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1、 8 5 2 实 验 研 究 反义A K T 2 R N A逆转C 6 胶质瘤的 细胞恶性表型 康春生浦佩玉王广秀王虎董伦李捷 摘要】 目的研究反义A K T 2 R N A逆转C 6 鼠脑胶质瘤细胞恶性表型。方法将逆转录病 毒L X S N为载体的反义A K T 2 构建体一 脂质体复合物直接转染人脑胶质瘤细胞系T J 9 0 5 和鼠脑胶 质瘤细胞系C 6 , L X S N载体转染组为空载对照。随机筛选阳性克隆并应用蛋白印记和原位杂交鉴 定转染。M T T法和T U N E L 法评价细胞的增殖活性和调亡， T r a n s w e ll 法分析侵袭能力， 划痕实验 研究细胞迁移能力，
2、 流式细胞法分析细胞周期， 并进行G F A P的表达分析。结果转染A S -A K T 2 c D N A后C 6 细胞A K T 2 表达显著抑制。与C 6 对照组和L X S N空载组比较， 转染反义A K T 2 后C 6 细胞存活率均明显下降( P 0 . 0 5 表2 C 6 细胞转染反义A K T 2 c D N A前后 T U N E L法 分析细胞凋亡的变化( n = 6 ) 细胞系 FP C 6 0 . 3 3士0 . 5 1 C 6 - L XS N 0 . 5 0土0 . 8 4 A S 1 1 3 . 6 7士2 . 5 0 A S 2 1 2 . 5 0士2 . 7
3、 4 A S 3 1 3 . 5 0士1 . 9 4 4 9 . 0 6 1 0. 0 1 3 . 体外侵袭与迁移实验: T r a n s w e l l 上室为聚碳酸 醋膜， 其间富含大量的8 t .m小孔， 加入稀释后的M a - t r i g e l 后可以模拟形成一层细胞外基质屏障; 下室中加 入N I H 3 T 3 细胞条件培养液作为上室内种植细胞的 趋化因子。C 6细胞和各种转基因细胞在加入 Ma - t r ig e l 的T r a n s w e l l 上室后经过相同细胞条件和培养时 间下8 t .m滤孔内侵袭的细胞数量可以在一定程度上 反映细胞的侵袭能力。计数膜中央
4、部分和周围部分3 个随机视野( x 3 0 0 ) 内侵袭细胞的数目， 经过发现 C 6 组和 L X S N组平均视野侵袭细胞为8 . 1 7 个和8 . 2 2 个， A S 组为3 . 5 个， 与C 6对照组比较迁移能力下降了 5 7 %( P 0 . 0 5 ) 。 划痕” 后无血清培养基培养2 4 h ， 倒 置相差显微镜下网格目 镜随机选择 5 个 1 0 0 x 视野下 大网格内计算迁移的细胞总数， C 6 与L X S N组的迁移 细胞分别为1 1 9 . 4 个和1 1 1 . 4 个， A S 组为6 9 . 2 个， 与 C 6 对照组比较迁移能力下降了4 2 % (
5、P 0 . 0 5 ) . 4 . 细胞周期分析: 流式细胞仪分析 C 6细胞转染 A K T 2 构建体后细胞周期分布结果如下: C 6 对照组和 空载组G o + G , 期分别为5 7 . 4 9 % 和5 8 . 5 5 %, S 期分别 为 2 4 . 9 9 %和2 4 . 4 0 % ; A S 组G o +G I 期为6 9 . 4 6 %, S 期为1 0 . 5 4 ; 与C 6 对照组比 较A S 组G o 十 G I 期增加 参考文献 1 C a n t l e y L C , N e e l B G. N e w i n s i g h t s i n t o t u
6、 m o r s u p p r e s s io n : P T E N s u p - p r e s s e s t u m o r f o r m a t i o n b y r e s t r a i n i n g t h e p h o s p h o i n o s i t i d e 3 - k i n a s e / A K T p a t h w a y . P r o c N a t A c a d S c i , 1 9 9 9 , 9 6 : 4 2 4 0 - 4 2 4 5 . 2 V i v a n c o 1 , S a w y e r s C L . T
7、h e p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l - 3 - k i n a s e - A K T p a t h - w a y i n h u m a n c a n c e r . N a t u r e R e v , 2 0 0 2 : 4 8 9 - 5 0 1 . 3 康春生， 浦佩玉， 李捷， 等. 人脑胶质瘤A K T 2 表达与细胞增殖和侵 袭性的 关系. 中华病理学杂志， 2 0 0 4 , 3 3 : 4 6 4 - 4 6 7 . 4 B u n i a t i a n G , T r a u b P , A l b i n u
8、 s M, e t a l . T h e i m m u n o r e a c t i v i t y o f g l i a l f i b r i l l a r y a c i d i c p r o t e i n i n m e s a n g i a l c e l l s a n d p o d o c y t e s o f t h e g l o m e r u l i o f r a t k i d n e y i n v i v o a n d i n c u l t u r e . B i o l C e ll , 1 9 9 8 , 9 0 : 5 3 - 6 1
9、 . 5 T i a n X X , P a n g J C , T o S S , e t a l . R e s t o r a t i o n o f w i l d - t y p e P T E N e x p r e s - s i o n l e a d s t o a p o p t o s i s , in d u c e s d if f e r e n t ia t io n , a n d r e d u c e s t e l o m e r a s e a c t i v i t y i n h u m a n g l i o m a c e ll s . J N
10、e u r o p a t h o l E x p N e u r o l , 1 9 9 9 , 5 8 : 4 7 2 - 4 7 9 . 6 T o d a M, Mi u r a M, A s o u H , e t a l . C e l l g r o w t h s u p p r e s s i o n o f a s t r o c y - t o m a C 6 c e l l s b y g l i a l f i b r i l l a r y a c i d i c p r o t e i n c D N A t r a n s f e c t i o n . J N e u - r o c h e m, 1 9 9 4 , 6 3 : 1 9 7 5 - 1 9 7 8 . ( 收稿日 期: 2 0 0 4 - 1 1 - 2 9 )