 5 ; 2 .

6、 G u a n g z h o u D a r u i A n t i b o d y C O . , L T D , G u a n g z h o u 5 1 0 6 6 3 ; 3 . N a t i o n a l I n s t i t u t e f o r T h e C o n t r o l o f P h a r m a c e u t i a l a n d B i o l o g i c a l P r o d u c t s , B e ij i n g 1 0 0 0 5 0 , C h i n a ) A b s t r a c t : ( O b j e c

7、ti v e T o e s t a b l i s h a f a s t t im e - r e s o l v e d fl u o ro i m m u n o a s s a y (T R F I A ) f o r d e t e c t i o n o f h u m a n g r o w th h o r m n e ( h G H ) b a s e d o n d i r e c t s a n d w i c h t e c h n i q u e , a n d t o p r e p a r e i t s d i a g n o s t i c re a g e

8、 n t . M e t h o d s T h e s a n d w i c h T R F I A f o r d e t e c ti o n o f s e r u m G H l e v e l u s i n g t w o a n t i - G H m A b s ( O n e m o n o c l o n a l a n t i b o d y w a s i m m o b ili z e d o n t h e s u r f a c e o f m i c ro t i te r p l a t e s t r i p w e ll s , a n o t h e

9、 r w a s l a b e l l e d w i t h E u ) . ( R e s u l t s T h e m e a s u r e r a n g e o f G H - T R F I A w a s 0 . 1 x 1 0 - U / L - 1 0 0 x 1 0 - U / L . T h e s e n s i ti v i t y w a s 0 .0 3 6 x 1 0 - U / L . T h e i n t r a - a n d i n t e r - a s s a y c o e f f ic i e n t s o f v a r i a ti

10、 o n ( C V ) w e re 5 .3 % - 8 .6 % a n d 7 . 6 %一 1 2 . 8 % , r e s p e c ti v e l y . T h e r e w a s n o c ro s s - r e a c ti o n t o T S H , F S H , L H , a n d H P L . T h e c o r r e l a ti o n c o e f f i c i e n t o f 4 3 b l o o d s a m p l e s d e t e c t e d场 s e l f - m a d e G H- T R F

11、 I A a n d c o m m e r c i a ll y a v a i l a b l e W a ll a c k i t w a s 0 .9 5 7 . ( C o n c l u s i o n ) h G H - T R F I A i s a n e w i m m u n o a s s a y w h i c h h a v e s e v e r a l a d v a n t a g e s i n c l u d i n g h i g h s e n s i ti v i t y , s p e c if i c i t y , a n d a w id e

12、 w o r k i n g r a n g e . I t i s s u i t a b l e f o r ro u t i n e c li n i c a l u s e . K e y w o r d s : g ro w t h h o r m o n e ; ti m e - r e s o l v e d f l u o ro i m m u n o a s s a y (T R F I A ) ; re a g e n t 1J S U N Y a t - s e n U n i v ( M e d S c i ) , 2 0 0 6 , 2 7 ( 4 ) :4 7 2

13、- 4 7 5 人生长激素( h u m a n g r o w t h h o r m o n e , h G H ) 作 为人体生长不可缺乏的成分，是由脑垂体前叶嗜 酸性细胞分泌的单一肤链的蛋白质激素，具有广 泛的生理功能。它通过刺激肝脏分泌类胰岛素刺 激因子， 作用于骨和软骨引起身高增长， 同时能够 促进人体蛋白质合成及脂肪分解，调节体内水盐 平衡， 以保证人体生长的需要。由于基础状态时血 清h G H的浓度极低， 放免法可以测不出， 我们拟采 用高灵敏的时间分辨荧光免疫分析( t i m e - r e s o l v e d fl u o r o i m m u n o a s s

14、a y , T R F I A ) 方法p , 2 1 ， 建立了快速检 测h G H的方法并研制了诊断试剂， 报告如下。 收稿日期: 2 0 0 5 - 1 2 - 2 9 基金项目: 广州市重大科技攻关基金资助项目 ( 2 0 0 3 U 1 3 0 0 2 1 ) 作者简介: 杭建峰 ( 1 9 7 6 - ) ， 男，内 蒙古呼和浩特人， 医师， 硕士， 主要从事免疫学诊断研究; 李 明， 教授， 通讯作者.E - m a il : m i n g l i f im m u . c o m 第 4 期 杭建峰， 等. 人生长激素的时间分辨荧光免疫分析及其诊断试剂研制 4 7 3 1 材

15、料和方法 1 . 1 材料 分别用于包被和E u 3 + 标记的两株抗h G H单克 隆 抗体及h G H 抗原均购自 美国B i o d e s i g n 公司。 9 6 孔微孔板为厦门 新创公司产品。 S e p h a d e x G - 5 0 系 P h a r m a c i a 公司产品。 E u 3 + 标记试剂盒、 专用E u 3 + f 光增强液、 Wa l l a c D E L F I A G H - T R F I A试剂盒及 A u t o - D e l fi a 1 2 3 5 全自 动时间分辨免疫荧光检测仪 均为美国P e r k i n E l m e r

16、 公司产品。 h G H国家标准品 购自中国药品生物制品检定所。h G H血清标本4 3 份及正常人标本4 1 9 份，分别来自 广州军区总医 院和南方医院。带有滤膜的离心管为M i l l i p o r e 公 司产品。其它试剂均为国产分析纯。 1 . 2 方法 1 .2 . 1 固相包 被板的制备用5 0 m m o l / L , p H 9 .6 的碳酸盐缓冲液将包被抗体稀释至5 m g / L ， 加人 到9 6 孔微孔板中， 每孔2 0 0 p ,L ， 于4过夜。弃 掉包被液， 加人封闭液， 每孔2 5 0 p ,L , 3 7 2 h 。 弃 去封闭液， 洗涤后真空抽干， 于

17、一 2 0 冷冻保存。 1 .2 . 2 E u 3 + 标记物的制备 将0 . 5 m g 标记抗体加 人到带有滤膜的离心管中，以7 0 0 0 r / m i n 离心4 m i n ( r = 1 0 c m ) 。 用标记缓冲液重复洗涤6 次后， 将 2 0 0 R L 标记抗体和0 . 5 m g E u 3 + 标记试剂充分混 匀， 于4过夜。 1 . 2 . 3 E u 3 + 标记物的纯化将标记抗体加人到 S e p h a d e x G - 5 0 层析柱( 1 c m x 3 0 c m ) 中， 用含9 g / L N a C l 的5 0 m m o l/ L T r

18、 i s - H C I 的洗脱液洗脱。收 集流出液( 1 m L / 管) ， 逐管测定蛋白含量， 合并洗 脱峰的各管， 同时以E u 3 + 标记试剂盒中的E u 3 + 标准 测定洗脱峰各管中E u 3 + 的浓度。合并后计算抗体 标记率和蛋白回收率。 1 .2 .4 参考标准品的制备 用含2 g / L B S A及 1 g / L N a N 3 的5 0 m m o l / L p H 7 .4 T ri s - H C I 缓冲液， 将 h G H抗原配制成 0 , 0 . 1 , 1 , 1 0 , 5 0及 1 0 0 x 1 0 - 3 U / L系列浓度的标准溶液，按每瓶

19、 1 m L 分装冻 干， 于一 2 0 干燥保存。 1 .2 .5 分析操作程序向包被板中加人2 5 W L h G H参考标准品或血清样本，同时加人1 : 5 0 稀 释的E u 3 * 标记抗体2 0 0 p ,L ， 于室温孵育1 h 。 用洗 涤液洗板6 次， 再加入2 0 0 p ,L 增强液振摇5 m i n 检测。 全部过程均在A u t o - D e l f i a 1 2 3 5 荧光检测仪 上完成。 1 . 2 . 6 h G H - T R F I A法检测指标准确度: 对 试剂参考标准品与相应浓度的国家标准品，同时 进行分析测定。 用双对数数学模型拟合， 比较两条

20、剂量一 反应曲线的斜率并作t 检验。 同时以h G H的 国家标准品为对照， 计算参考标准品的实测效价 与标示效价的比值。 线性范围: 将抗原参考标准 品稀释成不同浓度进行测定。 灵敏度: 以零参考 标准品( A l ) 当作样品测量2 0 次， 计算其均值及标 准差。 以A l 测定值的均值加上2 倍的标准差所得 荧光值， 代人标准曲线方程求得。精密度: 对低 中高3 个质控品( 期望值分别为1 8 , 3 4 和6 2 x 1 0 - 3 U / L ) 进行测定， 各设8 个复孔， 计算各质控品检测 值的均数、 标准差及C V值。特异性: 将促甲状 腺激素( T S H ) , 卵泡生成

21、素( F S H ) 、 黄体生成素 ( L H ) 及人胎盘催乳素( H P L ) 稀释至一定浓度后进 行测定。 正常参考值范围: 用自 制h G H - T R F I A 试剂盒检测4 1 9 份正常人血清，统计所得的h G H 浓度的分布， 数据采用软件S P S S 1 0 .0 进行统计学 处理。与国外同类产品的比较:用自 行制备的 h G H - T R F I A诊断试剂和 Wa l l a c G H - T R F I A试剂 盒同时检测血清样本 4 3份进行检测性能及相关 性比较。 2 结果 2 . 1 铺标记物的标记率和回收率 标记率和回收率分别为 7 . 5 E u

22、 3 / 抗体和 8 6 %. 2 . 2 准确度 对参考标准品与相应浓度的国家标准品同时 进行分析测定后， 用双对数数学模型拟合， 两条剂 量一 反应曲线基本平行，两条曲线的斜率分别为 0 .4 3 1 和0 .4 3 7 ( t 检验P 0 .0 5 ) 。 以h G H国家标准 品为对照品， 参考标准品的实测效价与标示效价 的比值见表1 ( 比值应在0 . 91 . 1 之间) 。剂量一 反 应曲线的线性相关系数为0 .9 9 8 . 2 . 3 线性范围和灵敏度 标准曲线的线性范围0 . 1 x 1 0 - 3 U / L - - 1 0 0 x 1 0 - 3 U / L 。以参考标

23、准品A 1 测定值的均值加上2 倍的标 准差所得的荧光值扣除本底的荧光值，代人标准 曲线方程求得灵敏度为0 .0 3 6 x 1 0 - 3 U / L o 2 . 4 精密度 4 7 4 中山大学学报( 医学科学版) 第 2 7卷 用自制h G H - T R F I A试剂分析，批内的C V 1 0 % O ， 批间的C V 1 5 % O ( 表2 ) 0 表 1 h G H - T R F I A试剂剂量一 反应曲线的准确度 T a b l e 1 A c c u r a c y o f d o s e - r e s p o n s e c u r v e f o r h G H -

24、 T R F I A r e a g e n t( n = 8 ) N S ( x 1 0 - 3 U / L ) 0 ( A)0 . 1 ( B )1 ( C ) 1 0 ( D)5 0 ( E) R S ( x 1 0 - 3 U / L )0 . 0 5 ( A 1 ) 0 - 0 . 1 R a t i o ( R S / N S ) 0 . 0 9 4 ( B 1 ) 0 . 0 9 1 - 1 . 1 2 0 . 9 4 0 . 9 1 一 1 . 1 2 1 .0 3 ( C 1 ) 0 . 9 2 - 1 . 0 7 1 . 0 3 0 . 9 2 -1 . 0 7 9 .4

25、3 ( D 1 ) 9 . 2 - 1 0 . 6 0 . 9 4 0 . 9 2 - - 1 . 0 6 4 6 .6 ( E 1 ) 4 5 . 5 - 5 4 . 3 0 . 9 3 0 . 9 1 一 1 . 0 8 1 0 0 ( F ) 1 0 6 ( F 1 ) 9 2 . 4 - 1 0 7 . 6 1 . 0 6 0 . 9 2 - 1 . 0 8 N o t e : N S = n a t i o n a l s t a n d a r d ; R S = r e f e r e n c e s t a n d a r d ; A - F : c o n c e n t r

26、 a t i o n o f n a t i o n a l s t a n d a r d ; A 1 - F l : c o n c e n t r a t i o n o f r e f e r e n c e s t a n d a r d 表 2 自制h G H试剂检测的精密度 T a b le 2 A c c u r a c y d e t e c te d b y s e lf - m a d e h G H r e a g e n t _I n tra - a s s a y G r o u p . . ,. * , . . . , . , . ., 下不万只一下尸灭万下万不不

27、厂一下万瓜下一一丁万不丁不 石 A T 7 I I r ( M _ L ot I N O. V4I VLJ l , Y t % 0LOL I N O. VJV 1 1 Vb V % O) LUL i N V. VJVYG J l .，、/ o ( n = 8 , x 1 s ) I n t e r - a s s a y 3 l o t sC V( %) OOQ八乙曰 : ZQ八了 j且 OR，1 .-. 001、乙U 4凡、了0 7扮、亡 乙U，4 : R7乙U Q C L Q C M Q C H 1 6 . 1 1 1 . 3 8 3 6 . 5 1 2 . 6 3 6 5 . 2 1 4

28、 . 1 7 1 5 . 8土1 . 1 7 3 5 . 5 1 1 . 8 8 6 4 . 3 1 3 . 6 0 1 7 . 3士1 . 3 8 3 6 . 1士2 . 0 9 6 5 . 7土4 . 0 7 1 6 . 4 1 2 . 1 0 3 5 . 7士3 . 1 4 6 5 . 4士4 . 9 7 Q C : q u a l it y c o n t r o l L : l o w c o n c e n t r a t i o n ; M : m e d i u m c o n c e n t r a t i o n ; H : h i g h c o n c e n t r

29、a t i o n 0 4 摆洲州1阁国卜 2 . 5 特异性 将2 0 0 w g / L T S H , 4 0 U / L F S H 、 1 5 0 U / L L H及 2 0 0 留 L H P L ， 用自 制的h G H - T R F I A试剂测定后， 所获G H的水平均为O x 1 0 - 3 U / L o 2 . 6 正常值范围 用h G H - T R F I A试剂对4 1 9 例正常人( 男2 0 0 例， 年龄1 97 8 岁; 女2 1 9 例， 年龄1 87 6 岁) 血清 G H的水平检测表明，血清h G H水平的正常参考 值范围是0 - 2 4 .5

30、x 1 0 - 3 U / L ，成年人男性h G H水平 相对低于女性， 但无统计学差异。 2 . 7 自制h G H试剂与国外试剂盒的比较 对 4 3 份临床标本同时使用自制 G H - T R F I A 试剂和Wa l l a c G H - T R F I A试剂盒检测结果( 表 3 , 6 0 2 0 0 d02 04 06 0 8 0 1 0 0 图 1自制 h G H 试 剂 与 Wa l l a c - GH 试剂盒检 测血清 h G H的相关性 图 1 ) 表 3 F i g . 1 C o r r e l a t i o n o f s e rum h G H d e t

31、 e c t e d b y h G H r e a g e n t a n d Wa l l a c - G H k i t ( r - 0 . 9 5 7 ) 自制 h G H试剂与国外 Wa l l a c - G H试剂盒检j n 1 性能 的 比较 3 讨论 T a b l e 3 C o m p a r i s o n o f d e t e c t i n g r e s u l t s o f b e t w e e n s e l f - m a d e h G H r e a g e n t a n d Wa l l a c - G H k i t S e l f - m

32、a d e h G H r e a g e n t W a l l a c - G H k i tI n d e x S e n s it iv it y ( x 1 0 - 3 U / L ) L in e a r r a n g e ( x 1 0 U / L ) P r e c i s i o n ( % ) S t a b i l i t y 0 .0 3 6 0 . 1 一 1 0 0 C V8 . 6 1 0 m o n t h s a t 4 C 0 .0 3 0 . 1 一 1 0 0 C V6 . 5 I y e a r a t 4 C 成熟的h G H是由1 9 1 个氨基

33、酸组成，生物活 性片段位于氨基端 1 3 4个氨基酸。循环血中有多 种类型的h G H ，以相对分子质量M , 2 2 x 1 0 ， 为主， 另有5 % - 1 0 % 是生物活性、 免疫活性较低的h G H , 及少量h G H二聚体ll l a h G H对生长发育、 生殖起决 定性作用。 实验表明随着年龄的增长， h G H水平下 第 4期杭建峰， 等. 人生长激素的时间分辨荧光免疫分析及其诊断试剂研制4 7 5 降， 成为衰老及生殖功能下降的主要原因4 - 6 1 。 用哺 乳类细胞合成的第四代人工合成 G H的氨基酸序 列与自 然人G H完全一致， 同时减少了抗原性， 为临 床应用

34、的进一步扩展奠定了基础。目 前生长激素 已 用于: 治疗儿童青春前期生长迟缓， 成人生 长激素缺乏症， 治疗心功能不全， 治疗骨质疏 松， 抗衰老。 标记免疫技术是利用免疫反应的高度特异性 和标记示踪物的高度灵敏性相结合而建立的一大 类微量物质检测技术的总称， T R F I A作为新兴的 超微量标记免疫检测技术之一，是采用斓系元素 离子及其赘合物17 .8 1标记抗原或抗体， 在荧光检测 时采用了特殊的时间延迟、波长分辨及解离增强 技术，同时对蛋白质实现了原子标记， 标记位点 多， 对标记物的影响小， 克服了传统标记技术的缺 陷， 其反应模式也有夹心法和竞争抑制法等多种 形式， 与现有的检测

35、方法( 放免法和化学发光法) 相比较， 具有灵敏度高、 操作简便、 特异性强、 标记 物稳定、 标准曲线范围宽、 可重复测量、 不受样品 自然荧光干扰及无放射性污染等优点。以上优势 是因为T R F I A具有独特的荧光特性 ( 特异性荧光 的衰变时间极长， 为传统荧光的1 0 3 _ 1 0 6 倍。激发 光与发射光的之间的S t o k e s 位移可达2 9 0 n m ， 而 普通荧光素的S t o k e s 位移仅为2 8 n m ，提高了试 剂的稳定性) 。试剂盒标准曲线飘移小， 对于同批 次检测的试剂， 可以设定参考曲线或使用两点定 标进行测量， 以减少医院检测的成本。 目 前

36、生长激 素临床主要使用放免法进行测定，但是该法具有 同位素污染且灵敏度较低， 危险性大， 因此要求新 的技术以适应检测的需要。采用T R F I A技术检测 h G H灵敏度达到0 .0 3 6 x 1 0 - 1 U / L ， 与国外同类试剂 ( W a l l a c ) 的灵敏度( 0 .0 3 x 1 0 - 1 U / L ) 较为接近; 标准 曲线范围宽，可以达到0 . 1 x 1 0 1 U / L 1 0 0 x 1 0 - 3 U / L ， 适应不同检测的需要; 三批试剂的精密度评价 表明， 自 制试剂无论是批内还是批间的C V全部达 到临床测试要求( 批内C V 1 0

37、 %， 批间C V 1 5 %) , T R F I A方法的重复性好。交叉反应结果表明， 与 T S H , F S H , L H及 H P L 均未见有交叉反应. 自制试 剂检测的特异性较强。 本法检测时间短， 仅为 1 h , 可实现快速检测。 参考文献: A M I Y A N , A M A N O M , T A K A H A S H I A , e t a l . E ff e c t s o f t a n k c o l o r o n m e l a n i n - c o n c e n t r a t i n g h o r m o n e l e v e l s

38、i n t h e b r a i n , p i t u it a ry g l a n d , a n d p l a s m a o f t h e b a r fi n fl o u n d e r a s re v e a l e d b y a n e w l y d e v e l o p e d t i m e 一 r e s o l v e d fl u o ro i m m u n o a s s a y 田. G e n C o m p E n d o c r i n o l , 2 0 0 5 , 1 4 3 ( 3 ) : 2 5 1 - 2 5 6 . O K U

39、M U R A T , Y O S H I D A K , N I K A I D O H . O v a r i a n d e v e l o p m e n t a n d h e m o l y m p h v i t e ll o g e n i n l e v e l s i n l a b o r a t o ry - m a i n t a i n e d p ro t a n d r i c s h r i m p , P a n d a l u s h y p s i n o t u s : m e a s u r e m e n t b y a n e w l y d e

40、 v e l o p e d t i m e - r e s o l v e d fl u o ro i m m u n o a s s a y ( T R - F I A ) J . Z o o l o g S c i , 2 0 0 4 , 2 1 ( 1 0 ) : 1 0 3 7 - 1 0 4 7 . H I R T H , K I M E L M A N J , B I R N B A U M , M J , e t a l . T h e h u m a n g ro w t h h o r m o n e g e n e l o c u s : s t r u c t u re

41、 , e v o l u t i o n , a n d a ll e li c v a r i a t i o n s 田. D N A , 1 9 8 7 , 6 ( 1 ) : 5 9 - 7 0 . K U WA H A R A S , K E S U M A S A R I D , T S U K A M O T O Y , e t a l . A g e - re l a t e d c h a n g e s i n g r o w t h h o r m o n e ( G H ) - r e l e a s i n g h o r m o n e a n d s o m a

42、t o s t a i o n n e u ro n s i n t h e h y p o t h a l a m u s s a n d i n G H c e ll s i n t h e a n t e r i o r p i t u i t a ry o f f e m a l e m i c e 田. B r a i n R e s , 2 0 0 4 , 1 0 2 5 ( 1 - 2 ) : 1 1 3 一 1 2 2 . WOL L E R e t a l . M J , E V E R S O N - B I N O TTO G , N I C H O L S E , A

43、g i n g - re l a t e d c h a n g e s i n h o r m o n e a n d l u t e i n i z i n g h o r m o n e i n re l e a s e o f g r o w t h f e ma l e r h e s u s mo n - k e y s 田. C li n E n d o c r i n o l M e t a b , 2 0 0 2 , 8 7 ( 3 ) : 5 1 6 0 - 5 1 6 7 . C O R P A S E , H A R MA N S M , B L A C K M A N

44、 M R . H u m a n g ro w t h h o r m o n e a n d h u m a n a g i n g 田. E n d o c r R e v , 1 9 9 3 , 1 4 ( 1 ) : 2 0 - 3 9 . F I E T J , G I T O N F , F I D A A I , V A L L E I X A , e t a l . D e v e l o p m e n t o f a h i g h l y s e n s i t i v e a n d s p e c i f i c n e w t e s t o s t e ro n

45、e t i m e - re s o l v e d fl u o ro i m m u n o a s s a y i n h u m a n s e r u m 团. S t e ro i d s , 2 0 0 4 , 6 9 ( 7 ) :4 6 1 - 4 7 1 . T A K A H A S H I T , H A M A N A K A S , I M A I K , e t a l . A d i re c t t i m e - r e s o l v e d fl u o ro i m m u n o a s s a y ( T R - F I A ) f o r m e a s u r i n g p l a s m a e s t r a d i o l - 1 7 b e t a c o n c e n t r a t i o n s i n c a t t l e J . V e t M e d S c i , 2 0 0 4 , 6 6 ( 3 ) : 2 2 5 - 2 2 9 . ( 编辑 张敏瑞)