兔脊髓缺血再灌注损伤的病理特征变化.pdf

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1、 4 6 8四川医学 2 0 0 7 年 5 月第 2 8 卷( 第 5期) S i c h u a n .M e d i c a l J o u r n a l , 2 0 0 7 , V o l . 2 8 , N o . 5 . 实 1 1 研究 . 兔脊髓缺血再灌注损伤的病理特征变化 曾 俊， 方 华， 王泉云 ， 李昌 熙 ( 四川大学华西医院麻醉科， 四川 成都 6 1 0 0 4 1 ) ( 摘要】 目的探讨不同程度缺血再灌注损伤奋位的病理变化特征及其意义。方法4 0只成年家兔随机均分为假 手术组、 缺血3 0 m i n 组、 缺血4 5 m i n 组和缺血6 0 m i n

2、 组， 以肾下腹主动脉阻断法制备奋位缺血再灌注模型， 术后2d时， 来 用免疫组织化学法和苏木精一 伊红染色 观察腰位病理学改变。结果缺血时间越长， 再灌注奋位病理损伤程度越重， 伤 后2 d 时可见受 损奋位发生出 血、 水种、 变性坏死， 白细胞浸润以 及N F - K B 声, I C A M - 1 表达增加。结论该模型其有重 复性好， 能较好地反映分级缺血再灌注损伤脊砒的病理变化特点。 【 关键词】 奋做; 缺血/ 再灌注损伤; 病理学 t 中图分类号 R - 3 3 文献标识码l 文章编号1 1 0 0 4 - 0 5 0 1 ( 2 0 0 7 ) 0 5 - 0 4 6 8 -

3、 0 3 T h e p a t h o l o g y o f s p i n a l c o r d f o ll o w l o g i s c h e m i a r e p e r f u s i o n坷u r y w it h d i f f e r e n t d e g r e e s . Z e n g J u n . F a n g H u a ， W a n g Q u a n y u n . e t a l . W e s t C h i n a H o s p it a l ， S i c h u a n U n i v e r s 沂 C h e n g d u

4、. S i c h u a n 6 1 0 0 4 1 ， C h i n a ( A b s t r a c t ) O b j e c t i v e T o in v e s t ig a te t h e p a th o lo g i c a l c h a r a c t e r s o f s p i n a l c o r d a ft e r g r a d e d i s c h e m ia / re p e r fu s i o n i n j u ry a n d its s i g n i f i c a n c e . Me t h o d s T h e m o

5、 d e l o f i s c h e m i c a n d r e p e r f u s i o n a l i n u ry o f s p i n a l c o r d w a s c r e a t e d场 c l a m p i n g t h e i n fr a r e n a l a o rt i c i n r a b b i t s 4 0 a d u l t r a b b i ts , w h i c h w e re r a n d o m l y d i v i d e d i n t o s h a m - o p e r a t i o n g r o

6、 u p , i s c h e m i a f o r 3 0 m in , 4 5 m i n a n d 6 0 m i n g ro u p . A f t e r 2 d a y s o f r e p e r f u s i o n , t h e p a t h o l o g i c a l c h a n g e s o f l u m b a r s e g m e n t a l s p i n a l c o r d w e r e o b s e r v e d w i t h t h e H E s t a i n i n g a n d i m m u n o h

7、 i s t o l o g - i c a l m e t h o d . R e s u l t s T h e l o n g e r th e i s c h e m i c t i m e , t h e m o r e s e v e r e t h e p a t h o l o g i c a l d a m a g e o f s p i n a l c o r d t i s s u e a ft e r r e p e r f u s i o n a l i n - j u r y . H e m o r r h a g e , s w e ll i n g , d e

8、g e n e r a t i o n o f t h e l u m b a r s p i n a l c o r d t i s s u e , t h e re m a r k a b l e e x p r e s s i o n o f I C A M - I , N F - K B p “ a n d l e u k o - c y t e s i n f il tr a t i o n o c c u r r e d i n r e p e r f u s i o n 4 8 h o u r s . C o n c l u s i o n T h i s m o d e l w

9、 a s re p r o d u c i b l e f o r t h e p a t h o l o g i c a l c h a r a t e r s g r a d e d s p i n a l c o r d i s c h e m i a / re p e r f u s i o n i n j u ry c o m p a r d w i t h o t h e r m o d e l s . ( K e y w o r d s ) s p in a l c o r d ; is c h e m ia / re p e r f u s io n in j u ry ; p

10、 a th o l o g y 胸降主及胸腹主动脉瘤手术中脊髓缺血损伤的范 围常常是有限的， 而再灌注可能引起损伤的范围和程 度加重， 导致脊髓不同程度缺血再灌注损伤， 出现脊髓 运动感觉传导功能障碍 甚至截瘫川。 脊髓缺血再灌注 损伤( s p in a l c o r d is c h e m i c re p e r f u s io n i n j u ry , S C I R I ) 的病 理学机制研究已成为现代医学和神经科学领域的难题 和热点。本实验利用兔分级S C I R I 模型， 对场脊髓前 角NI一I X 区不同程度损伤情况进行病理学研究， 探讨 脊髓组织病理变化规律， 为

11、 S C I R I 的治疗提供必要的 实验依据。 1 材料与方法 1 . 1 实验分组及动物模型的建立: 健康新西兰大白兔 4 0 只， 手术当日晨禁食、 禁水， 雌雄不限， 体重 2- 2 . 5 k g ， 随机分为假手术组( C O ) 、 缺血3 0 m i n 组( C 3 0 ) , 缺血4 5 m i n 组( C 4 5 ) 和缺血6 0 m i n 组( C 6 0 ) ， 每组 1 0只。 1 . 5 % 戊巴比妥钠( 3 0 m g / k g ) 耳缘静脉麻醉动物后， 采 用左肾动脉下腹主动脉阻断法建立脊髓缺血再灌注损 伤模型， c o 只进行手术操作， 不阻断腹主动

12、脉。证实 钳夹点以下腹主动脉搏动完全消失后， 各缺血组分别 阻断3 0 m i n , 4 5 m i n 和 6 0 m i n后松夹， 逐层关腹， 再灌注 时间均为4 8 h 。术中肛温维持在3 6 - 3 7 0C , 1 . 2 试剂: 鼠 抗兔核转录因子一 B p 6 5 ( N F - ic B p 6 5 ) 多克 隆抗体、 细胞间粘附分子( I C A M - 1 ) 多克隆抗体及S A B C 试剂盒、 二氨基联苯胺( D A B ) 显色试剂盒。 1 . 3 术中监测: 观察循环情况及生命体征( T , P , R及 B P ) 。动物麻醉后即监测心电图( E C G )

13、、 经皮脉搏氧饱 和 度( S p 仇) 及肛温。左颈部去毛备皮， 消毒铺巾， 颈动 脉波动最强点上方取长约 3 c m纵行切口， 切开皮肤及 皮下组织， 暴露左侧颈动脉， 插人肝素化导管( 长度 2 c m左右) ， 通过三通管与多导生理监护仪的传感器连 接， 进行平均动脉压( M A P ) 测定， 术毕拔除导管， 缝合 皮肤。 1 . 4 标本采集: 再灌注4 8 h 后， 各组动物再次麻醉， 使其俯卧位， 将四肢固定于手术台上。背部消毒铺巾， 咬骨钳咬除棘突， 打开1 -2 一 L u 椎板暴露脊髓， 迅速分 基金项目: 高等学校博士学科点专项科研基金( 项目 编号: B 1 2 0

14、0 3 6 1 0 0 8 7 ) 资助乙通讯作者 四川医学 2 0 0 ， 年5 月第2 8 卷( 第 ， 期) S ic h u a n M e d i c a l J o u r n a l , 2 0 0 7 . V o l . 2 8 , N o . 5 4 6 9 离并取出1 -3 节段脊髓组织， 在保证脊髓完整性的情况 下剥去脊髓神经根及大部脊膜， 并于 1 0 %福尔马林中 固定， 留做病理组织学和免疫组织化学研究。 1 . 5 病理学观察2 ,3 1 . 5 . 1 石蜡切片的制作及苏木精一 伊红染色: 按常规 方法进行。 1 . 5 . 2 N F - rcB p 6 5

15、和I C A M - 1 的表达: 采用S A B C 免疫 组织化学法， D A B显色， 空白对照以P B S 替代第一抗 体。 显微镜下观 察阳 性表 达位置 及 强度， N F - tc B p 6 5 和 I C A M - 1 蛋白表达阳性的细胞特征定义为胞浆胞膜着 色， 呈黄色或棕黄色， 摄片结果传入。 1 y m p u s B X 5 1 图 像采集分析系统进行N F - u B p 6 5 和I C A M - 1 表达的定 量分析， 结果自动输人S P S S 1 3 . 0 ， 分别统计各时间点阳 性细胞数， 作为此片的阳性细胞计数。 1 . 5 . 3 组织病理学观察

16、及前角正常神经元计数: 观察 脊髓损伤后的一般病理学改变、 神经元形态变化及分 布， 并根据 R e x e d 的脊髓灰质分区标准， O l y m p u s B X 5 1 图像采集分析系统行脊髓前角( w一I X 区) 正常运动神 经元和异常运动神经元计数。前角运动神经元异常率 计算公式参照文献如下: 运动神经元异常率( %) = 每 张切片的所选视野中的异常运动神经元数/ 该视野中 运动神经元总数x 1 0 0 %, 1 . 5 . 4 正常运动神经元标准形态学特征的判别标准: 下列三项中， 出现任何一项， 均可鉴定为正常运动神经 元。 细胞呈多角形， 胞体直径3 0 一 6 0 K

17、 m ; 胞核居 中， 呈圆形， 轮廓清晰; 核仁明显， 胞浆染为红色， 内 有正常的尼氏体( 均匀分布的嗜碱性颗粒) 。 1 . 5 . 5 异常运动神经元形态学特征的判别标准: 下列 三项中， 出现任何一项， 均可鉴定为异常运动神经元。 胞体肿胀; 胞浆疏松， 胞膜与周围分界不清; 胞 核固缩或消失、 神经元内含泡状核和核仁突起， 核膜边 界不清， 或核破碎、 核溶解， 或核仁消失。 1 . 6 统计学方法: 数据资料以均数t 标准差( its ) 表 示， 多组间I C A M - 1 和N F - ic B p 6 5 表达变化采用单因素 方差分析和9 检验， 神经 元计数评分采用K

18、r u s k a l - w a l - Ii 。 检验， 神经元异常率的比较采用卡方检验。统计软 件为 S P S S 1 3 . 0 , 长， N F - tc B p 6 5 和I C A M - 1 蛋白表达的细胞胞浆胞膜染 色逐渐增强， 组间比较差异均有统计学意义( p C 4 5 C 3 0 C O , 2 . 3 组织病理学变化: 损伤脊髓表面可视血管网变 细， 外观苍白， 中央灰质区可见小的点状暗红色出血 灶。C O 脊髓腹侧前角珊、 I X 区正常运动神经元数目均 值为( 2 5 . 5 6 :t 2 . 3 1 ) 个/ 视野， 运动神经元异常率为0 , 运动神经元轮廓清

19、晰， 多极形， 核圆， 核仁清楚， 可以看 到清晰的树突和轴突， 胞浆均匀深染， 整个组织结构完 整、 清楚， 无中性粒细胞( P M N ) 浸润、 出血、 水肿等异常 现象。C 3 0 脊髓灰质结构稍乱， 神经元周围间隙增加， 神经元轻度肿胀， 部分神经元核仁不清， 组织中有少量 P M N 浸润， 可见出血灶。C 4 5 神经元肿胀， 神经元周围 间隙增加明显， 极性变钝， 核仁不清， 组织中可见散在 P M N ， 部分神经元变性坏死， 空泡形成少， 出血灶明显， 有较多异常神经元。C 6 0 脊髓前后径明显缩短， 灰质 结构混乱， 灰质区大部分神经元变性坏死， 广泛空泡形 成， 出现

20、大片状出血灶， 组织中可见大量P M N浸润， 残 存神经元稀疏。1 -3 节段损伤情况归纳见表1 。各缺血 组正常运动神经元计数和运动神经元异常率表现为不 同程度的改变， 总体变化趋势分别为C O C 3 0 C 4 5 C 6 0 和C 6 0 C 4 5 C 3 0 C O ， 组间比较差异均有统计 学意义( P 0 . 0 5 ) . 2 . 2 脊髓组织I C A M - 1 和N F - K B p 6 5 的表达: C O 脊髓 组织N F - jc B p 6 5 蛋白的 表达均呈弱阳 性， 未见有细胞I - C A M - 1 蛋白表达阳性着色。随着腹主动脉阻断时间延 中枢神

21、经系统的主要功能包括分析、 整合和传递 信息， 脊髓第V d 区相当于前角后部， 网状脊髓束、 前庭 脊髓束和内 侧纵束的 纤维终于第X 71 区 a ) 。 第Ix区由。 - 运动神经元、 Y 一 运动神经元和许多中间神经元组成， 相 当于前角前内侧核和前外侧核。研究发现， 脊髓损伤 后运动功能障碍的产生可能与运动神经元和神经纤维 4 7 0 四川医学 2 0 0 7年 5 月第 2 8 卷( 第5 期) S i c h u a n M e d i c a l J o u r n a l , 2 0 0 7 , V o l . 2 8 , N o . 5 的变性坏死等病理改变密切相关 5 0

22、 本研究观察到哺乳动物脊髓对缺血灌注损伤的反 应十分敏感， 肾下腹主动脉阻断法可导致腰段脊髓神 经元损害， 缺血再灌注损伤4 8 h即可见神经元肿胀、 染色质溶解、 核固缩等变性坏死病理改变。随着脊髓 缺血时间延长， 再灌注4 8 h 时各组脊髓灰质神经元表 现为稀疏、 崩溃、 溶解， 轴突肿胀、 扩大、 消失等不同程 度的变性或坏死， 神经元异常率逐渐上升。C 6 0脊髓 姗、 I X 区正常神经元数目明显减少或细胞结构不清， 运 动神经元异常率高达 8 7 . 7 5 %, 脊髓灰质出现神经元 广泛性坏死或溶解甚至海绵状空泡样结构等脊髓重度 病理学变化; C 4 5 表现为神经元肿胀及核固

23、缩等脊髓 中度病理学改变， C 3 0 则为神经元轻度肿胀、 周围间隙 增加等脊髓轻度病理学改变， 提示肾下腹主动脉血流 阻断3 0 m i n , 4 5 m i n 及6 0 m i n 后再灌注早期运动神经元 即受到不同程度损害， 分别引起脊髓轻、 中和重度缺血 再灌注损伤， 说明腹主动脉血流阻断时间与脊髓分级 病理学改变有关。 P M N 浸润缺血脊髓组织是脊髓再灌注损伤的重 要特征， P M N引起的脊髓损伤主要发生在腹主动脉开 放后再灌注过程中 6 。 本研究观察到 脊髓缺 血再灌注 损伤( S C I R I ) 的同时伴有大量的P M N浸润， P M N浸润 数目随缺血时间延

24、长再灌注后增加， 其中C 6 0脊髓组 织中可见大量的 P M N浸润， 大片状出血灶; C 4 5 脊髓 组织可见明显 P M N浸润， 出血灶明显; C 3 0 脊髓组织 中有少量P M N浸润和出血灶。说明缺血再灌注损伤 的脊髓表现为明显的炎性病理改变， 组织炎性反应与 脊髓缺血再灌流损伤关系密切， 而炎性细胞尤其是 P M N 在S C I R I 中起到重要作用， 提示早期抗感染治疗 可能成为减轻S C I R I 的一种新的 途径 7 l 0 N F - ic B p 6 5 是一种普遍存在于中枢神经系统等各 种组织细胞中的 转录因子 8 ， 通过调控编码细胞因 子、 生长因子、

25、细胞粘附分子和一些急性期蛋白的基因， 在 生物体的免疫应答、 炎性反应、 细胞应激、 细胞增殖分 化及凋亡等的调控中具有重要作用。研究表明， 鼠脊 髓损伤后脊髓组织N F - ic B 两5 表达增强， 应用 N F - rc B 抑制剂毗咯烷二硫氨基甲酸醋( p y r r o l id in e d i th io c a r b a - m a t e , P D T C ) 能够调节N F - IC B p 6 5 和I C A M - 1 m R N A的表 达 下降9 “ 0 o P M N的活化及对组织的损伤程度主要 依赖于其与内皮细胞之间的相互作用， 其中， I C A M -

26、 1 等能与活化 P M表面的配体相应地结合， 在介导内皮 细胞和P M N粘附、 聚集、 浸润及释放炎性细胞因子过 程中 起到重要作用 ” 。本研究中， C O 脊髓组织N F - ic B p 6 5 蛋白表达呈弱阳性， I C A M - 1 表达阴性。而脊髓组 织N F - ic B 两 5 和I C A M - 1 蛋白表达随脊髓缺血时间延 长逐渐增加。与此同时， 大量P M N浸润脊髓组织. 提 示缺血再灌注后脊髓组织 N F - tc B p 6 5 活化， 迅速诱导 靶基因的转录， 启动炎性信号转导系统， 诱导损伤组织 I C A M - 1 表达增加， 在炎性反应早期 I C

27、 A M - 1 介导 P M N 游出， 并向 损伤 部 位聚 集 I I I ， 说明N F - #c B p 6 5 和I C A M - 1 的高表达可 能导致P M N 浸润增加 1 2 , 13 1 ， 加重了缺血 脊髓组织的损伤。 参考文献 : 1 B a l l a r d J L . T h o r a c o a b d o m i n a l a o r ti c a n e u ry s m r e p a i r : h i s t o r i c a l r e v ie w a n d d e s c r i p t i o n o f a r e - e n g

28、 in e e r e d t e c h n i q u e J . P e r s p e c t V a s e S u r g E n d o v a s c T h e r , 2 0 0 5 , 1 7 ( 3 ) : 2 0 7 2 1 5 成令忠， 钟翠平， 蔡文琴. 现代组织学【 M . 上海: 上海科学技术文 献出版社， 2 0 0 3 , 3 8 一 3 9 R o s e n b l u m W I . H i s t o p a t h o l o g ic c lu e s t o t h e p a t h w a y s o f n e u ro n a l d

29、 e a t h f o ll o w i n g i s c h e m ia / b y p o x i a J . J N e u r o t r a u m a , 1 9 9 7 , 1 4 ( 5 ) : 3 1 3 L m K , L ia n g C L , C h e n g H J , “a l . I n j u ry s e v e r it y a n d c e l l d e a t h m e c h a - n i s m s : e ff e c t s o f c o n c o m i ta n t h y p o v o l e m i c h y p

30、 o t e n s io n o n s p in a l c o r d i s - c h e n v a 一 二 p e r f u s i o n i n r a t s J . E x p N e tr o 1 , 2 0 0 4 , 1 8 5 ( 1 ) : 1 2 0 一 1 3 2 S p r i n g e r 犯. A p o p to t i c c e l l d e a t h f o l l o w i n g tr a u m a t i c in j u r y t o th e c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m

31、 J . J B i o c h e m M o l B i o l , 2 0 0 2 , 3 5 ( 1 ) : 9 4 一 1 0 5 H i ro s e K , O k a j i m a K , T a c k s Y , e t a l . A c t i v a t e d p ro t e i n C r e d u c e s t h e i s - c h e m i a / r e p e r f u s io n - i n d u ce d s p i n a l c o r d i n j u ry in r a t s b y i n h i b it in g

32、 n e u - t r o p h il a c ti v a t io n J 1 . A n n S u r g , 2 0 0 0 , 2 3 2 ( 2 ) : 2 7 2 一 2 8 0 R e e c e T B , O k o n k w o D O , E l l m a n P I , a l . T h e e v o l u t i o n o f is c h e m ic s p i n a l c o r d i n j u ry i n f u n c t i o n , c y t o a r c h i te c t u r e , a n d i n f

33、l a m m a t io n a n d t h e e ff e c t s a d e n o s i n e A 2 A r e c e p t o r a c t i v a t i o n ( J . J T h o r a c C a r d i o v a s c S u r g , 2 0 0 4 , 1 2 8 ( 6 ) : 9 2 5 9 3 2 M i s c u s i M , E b n e r F , C e c c a r ig l i a S , et a l . E a r l y n u c l e a r f a c t o r - k a p p

34、a B a c t i - ，.J，.es月 56 r.Lr v a t i o n a n d i n d u c i b l e n i t r i c o x id e s y n t h a s e e x p re s s io n i n i n j u r e d s p in a l c o r d n e u r o n s c o r r e l a t i n g w i t h a d if f u s e r e d u c t i o n o f c o n s t i tu t iv e n it r ic o x i d e s y n - t h a s e

35、a c t i v i t y J . J N e u r o s u r g S p i n e , 2 0 0 6 , 4 ( 6 ) : 4 8 5 一 4 9 3 9 B r a m b i l l a R , B r a c c h i - R ic a r d V , H u W H , e t “ . I n h i b i t i o n o f a s t ro g l ia l n u - c l e a r f a c to r k a p p a B r e d u c e s i n fl a m m a ti o n a n d i m p ro v e s f u

36、 n c t io n a l r e c o v e ry a f t e r s p i n a l c o r d i n j u ry J . J E x p M e d , 2 0 0 5 , 2 0 2 ( 1 ) : 1 4 5 一 1 5 6 1 0 L a R o s e G , C a r d “ S , G e n o v e s e T , a l . I n h ib i t i o n o f t h e n u c l e a r f a c t o r - k a p p a B a c t i v a t io n w i t h p y r r o l id

37、 i n e d i th e i o c a r b a m a t e a t t e n u a ti n g i n fl a m m a - t i o n a n d o x i d a t iv e s tr e s s a f t e r e x p e r i m e n t a l s p i n a l c o r d t r a u m a i n r a ts J . J N e u ro s u r g S p i n e , 2 0 0 4 , 1 ( 3 ) : 3 1 1 一 3 2 1 川 B a r k h a u s e n T , W e s t p

38、h a l B M , P u t z C , “ . D e h y d ro e p i a n d ro s te ro n e a d m i n - i s t r a t io n m o d u l a te s e n d o th e l i a l a n d n e u t ro p h i l a d h e s i o n m o l e c u l e e x p r e s s i o n i n v it r o J . C r it C a r e , 2 0 0 6 , 1 0 ( 4 ) : 1 0 9 1 2 K a n g J S , Y o o n

39、Y D , H a n M H , a l . G l a b r i d i n s u p p r e s s e s i n te r c e ll u l a r a d - h e s i o n m o l e c u le - 1 e x p r e s s i o n i n t u m o r n e c r o s i s f a c t o r - a l p h a - s t i m u l a t e d h u - m a n u m b i l i c a l v e i n e n d o t h e l ia l c e ll s b y b l o c k

40、 i n g s p h in g o s i n e k i n a s e p a t h - w a y : i m p l i c a t io n s , o f A k t , e x t r a c e l u l a r s i g n a l - re g u l a t e d k in a s e , a n d n u c l e r a f a c t o r - k a p p a B / R e l s ig n a l i n g p a t h w a y s J ) . M o l P h a r m a c o l , 2 0 0 6 , 6 9 ( 3

41、) : 9 4 1 .9 4 9 1 3 L iu H Q , W e i X B , S u n R , “a l . A n g io t e n s in II s t i m u l a t e s i n t e r ce ll u l a r a d - h e s i o n m o l e c u le - 1 v ia a n A T l r e c e p t o r / n u c l e a r f a c t o r - k a a p p a B p a t h w a y i n b r a i n n t ic ro v a s c u l a r e n d o t h e l i a l c e l l s J . L if e S c i , 2 0 0 6 , 7 8 ( 1 2 ) : 1 2 9 3 - 1 2 9 8 ( 收稿日 期: 2 0 0 6 - 1 1 - 0 6 )