《化学诱导剂对血小板钙离子浓度变化的影响.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《化学诱导剂对血小板钙离子浓度变化的影响.pdf（3页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、作者单位： 100853 北京， 解放军总医院临床检验科 临床实验诊断研究 化学诱导剂对血小板钙离子浓度变化的影响 邓新立 丛玉隆 李绵洋 王俊玫 【摘要】 目的 探讨化学诱导剂作用下不同人群血小板钙离子浓度的变化。方法 （1） 以不同 浓度的 ADP、 凝血酶、 胶原、 花生四烯酸、 5-HT 激活血小板， 用流式细胞仪观察 20 例正常健康人血小 板钙离子浓度变化。 （2） 用 ADP、 胶原、 花生四烯酸、 5-HT 激活血小板， 用流式细胞仪观察心肌梗死 患者及高血压患者 （各 20 例） 血小板钙离子浓度的变化。 （3） 用花生四烯酸激活血小板， 用流式细胞 仪观察 20 例心肌梗死
2、患者口服阿司匹林前后血小板钙离子浓度的变化。结果 （1） ADP、 瑞斯托酶 素、 胶原、 花生四烯酸、 5-HT 血小板激活剂均可导致血小板钙离子浓度升高 （P 0. 05） ， 而且在一定 范围内， 钙离子浓度的升高幅度随激活剂的浓度升高而增加。没有观察到凝血酶导致血小板钙离子 浓度升高。 （2） 同样激活剂刺激下， 心肌梗死患者和高血压患者血小板钙离子浓度升高的幅度均高 于正常健康人 （P 0. 05） 。 （3） 服用阿司匹林后心肌梗死患者血小板钙离子浓度下降的幅度低于正 常健康人 （P 0. 05） 。结论 化学诱导剂对血小板的激活过程与钙离子浓度的变化密切相关； 心肌 梗死、 高血
3、压患者可能存在血小板钙通道活性增高； 钙离子能反应服用阿司匹林后血小板的功能状 态， 检测血小板钙离子对阿司匹林的疗效监测有一定的价值。 【关键词】 血小板； 钙离子 Ca2 +Concentration change in platelets activated by chemical agonist DENG Xin-li， CONG Yu-long， LI Mian-yang，WANG Jun-mei. Department of Clinical Laboratory，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853， China 【Abstrac
4、t】 Objective To observe the Ca2 +concentration changes in the platelets activated by chemical agonist in different study group treated with aspirin. Methods We measured the Ca2 +concentration in the platelets activated by different concentration of ADP，thrombin，collagen，arachidonic acid and 5-HT wit
5、h the flowcytometer in normal health（n = 20） . We measured the Ca2 +concentration in the platelets activated by ADP，collagen，arachidonic acid and 5-HT in myocardial infarction（n =20）and hypertension （n =20） . We measured the Ca2 +concentration in the platelets activated by arachidonic acid in myocar
6、dial infarction（n = 20）treated with aspirin. Results As the concentrations of ADP，thrombin，collagen， arachidonic acid and 5-HT increased，the Ca2 +concentration in the platelets increased. There was the relation between agonist concentration and Ca2 +concentration. Activated by the same agonist，the C
7、a2 + concentration in the platelets showed more increase in myocardial infarction and hypertension than in normal health. The Ca2 +concentration show less increase in myocardial infarction treated with aspirin than in normal health. Conclusion The procedure which chemical agonist activating platelet
8、s is related to Ca2 + concentration. The activity of Ca2 +channels in platelets is high in myocardial infarction and hypertension. Examining the Ca2 +concentration in platelets is helpful to supervise the aspirin therapy in myocardial infarction. 【Key words】 Platelet； Calcium 血小板广泛参与人体内的血栓与止血过程， 同 时
9、还与血管病变 （如动脉粥样硬化） 有密切关系。 钙离子作为血小板细胞内外信息的传导者， 在血小 板的各项生理、 病理活动中起着重要作用。对血小 板钙离子的研究可揭示其同血小板功能间的关系， 进而对探讨血小板参与心脑血管疾病的发生、 发展 及血栓形成的病理机理有重要意义。 对象和方法 1. 对象： 正常健康人 20 名 （平均年龄 48 岁， 男 女各 10 名） ； 根据 WHO 制定的诊断标准 （1979 年） 诊断的心肌梗死患者20 例 （平均年龄50 岁， 男女各 55中华检验医学杂志 2006 年 1 月第 29 卷第 1 期 Chin J Lab Med， January 2006，
10、Vol 29，No. 1 10 名） ； 根据 WHO 制定的诊断标准 （1978 年） 诊断 的高血压患者 20 例 （平均年龄 51 岁， 男女各 10 名） 。 2. 仪器： FACS Calibur 流式细胞仪 （美国 BD 公 司） 。 3. 试剂：（1） fluo-3 AM （美国分子探针公司） ； （2）血小板激活剂： ADP、 瑞斯托酶素、 花生四烯酸、 胶原、 凝血酶、 5-羟色胺 （5-HT） 、 钙离子载体 A23187 （美国 biopool 公司） 。 4. 方法：（1）流式细胞仪检测血小板钙离子浓 度： 取枸橼酸钠静脉血 2 ml， 制备富血小板血浆， 并 调节其血
11、小板最终浓度为 250 109/ L。加入终浓 度为 20 mol/ L 的 Fluo-3 AM， 37孵育 30 min， 经 洗涤、 固定， 应用流式细胞仪检测血小板钙离子浓 度。流式细胞仪分析激发波长为 488 nm， 每次试验 前用微球调试机器。测定 Fluo-3 染色的血小板，取 平均荧光强度， 采用诱导剂刺激血小板的荧光强度 除以 10 mol/ L 钙离子载体 A23187 刺激血小板的 荧光强度， 并取百分数的方式报告结果 1。 （2） 加 入不同的血小板激活剂， 观察正常健康人血小板钙 离子浓度变化， 在富血小板血浆中分别加入不同浓 度的 ADP （5 mol/ L、 10
12、mol/ L、 20 mol/ L） 、 凝血 酶 （0. 1 U/ ml、 0. 5 U/ ml、 1 U/ ml） 、 胶原 （5 g/ ml、 10 g/ ml、 20 g/ ml） 、 花生四烯酸 （0. 5 mmol/ L、 1. 0 mmol/ L、 1. 5 mmol/ L） 、5-HT（ 1. 5 mmol/ L、3. 0 mmol/ L、 4. 5 mmol/ L） ， 用流式细胞仪观察不加诱导 剂及加入各种不同浓度诱导剂时的血小板钙离子浓 度。 （3）心肌梗死患者及高血压患者血小板钙离子 浓度研究： 抽取患者静脉血 2 ml， 制备富血小板血 浆， 以20 mol/ L A
13、DP 激活血小板， 应用流式细胞仪 方法测定血小板钙离子浓度。 （4） 观察服用阿司匹 林前后， 血小板钙离子浓度的变化： 选择 20 名至少 2 周内未服用任何药物， 血小板聚集功能正常的健 康志愿者及 20 例心肌梗死患者， 一次性口服阿司匹 林0. 3 g。服用阿司匹林前及服药后24 h， 抽取抗凝 静脉血， 以 1. 5 mmol/ L 花生四烯酸为诱导剂激活血 小板， 用流式细胞仪检测血小板钙离子浓度。 5. 统计学处理： 所测数据进行方差分析和 t 检 验。 结果 1. 不同激活剂 （ADP、 瑞斯托酶素、 胶原、 花生 四烯酸、 5-HT、 凝血酶等） 激活血小板， 正常健康人
14、血小板钙离子浓度的变化： 其实验结果见表 1。对 表中的数据进行方差分析发现， 除凝血酶外， ADP、 瑞斯托酶素、 胶原、 花生四烯酸、 5-HT 血小板激活剂 均可导致血小板钙离子浓度升高 （P 0. 05） ， 而且 在一定范围内， 钙离子浓度的升高幅度随激活剂的 浓度升高而增加。我们没有观察到凝血酶导致血小 板钙离子浓度升高。 表 1 ADP 等化学诱导剂引起血小板内钙离子的变化 （荧光强度%， -x s） 诱导剂浓度ADP 花生四 烯酸 胶原5-HT凝血酶 无诱导剂11211 低浓度诱导剂20 219 225 324 21 中浓度诱导剂28 129 434 430 31 高浓度诱导剂
15、35 333 140 435 21 2. 心肌梗死患者及高血压患者血小板钙离子 浓度变化： 对表 2 中每种激活剂的数据进行 t 检验， 同样激活剂刺激下， 心肌梗死患者和高血压患者血 小板钙离子浓度升高的幅度均高于正常健康人 （P 0. 05） 。 表 2 ADP 等化学诱导剂致心肌梗死和老年性高血压患者 血小板内钙离子的变化 （荧光强度%， -x s） 组别例数ADP 花生四 烯酸 胶原5-HT 正常健康人2035 333 140 435 2 心肌梗死2038 435 242 538 4 老年性高血压2039 336 243 438 3 3. 心肌梗死患者口服阿司匹林前后， 血小板钙 离子
16、浓度变化： 20 例心肌梗死患者口服阿司匹林前 后血小板钙离子荧光强度分别为 34% 2% 和 17% 1%； 20 名健康志愿者口服阿司匹林前后血 小板钙离子荧光强度分别为 30% 2% 和 8% 1%。我们对两组对象服药前后的钙离子荧光强度 进行 t 检验， 发现在正常健康人或心肌梗死患者， 口 服阿司匹林均可抑制花生四烯酸刺激引起的血小板 钙离子浓度升高 （P 0. 05） 。我们对两组对象服药 后的钙离子荧光强度降低值进行 t 检验， 发现服用 阿司匹林后心肌梗死患者血小板钙离子浓度下降的 幅度低于正常健康人 （P 0. 05） 。 讨论 细胞内游离钙离子在血小板及其他细胞中起着 第二
17、信使的关键作用。胞质内游离钙升高， 导致血 65中华检验医学杂志 2006 年 1 月第 29 卷第 1 期 Chin J Lab Med， January 2006，Vol 29，No. 1 小板变形， 伸出伪足， 颗粒趋中心化， 分泌颗粒， 以及 外膜表面改变， 发生聚集反应。也就是说， 血小板内 钙离子增高表明血小板活化 1。Fluo-3 为钙离子荧 光染料， 可与钙离子结合并在可见光谱中被激发， 这 样， 血小板中钙离子与 Fluo-3 结合后， 就可以在流 式细胞仪中得到检测 2， 3。 本研究结果表明， 多种血小板激活剂可引起血 小板内钙离子浓度的升高， 且随着诱导剂浓度的增 加，
18、 钙离子浓度增加。这说明钙离子与化学诱导剂 对血小板的激活过程密切相关。血小板钙离子的升 高主要来自胞外钙离子内流或内部 （主要是致密管 系统） 储存的钙离子释放。诱导剂和血小板上特异 受体相互作用， 在 G 蛋白的介导下激活磷脂酶 C， 后 者使血小板膜上磷脂酰肌醇二磷酸水解， 生成三磷 酸肌醇和甘油二酯。三磷酸肌醇可以和血小板致密 管系统上的特异受体结合， 启动钙通道， 使致密管系 统释放大量钙离子。三磷酸肌醇还可通过 Na + - Ca2 +交换促进胞外钙离子的内流。甘油二酯则通过 增加蛋白激酶 C 对钙离子的亲和力来激活蛋白激 酶 C， 引起一种 47 kDa 蛋白磷酸化和血小板的分泌
19、 释放反应。本研究没有观察到凝血酶导致血小板钙 离子浓度升高， 这也说明凝血酶激活血小板， 无需钙 离子参与。 心肌梗死患者的冠状动脉病变处存在多种激活 血小板的因素， 如暴露的胶原、 动脉管道狭窄导致的 高切变力等。血液流经病变处时， 血小板被激活， 其 钙通道的活性应高于正常健康人。高血压患者存在 导致血液剪切力增多的多种因素， 如高血压、 血管表 面由于长期受损形成的粗糙表面等， 血液的高剪切 力可导致血小板活化， 因此其钙通道活性也应高于 正常健康人。本研究结果表明， 同样激活剂刺激下， 心肌梗死患者和老年性高血压患者血小板钙离子浓 度升高的幅度均高于正常健康人， 这说明患者血小 板钙
20、通道处于激活状态， 对激活剂的作用更敏感。 而钙通道活性增加是心肌梗死患者和老年高血压患 者各种病理因素的反应， 故检测血小板钙离子对评 价这两类患者的病理因素有一定价值， 对疾病的预 防和治疗也有一定的参考意义。阿司匹林是环氧化 酶抑制剂， 能使该酶第530 位的丝氨酸残基乙酰化， 破坏酶活性中心从而阻断了血栓烷的合成， 抑制血 小板胞质内花生四烯酸代谢， 减少血小板致密小管 中储存钙的释放， 胞浆内钙浓度下降， 使多种钙依赖 性酶活性降低， 抑制血小板活化。本结果表明， 在正 常健康人或心肌梗死患者， 口服阿司匹林均可抑制 花生四烯酸刺激引起的血小板钙离子浓度升高， 服 用阿司匹林后冠心病
21、患者血小板钙离子浓度下降的 幅度低于正常健康人。这说明钙离子能反映服用阿 司匹林后血小板的功能状态， 检测血小板钙离子对 阿司匹林的疗效监测有一定的价值。 综上所述， 多种血小板激活途径均有钙离子的 参与， 钙离子在血小板的生理、 病理活动中发挥重要 作用； 心血管疾病往往与血小板的钙通道活性及血 小板钙离子浓度密切相关， 检测血小板钙离子对于 评价心血管疾病的病理因素有一定的价值； 同时钙 离子也能较好地反映服用抗血小板药后的血小板功 能状态， 对于其疗效监测有一定价值。 参考文献 1Holmsen H. Significance of testing platelet function i
22、n vitro. Eur J Clin Invest， 1994， 24 Suppl1： 3-8. 2王俊玫， 丛玉隆， 李楠， 等. ADP 诱导的血小板内钙离子浓度变 化的研究. 中华血液学杂志， 1997， 18： 490-491. 3Minta A，Kao JPY，Tsien RT. Fluorescent indicators for cy2 to solic calcium based on Rhodamine and fluoresce in chromophores. J Biol Chem， 1989， 264： 8171-8179. （收稿日期： 2005-04-28） （
23、本文编辑： 袁桂清） 专家答疑 问： 如何准确检测耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌和凝固 酶阴性葡萄球菌？ 答： 检测 mecA 基因和其表达的青霉素结合蛋白 （PBP2a）是预测葡萄球菌对苯唑西林耐药的最准确方法。 罕见非 mecA 基因介导的苯唑西林耐药机制， 纸片法测定苯 唑西林为中介或耐药， 应加测苯唑西林的 MIC， 如果 MIC4 g/ ml ， 即使 mecA 基因和 PBP2a 检测阴性， 苯唑西林也应 报告耐药。在凝固酶阴性葡萄球菌 （CoNS） 中头孢西丁纸片 扩散法的结果与检测 mecA/ PBP2a 的一致性好于苯唑西林 纸片， 可以减少在非表皮葡萄球菌的 CoNS 中苯唑西林纸片 的假阳性问题， 所以应该首选头孢西丁纸片。对金黄色葡 萄球菌两种纸片的结果相近， 但头孢西丁纸片更容易读取结果。 （闫东辉） （收稿日期： 2005-12-16） （本文编辑： 毛家都） 75中华检验医学杂志 2006 年 1 月第 29 卷第 1 期 Chin J Lab Med， January 2006，Vol 29，No. 1