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1、 反义R N A重组逆转录病毒逆转录套式P C R 检测方法的建立 曹素芳1 ,2,孟庆文2,于康震2,单文鲁3 ( 1.郑州牧业工程高等专科学校,河南 郑州 4 5 0 0 1 1;2.中国农业科学院 哈尔滨兽医研究所, 黑龙江 哈尔滨 1 5 0 0 0 1;3.新疆农业大学 动物医学院,新疆 乌鲁木齐 8 3 0 0 5 2) 摘要:为探求一种快速检测反义R NA重组逆转录病毒效价的新方法, 用脂质体介导法将反义 R NA重组逆转录病毒载体p L X S A、p L X S B分别转染包装细胞系P A 3 1 7, 经G 4 1 8筛选, 获得数个 稳定的产毒细胞克隆, 择优挑选7个细胞
2、克隆扩增培养, 收集细胞上清, 用异硫氰酸胍-酚一步法提 取病毒R NA, 进行逆转录套式P C R, 检测细胞上清中的反义R NA重组逆转录病毒效价, 同时用传 统方法( 小鼠成纤维放大法) 进行测定。2种方法检测结果的比较表明, 逆转录套式P C R法的特异 性和敏感性均高于小鼠成纤维放大法, 是一种敏感性高、 特异性强、 操作简便、 快速的检测逆转录病 毒效价的新方法。 关键词:重组逆转录病毒;反义R NA;逆转录套式P C R;病毒效价 中图分类号:S8 5 2. 6 5 9. 3:Q5 0 3 文献标识码:A 文章编号:1 0 0 0 - 6 4 1 9( 2 0 0 5)0 8 -
3、 0 6 1 1 - 0 4 D e v e l o p m e n t o fR T - n e s t e dP C Rf o rd e t e c t i o no fa n t i s e n s e R N Ar e c o m b i n a n t r e t r o v i r u s C AOS u - f a n g 1,2,ME NGQ i n g - w e n2, YU K a n g - z h e n 2, S HAN W e n - l u 3 (1.C o l l e g e o fZ h e n g z h o uA n i m a lH u s b a n
4、 d r yE n g i n e e r i n g,Z h e n g z h o u4 5 0 0 1 1,C h i n a; 2.H a r b i nV e t e r i n a r yR e s e a r c hI n s t i t u t e,C h i n e s eA c a d e m yo fA g r i c u l t u r a lS c i e n c e s,H a r b i n 1 5 0 0 0 1,C h i n a;3.C o l l e g e o fV e t e r i n a r yM e d i c i n e,X i n j i a
5、 n gA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y, r R m q i8 3 0 0 5 2,C h i n a) A b s t r a c t:I no r d e r t od e v e l o pa r a p i da n ds e n s i t i v em e t h o d f o rd e t e c t i o no f a n t i s e n s eR NAr e c o m b i n a n t r e t r o v i r u s t i t e r s,a n t i s e n s eR NAr e c o
6、m b i n a n t r e t r o v i r u sv e c t o r sp L X S Aa n dp L X S Bw e r ep a c k e db yp a c k a - g i n gc e l l l i n e sP A 3 1 7a n ds c r e e n e db yG 4 1 8. S e v e r a ls t a b l ec e l lc l o n e sp r o d u c i n gr e c o m b i n a n tr e t r o v i r u s w e r eo b t a i n e d . S e v e
7、ns e l e c t e dc l o n e sw e r ee x p a n d e d . T h eR NAw a se x t r a c t e d f r o mt h ev i r u sb yt h em o d i - f i e dg u a n i d i n et h i o c y a n a t e - p h e n o lm e t h o d,T h et i t e r so f t h ea n t i s e n s eR NAr e c o m b i n a n tr e t r o v i r u s i nt h e s u p e r
8、n a t a n to f c e l l c l o n e sw e r ed e t e c t e db yt h eR T - n e s t e dP C Rm e t h o d .A t t h es a m et i m et h ev i r u st i t e r s w e r ed e t e c t e db yt h et r a d i t i o n a lr a tf i b r o b l a s tm a g n i f y i n gm e t h o dt o o .T h er e s u l t sd e t e c t e db yt h
9、et w o m e t h o d ss h o w e dt h a t t h eR T - n e s t e dP C Ri sm o r es p e c i f i c,s e n s i t i v e,r a p i da n ds i m p l e t h a nt h e t r a d i t i o n a l m e t h o dt od e t e c t r e t r o v i r u s t i t e r s . K e yw o r d s:r e c o m b i n a n t r e t r o v i r u s;a n t i s e
10、n s eR NA;R T - n e s t e dP C R;v i r a l t i t e r 目前, 在真核细胞基因转移中, 逆转录病毒载 体-包装细胞系统是最常用的一种真核细胞基因转 移技术 1,2。在以逆转录病毒为载体的基因治疗 中, 必须评价逆转录病毒的效价 3, 而高效价的病毒 上清也是用其进行有效治疗的前提 4。如何简单、 快速地确定逆转录病毒的效价, 从而选取高效价的 逆转录病毒血清已成为当前研究的热点。以前, 人 们 用小鼠成纤维细胞放大法(N I H/3 T 3法) 这一传 收稿日期:2 0 0 5 - 0 5 - 0 9 基金项目:国家重点基础研究发展规划(9 7
11、 3) 项目(G 1 9 9 9 0 1 1 9 5) 作者简介:曹素芳(1 9 7 3) , 女, 四川武胜人, 博士, 从事兽医微生物及分子免疫学研究,E - m a i l: c a o s u f 2 0 0 01 6 3. c o m 中国兽医科技 2 0 0 5, 3 5(8) :6 1 1 - 6 1 4 C h i n e s eJ o u r n a l o fV e t e r i n a r yS c i e n c ea n dT e c h n o l o g y 统方法测定病毒的效价, 该方法费时、 费力, 且耗费 大量昂贵的G 4 1 8, 污染的机会也多。而本研
12、究建立 的逆转录-套式P C R法, 是通过检测重组逆转录病 毒中的N e o R来确定细胞上清中病毒的效价。这种 方法既可定量又可定性, 且操作简便、 快速。同传统 方法相比, 具有很好的实用性, 为一种新的逆转录病 毒效价检测手段。 1 材料与方法 1. 1 试剂 包装细胞系P A 3 1 7和小鼠成纤维细胞N I H/ 3 T 3由笔者所在研究室保存;E x T a q 酶购于大连宝 生物工程有限公司。逆转录酶M - ML V、DMEM、 G 4 1 8、p o l y b r e n e、L i p o f e c tAM I N E TM转染试剂盒均 购自G i b c o公司; 胎
13、牛血清由中国农业科学院哈尔 滨兽医研究所后勤部提供。 1. 2 引物设计 根据新霉素抗性基因序列设计了N e o R特异性 内引物( 上游引物P 1、 下游引物P 2) 和外引物( 上游 引物P 3、 下游引物P 4) 。扩增产物大小分别为3 4 6、 1 8 3b p。 P 1:5 - C G T T G T C A C T GAAG C G G GAAG G - 3 P 2:5 - C C AT GATAT T C G G C AAG C AG G C - 3 P 3:5 - T G C TAT T G G G C GAAG T G C C G - 3 P 4:5 - A C AAGA C
14、 C G G C T T C C AT C C G - 3 1. 3 反义R N A重组逆转录病毒的体外包装 用脂质体介导法将反义R NA重组逆转录病毒 载体p L X S A、 p L X S B转染包装细胞系P A 3 1 7。用 G 4 1 8(4 0 0g/m L) 进行筛选, 同时整个包装过程设 置阴性对照。71 0d后, 形成产毒细胞克隆, 用滤 纸片法挑出, 进行扩增培养, 收获2 4h培养上清, 过 滤,-7 0冻存或测定病毒效价。本试验共挑取7 个产毒细胞克隆扩增培养, 得到7个反义R NA重 组逆转录病毒。 1. 4 病毒R N A的R T - P C R 参照文献 5 用
15、异硫氰酸胍-酚一步法( 胍-酚 法) 抽提病毒R NA。直接在提取的R NA试管中加 入用1 9LR T - P C R混合液( 5反转录酶缓冲液, 0. 0 1 m o l/L D T T,0. 5 m o l/L d NT P, 外 引 物1 m o l /L) 溶解的R NA, 进行逆转录, 反应条件为: 7 0 变性5m i n, 加入1L逆转录酶,3 7反应1h,9 5 灭活1 0m i n。尔后补加3 0LP C R反应液(1 0 缓冲液, 5U/LE x T a q 酶) 进行P C R反应, 扩增程 序为: 9 5变性5m i n后,9 53 0 s,5 81m i n3 0
16、s,7 24 5s,3 0个循环, 最后7 2延伸5m i n, 电 泳观察扩增结果。 1. 5 套式P C R 取上述R T - P C R扩增产物1L, 加入套式P C R 混合液( P C R缓冲液含内引物1m o l/L,E x T a q 酶 5U/L) , 扩增程序为:9 5变性5m i n后,9 54 0 s,5 53 0 s,7 24 5 s,3 5个循环, 最后7 2延伸5 m i n。电泳观察结果。 1. 6 小鼠成纤维放大法 将生长旺盛的N I H/3 T 3细胞接种于2 4孔培 养板中, 过夜。用无血清的DMEM( 含 终 浓 度8 g /m Lp o l y b r
17、e n e) 将 重 组 病 毒 液 稀 释 成1 0 -2 1 0 -8, 每个梯度为1m L, 然后加入洗涤过的细胞中, 3 7温育3h, 换上终浓度为2g/m Lp o l y b r e n e的 完全培养液, 培养23d。将细胞按1:1 0至1:2 0 传代, 用含G 4 1 8( 6 0 0g/m L) 的完全培养液进行培 养, 每3d换1次液, 1 52 0d后, 可见细胞克隆。 在克隆扩散之前计数。病毒效价(C F U/m L) 的计 算:G 4 1 8 -抗性(C F U/m L)=克隆数稀释倍数 1 0。分别计算各病毒的效价并同上述结果相比较。 2 结果 2. 1 R T
18、- n e s t e dP C R的测定 R T - P C R结果可见重组病毒A1、2、4号有3 4 6 b p 的扩增带, 而3号未见其扩增带; 重组病毒B6、 7 号可见3 4 6b p的扩增带, 5号未见扩增带( 见图1) 。 n e s t e d - P C R结果可见7个病毒均有1 8 3b p的扩增 带( 见图2) 。 图1 7个反义重组逆转录病毒的R T - P C R扩增结果 F i g . 1 T h e r e s u l t o f 7a n t i s e n s e r e c o m b i n a n t v i r u s b yR T - P C R M
19、. D NA分子质量标准;14.重组病毒A;57.重组病毒B;8.阴 性对照 M. D L 2 0 0 0D NA M a r k e r;1-4. R e c o m b i n a n tv i r u sA;5-7. R e - c o m b i n a n tv i r u sB;8. N e g a t i v ec o n t r o l 2. 2 两种测定方法的结果比较 以N I H/3 T 3细胞作为感染细胞进行N e o R抗 性克 隆 筛 选 及 计 数, 可 测 出17号 病 毒 效 价 (C F U/m L) 分别为41 0 5、 21 0 4、 11 0 3、 61
20、 0 4、 216 中国兽医科技第3 5卷 图2 7个反义重组逆转录病毒的n e s t e d - P C R扩增结果 F i g . 2 T h er e s u l to f7a n t i s e n s er e c o m b i n a n tv i r u s e sb yn e s - t e d - P C R M. D NA分子质量标准;14.重组病毒A;57.重组病毒B;8.阴 性对照 M. D L 2 0 0 0D NA M a r k e r;1-4. R e c o m b i n a n tv i r u sA;5-7. R e - c o m b i n a
21、n tv i r u sB;8. N e g a t i v ec o n t r o l 31 0 3、 41 0 4、 51 0 5。2种方法检测结果的比较 表明, 当常规检测病毒效价为1 0 3C F U /m L时, 首轮 R T - P C R未能检测到, 而病毒效价为1 0 4C F U /m L 时即可见明显的E B染色电泳带, 当n e s t e d - P C R继 续扩增首轮产物时, 各克隆均可见明显条带。由此 可见,R T - n e s t e dP C R的敏感性高、 特异性好, 且耗 时少。 3 讨论 3. 1 用胍-酚法提取反义R NA 重组逆转录病毒 R NA
22、时, 将通常先加裂解液裂解再用酚抽提方法, 改为与裂解液一次加入样品中, 简化了操作步骤, 缩 短了时间( 整个过程为4 5m i n) , 减少了R NA的降 解, 且反转录时将全部提取的R NA用于c D NA的 合成及P C R扩增, 大大提高了该方法的扩增效率。 邱建明等 6分别用胍 -酚法和磁珠法提取病毒特异 性R NA, 比较结果表明, 胍-酚法比磁珠法提取的 R NA要高一个数量级, 由此说明胍-酚法是一种简 便、 有效、 敏感、 快速的提取病毒R NA的方法。 3. 2 反义R NA能够与靶基因的mR NA 或其前提 的特定序列互补配对, 形成双链R NA, 阻断mR NA 的
23、功能, 最终抑制基因的表达。为了探索反义R NA 技术在抗病毒领域的可行性, 笔者构建了反义R NA 重组逆转录病毒载体, 而获取高效价的逆转录病毒 是取得有效治疗的关键, 这需要从大量的包装细胞 克隆中进行筛选。传统的测定方法需对每一克隆的 病毒上清做不同的稀释, 分别筛选, 筛选过程中每一 克隆都需长期培养, 工作量较大, 而且还存在插入基 因和抗药基因2个启动子作用的相互干扰 7, 长期 培养很容易使包装细胞的产毒能力下降。逆转录套 式P C R法在包装细胞扩增后2 4h即可提取R NA, 在几小时后即可选出高产毒细胞克隆, 只需对高产 毒细胞进行扩增、 冻存即可, 大大缩短了时间。 3
24、. 3 由本试验结果可见, 首轮R T - P C R 后, 即可见 明显条带, 其所对应的常规检测方法的效价为1 0 4, 而1 0 3未见明显条带, 说明首轮 R T - P C R具有一定 的定量性。第2轮n e s t e d - P C R后各细胞克隆均可 见条带, 说明n e s t e d - P C R具有很高的敏感性, 可用 于检测较低效价的重组病毒。这是由于套式P C R 通过内、 外引物进行2次扩增, 大大提高了敏感性。 据报道, 套式P C R比一次P C R至少敏感1 0 0倍 8。 3. 4 R T - n e s t e dP C R最大的缺点是容易污染, 由于
25、c D NA的扩增效率高, 微量的污染即可变成阳性, 所 以本工作应在严格的无核酸污染环境下配制R NA 裂解液、 酶混合液、 反转录混合物及P C R混合液, 经 检测确定无污染后, 再加入管中。而且R NA提取、 反转录及第一步是在同一管中进行的, 减少了污染 的几率。H j e l l e等 9对 HP R S病人急性期血凝块 及外周血单核细胞进行R T - n e s t e dP C R检测, 阳性 率为1 0 0%。对扩增产物进行测序分析, 表明与已 知的HP R S病毒基因序列具有较高的同源性。证 明只要创造一个超净的环境, 仔细操作,R T - n e s t e d P C
26、R扩增过程的污染是可以避免的。 参考文献( R e f e r e n c e s) 1 C r y s t a lRG.T r a n s f e ro fg e n e st oh u m a n s:e a r l yl e s - s o n sa n do b s t a c l e st os u c c e s sJ. S c i e n c e,1 9 9 5,2 7 0: 4 0 4 - 4 1 0. 2 K o o r i uJS,N e w t o nKJ,Z h a n gYL,e t a l.H u m a n g e n et h e r a p yJ. P r o
27、 cN a t lA c a dS c iU S A,1 9 9 4, (5) : 1 9 - 2 8. 3 卢大儒, 邱信芳, 薛京伦.基因转移研究进展 J.生 物工程进展, 1 9 9 6,1 6(2) :5 - 1 0. L uDR,Q i uXF,X u eJL.R e c e n t l ys t u d i e so fg e n e t r a n s f e rm e t h o d sf o rg e n et h e r a p yJ.P r o g r e s so f B i o e n g i n e e r i n g,1 9 9 6,1 6(2) :5 - 1 0
28、. ( i nC h i n e s e) 4 K i mJH,M c L i n d e nRJ,M o s c aJD,e t a l. I n h i b i t i o n o fH I Vr e p l i c a t i o nb ys e n s ea n da n t i s e n s eR NA r e - s p o n s ee l e m e n t si n H I V - b a s e dr e t r o v i r a lv e c t o r sJ. A c q u i r I mm u n eD e f i cS y n d rH u mR e t r
29、o v i r a l,1 9 9 6,1 2: 3 4 3 - 3 5 1. 5 M i l l e rAD,M i l l e rDG,G a r c i aJV, e t a l.U s eo f r e t - r o v i r a l v e c t o r sf o rt r a n s f e ra n de x p r e s s i o nJ.M e t - h o d sE n z y m o l,1 9 9 3,2 1 7:5 8 1. 6 邱建明, 董泽平, 杭长寿, 等.应用反转录-套式P C R方 法检测肾综合征出血热病人血清中的汉坦病毒特异性 R NAJ.病毒学
30、报,1 9 9 7,1 3(2) :1 1 9 - 1 2 5. Q i uJM,D o n gZP,H a n gCS,e t a l.H a n t aR NAd e - 316 第8期 曹素芳等: 反义R NA重组逆转录病毒逆转录套式P C R检测方法的建立 t e c t i o n i nc l i n i c a l s e r ao fh e m o r r h a g i cf e v e rw i t hr e n a l s y n d r o m eu s i n gr e v e r s et r a n s c r i p t i o n - n e s t e dP
31、 C RJ. C h i n e s eJ o u r n a lo fV i r o l o g y,1 9 9 7,1 3(2) :1 1 9 - 1 2 5. ( i n C h i n e s e) 7 武沙沙, 王申五, 马丽萍, 等. p 1 6逆转录病毒载体的构 建及其高滴度克隆的杂交筛选 J.中国生物化学与 分子生物学报,2 0 0 0, 1 6(1) :8 2 - 8 5. WuSS,W a n gS W,M aLP,e ta l.C o n s t r u c t i o no f p 1 6r e t r o v i r u sv e c t o ra n di d e
32、n t i f i c a t i o no fh i g h - t i t e r c l o n e s b y n o n r a d i o a c t i v ev R NA D o t b l o t t i n g J. C h i nJ B i o c h e m M o lB i o l,2 0 0 0,1 6(1) :8 2 - 8 5.(i n C h i n e s e) 8 L i uX,G i a m b r o n eJJ,D o r m i t o r i oT. S i m p l i f i e ds a m - p l ep r o c e s s i
33、n gc o m b i n e dw i t has e n s i t i v en e s t e dp o l y - m e r a s ec h a i nr e a c t i o na s s a yf o rd e t e c t i o no f i n f e c t i o u s b u r s a ld i s e a s ev i r u si nt h eb u r s ao fF a b r i c i u sJ. A v i a nD i s,1 9 9 8,4 2(3) :4 8 0 - 4 8 5. 9 H j e l l eB,S p i r o p
34、o u l o uCF,T o r r e z - M a r t i n e IN,e t a l. D e t e c t i o no f M u e r t o H a n t a v i r u s R NA i n p e r i p h e r a l b l o o dm o n o n u c l e a rc e l l sf r o mp a t i e n t sw i t hh a n t a v i r u s p u m o m a r ys y n d r o m eJ. I n f e c tD i s,1 9 9 4,1 7 0:1 0 1 3 - “ 1
35、0 1 7. 中国兽医科技 投稿简则 中国兽医科技 从2 0 0 5年第1期起改为学术性期刊。所设栏目有专家论坛、 微生物学、 寄生虫学、 基础 兽医学、 药物学、 中兽医学、 综述专论等。主要刊登具有较高学术水平的兽医科学研究论著和相关学术论文。 1 对稿件的要求 1. 1 研究论著的内容要有所创新、 构思有据、 设计严密、 材料标准( 试剂及仪器应注明生产厂家及型号) 、 方 法可靠、 数据精确且经统计学处理。各类文稿要求主题突出、 层次分明、 概念清晰、 论证有据、 语言简练、 文笔 流畅。请登录本刊网站h t t p: / /www. c j v s t . c o m参阅本刊 投稿指
36、南 。 1. 2 文稿应包括中文题目( 应以简明、 确切的词语反映文章主题, 一般不要超过2 0个字) 、 作者姓名、 单位名 称、 所在城市名及邮政编码、 1 0 03 0 0字的摘要( 应包括目的、 方法、 结果、 结论四部分) 、38个关键词, 以及 相应的英文题目、 作者姓名( 汉语拼音) 、 单位名称、 所在城市名及邮政编码、 英文摘要和关键词; 附第一作者 简介, 内容包括: 姓名、 出生年、 性别、 民族、 籍贯( 省、 市或县) 、 职称、 学位、 研究方向等; 重大科研项目或基金 项目的研究论文, 须注明项目名称及编号, 并附项目合同及批文的复印件。 1. 3 正文的各级标题
37、要层次分明, 同一级标题应尽量做到平衡统一。 1. 4 文中的图和表要简洁、 规范, 每幅图表应有图序( 表序) 、 图题( 表题) ; 照片要求清晰度和对比度良好, 图 题( 表题) 、 图注( 表注) 及图( 表) 中的文字均须附英文对照; 图注或说明文字置于图题下方, 表注置于表的下 方, 表注( 图注) 多于1条时, 用1) 、 2)表示。表中各栏目单位相同时, 将单位列于表的右上角; 各栏目或 部分栏目单位不同时分别将其列于相应栏目中; 表中数据的有效位数要一致; 表内“ 空白” 代表未测或无此 项, “ -” 或“ ” 代表未发现, “ 0” 代表实测结果确为零。 1. 5 文中的
38、量名称和量单位、 数字、 标点符号的用法应分别符合 G B3 1 0 0 - 9 3 国际单位制及其应用和G B 3 1 0 1 - 9 3 有关量、 单位和符号的一般原则 、G B/T1 5 8 3 5 - 1 9 9 5 出版物上数字用法的规定 、G B/T1 5 8 3 4 - 1 9 9 5 标点符号用法 的要求; 容易混淆的外文字母的文别、 大小写、 正斜体、 上下标要写清楚。 1. 6 参考文献请按 中国学术期刊( 光盘版) 检索与评价数据规范 和 G B7 7 1 4 - 9 7 文后参考文献著录规则 采用顺序编码制著录, 依照其在文中出现的先后顺序连续编码, 用阿拉伯数字加方括
39、号标出。中文参考文献 请附英文对照, 并加注“ ( i nC h i n e s e) ” 。 2 声明和约定 2. 1 根据国家版权局国版 1 9 9 98号文关于 出版文字作品稿酬规定的通知, 不同栏目的文章暂按每千 字1 01 5元标准付给作者稿酬。凡被本刊录用的稿件, 按此约定付给稿酬, 并赠送该期样刊24册。请作 者在随样刊寄来的稿酬收据单上签字后寄回本刊编辑部。 2. 2 本刊已加入 中国学术期刊( 光盘版) 、 中国期刊网 、 中文科技期刊数据库 和 万方数据- - -数字 化期刊群 , 作者著作权使用费与本刊稿酬一次性给付。如作者不同意将文章编入上述数据库, 请来稿时声 明, 本刊将做适当处理。 2. 3 投寄本刊未被录用的稿件一律不退, 请作者自留底稿。给本刊投寄的稿件, 5个月后仍未收到“ 录用通 知单” 者可改投他刊, 在此期间欲改投他刊时, 请及时通知本刊编辑部。 416 中国兽医科技第3 5卷