前列腺素F2α增强膜去极化和升高胞内钙促进NIT1β细胞胰岛素分泌.pdf

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1、前列腺素 F 2 增强膜去极化和升高胞内钙促进 NIT-1细胞胰岛素分泌 叶春玲 1* ，袁振宇1，任省华1，叶 涛2，钟 玲1，蒋家华3 （暨南大学 1. 药学院药理学教研室， 2. 华侨医院，广东 广州 510632； 3. 多伦多大学 医学院生理实验室，加拿大 多伦多） 摘要：目的 探讨前列腺素 F 2 （PGF 2 ） 促进 NIT-1 细胞葡萄糖刺激性胰岛素分泌的作用机制。方法 放射免疫法检测 NIT-1 细胞胰岛素分泌量； 激光共 聚焦显微镜检测细胞 Ca2 + i。结果 葡萄糖浓度为 16.5 mmol L -1时， PGF 2 5 mol L -1或钾通道阻断剂 四乙胺 （TE

2、A） 20 mmol L -1均使 NIT-1 细胞胰岛素 分泌明显增加， 而先给予 TEA 后再加 PGF 2 或先给 PGF 2 再加 TEA 均不能使胰岛素分泌进一步增加。 葡萄糖浓度为5. 5 mmol L -1时， PGF 2 不能使胰岛素 分泌增加， 预先给予20 mmol L -1 TEA 再应用PGF 2 ， 胰岛素分泌显著增加。60 mmol L -1 KCl 和250 mol L -1二氮嗪使细胞膜处于最大去极化状态时， PGF 2 不 能促进胰岛素分泌。16.5 mmol L -1葡萄糖浓度下， 预 先给予氯通道阻断剂4， 4-二异硫氰酸水合!-2， 2-二 磺酸（DID

3、S） ， PGF 2 不能促进胰岛素分泌。另外， 16.5 mmol L -1葡萄糖下， 5 mol L-1 PGF 2 引起 NIT-1 细 胞 Ca2 + i升高， 而预先给予 60 mmol L -1 KCl 和250 mol L -1 二氮嗪后再给予 PGF 2 不能引起细胞 Ca2 + i 升 高；在 DIDS 作 用 下，NIT-1 细 胞 Ca2 + i显著降低， 恢复静息期后给予 PGF 2 ， 细胞 Ca2 + i再次降低。结论 促进细胞膜去极化在 PGF 2 增强胰岛素分泌中起着重要作用。PGF 2 可能 通过激活氯通道， 增强 NIT-1 细胞膜去极化， 升高 细胞 Ca

4、2 + i， 促进高浓度葡萄糖刺激下的胰岛素分 泌。 关键词：前列腺素 F 2 ；胰岛素；细胞，NIT-1；钙， 细胞内；氯通道 中图分类号：R977. 1 +5 来稿日期： 2005-06-23 接受日期： 2005-12-19 基金项目：广东省自然科学基金资助项目 （04010463） ； 国家自然科学基金资助项目 （30070873） 作者简介：叶春玲， 博士， 教授。 *联系作者 E-mail：YCL0412 tom. com Tel： （020） 85220261 文献标识码：A 文 章 编 号： 1000-3002 （2006） 02-0096-06 糖尿病早期循环系统内前列腺素

5、F 2 （prosta- glandin F 2 ， PGF 2 ） 显著升高， 并且使糖尿病机体小 血管舒缩性明显改变 1。但是， 糖尿病早期升高的 PGF 2 对胰岛素分泌影响的研究颇少， 仅有的研究主 要集中在20 世纪80 年代以前 2， 3。当时研究认为， 给予 PGF 2 能够增强胰岛素的分泌， 可能是 PGF 2 增 强了腺苷酸环化酶的活性， 胰岛 cAMP 升高所致 4。 也有研究发现， 静脉给予 PGF 2 对人体血糖和胰岛 素水平均没有明显影响， 体外实验结果同样如 此 5。早期相关的实验研究均是在胰岛水平进行， 假如 PGF 2 有作用， 那么其靶点是在 细胞还是 细胞并

6、不清楚， 而且当时也没有发现在糖尿病早期 PGF 2 显著升高这个现象。 作者前期的实验已经证明， 一定范围内较高浓 度的 PGF 2 能够促进高浓度葡萄糖刺激下的 NIT-1 细胞胰岛素分泌， 可能与细胞外钙内流增强有关， PGF 2 升高可能是 细胞胰岛素分泌的一个有利调 节因素 6。另一方面， 细胞膜去极化在诱导胰岛 素分泌中有非常重要的作用 7。PGF 2 增强葡萄糖 刺激下的 NIT-1 细胞胰岛素分泌是否与增强 细 胞膜去极化有关？其可能的机制是什么？本文就此 进行了探讨。 1 材料和方法 1. 1 药品与试剂 PGF 2 、 钾通道阻断剂四乙胺 （tetraethylammoni

7、- um chloride， TEA） 和氯通道阻断剂 4， 4-二异硫氰酸 水合!-2， 2-二磺酸 （4， 4-diisothiocyanatostilbene-2， 2-disulfonic acid，DIDS） 均购自 Sigma 公司。钾通 道开放剂二氮嗪 （diazoxide） 、 DMEM 培养基和胰蛋 白酶均为Gibco BRL公司产品。 荧光指示剂Fluo- 69 中国药理学与毒理学杂志 Chin J Pharmacol Toxicol 2006 年 4 月； 2006 Apr； 20 （2） ： 96 -101 20 （2） ： 96 -101 3/ AM、 非离子型多元醇

8、表面活性剂 F-127 购自 Flu- ka 公司。胎牛血清购于杭州四季青公司。 125I 胰 岛素放射免疫分析药盒购于中国原子能科学研究 院。其他实验试剂均为分析级。NIT-1 细胞为南 方医科大学药物研究所吴曙光教授赠送。 1. 2 细胞培养 将培养至对数生长期的 NIT-1 细胞用 0. 25% 胰酶和 0. 02%EDTA （体积比为1: 1） 消化成单细胞 悬液， 按每孔大约 1 105的密度接种于 96 孔平板， 每孔培养液体积为 200 L。于 95% 空气、 5% CO2 和 37 饱和湿度条件下用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养液培养 48 h， 进行实验。 1. 3

9、胰岛素含量测定 抽出 96 孔平板内培养液， 细胞用 KRBB 缓冲 液 8 （mmol L -1： NaCl 129， KCl 4. 8， CaCl 22， MgSO4 1. 2， KH2PO41. 2， NaHCO35， HEPES 10， 葡萄糖 0. 1； 0. 2% 牛血清白蛋白；NaHCO3调至 pH 为7. 4） 预孵 30 min 后， 抽弃孵育液， 进行如下实验， 每孔终 体积为 200 L， 所有实验液浓度均为终浓度， 每组 实验设6 个复孔。 分别加入含 5.5 和 16.5 mmol L -1葡萄糖的 KRBB 液， 10 min 后加入5 mol L-1的 PGF 2

10、 或20 mmolL -1的 TEA， 观察 PGF 2 或 TEA 对 葡萄糖刺激胰岛素释放的影响； 分别加入含 5. 5 和 16. 5 mmolL -1葡萄糖的 KRBB 液， 10 min 后加 入5 mol L -1的 PGF 2 ， 继续孵育20 min 后， 再加入 20 mmol L -1的 TEA， 观察 PGF 2 与 TEA 合用对胰岛 素释放的影响； 在16. 5 mmol L -1葡萄糖浓度下， 预先给予 60 mmol L -1 KCl +250 mol L -1二氮嗪， 10 min 后加入 5 molL -1的 PGF 2 ， 观察细胞膜处 于最大去极化状态时

11、PGF 2 对胰岛素释放的影响； 分别加入含5. 5和16. 5 mmol L -1葡萄糖的 KRBB 液， 同时加入100 mol L -1的 DIDS， 10 min 后加入5 mol L -1的 PGF 2 ， 观察氯通道阻断剂对 PGF 2 诱导 胰岛素释放的影响。上述各组均继续孵育 70 min， 留取上清液， -20冻存， 待测胰岛素含量。胰岛素 含量测定按胰岛素放射免疫分析药盒说明书方法进 行操作。 1. 4 细胞内钙离子浓度 （ Ca2 + i） 测定 将培养皿内盖玻片上的细胞培养 48 h， 用 KRBB 液漂洗 2 次后， 加入荧光指示剂 Fluo-3/ AM （终浓度为

12、5 molL -1） 和非离子型的多元醇表面 活性剂 F-127 （终浓度 0. 25，W/ V） ， 避光孵育 30 min（37， 5% CO2） 。洗净染色液， 将盖玻片置于 激光共聚焦显微镜观察池中， 加 KRBB 液或无钙 KRBB 液 1 mL 进行实验。实验中根据需要， 扫描前 及扫描过程中加入不同的工具药于 KRBB 液中。每 种浓度至少测定 3 张盖玻片， 每张盖玻片至少分析 6 个细胞。采用波长 488 nm 的氩离子激光束为激 发光， 530 nm 为发射光， 以 3 12 s 的速度间隔连续 扫描， 总时间 5 10 min。计算机记录储存扫描结 果。将荧光强度 （FI

13、） 数据进行统计分析， 以 FI 与其 基础对照值 （FI0） 的比值 （FI - FI0） / FI0 表示 Ca2 + i的变化， 得到细胞 Ca 2 + i 变化的时间-效 应曲线。 1. 5 统计学分析 实验数据均用 -x s 表示， 用 SPSS 11. 0 统计软 件行 t 检验。 2 结果 2. 1 PGF 2 在 16. 5 mmolL -1葡萄糖浓度下对胰 岛素分泌的影响 在16. 5 mmol L -1葡萄糖浓度下， 5 mol L-1的 PGF 2 或20 mmolL -1 TEA 使 细胞胰岛素分泌明 显增加 （表 1） ， 两组间无显著性差异 （P 0. 05） 。

14、然而， 先给予 TEA 再给 PGF 2 或先给予 PGF 2 再给 TEA， 胰岛素分泌与单独给予 TEA 或 PGF 2 的对照 组比没有明显变化 （P 0. 05） 。说明 PGF 2 的作用 可能与 TEA 相似， 能够促进细胞膜去极化而增加胰 岛素分泌。 Tab 1. Effects of tetraethylammonium chloride （TEA）and/ or prostaglandin F 2 （PGF 2 ）on insu- lin release from NIT-1 cells in the presence of 16. 5 mmol L -1 glucose（G

15、lu） Group Insulin secretion/ mU L -1 Glu21. 2 1. 5 Glu + TEA25. 3 1. 6* * Glu + PGF 2 27. 0 1. 9* * Glu + TEA + PGF 2 26. 8 2. 2* * Glu + PGF 2 + TEA 27. 0 2. 3* * Glu + TEA and Glu + PGF 2 ：After incubation with Glu for 10 min，TEA 20 mmolL -1 or PGF 2 5 molL -1 was added. Glu + TEA + PGF 2 and Glu

16、+ PGF 2 + TEA：PGF 2 5 mol L -1 and TEA 20 mmol L -1 were successively added with a 20- min interval，respectively. When incubation for another 70 min， insulin content in supernatant was measured by radioimmunoas- say. -x s，n =6. * *P 0.05） 。但是先给予 TEA 再给 PGF 2 ， 胰岛 素分泌与单独给予 PGF 2 或 TEA 的对照组相比明显 增加 （表2

17、） 。由此推断， PGF 2 可能在 TEA 诱发膜去 极化的基础上进一步增强了这种去极化作用， 而促进 低浓度葡萄糖刺激时的胰岛素分泌。 Tab 2. Effects of PGF 2 and/ or TEA on insulin release from NIT-1 cells in the presence of 5. 5 mmol L -1 glucose Group Insulin secretion/ mU L -1 Glu19. 0 1. 3 Glu + PGF 2 20. 5 1. 7 Glu + TEA19. 8 1. 9 Glu + TEA + PGF 2 23. 0 2.

18、 4* *# See legend in Tab 1，but PGF 2 was added 10 min after TEA. -x s，n = 6. * * P 0. 05） 。说明在 细胞膜处于最大去极化状态下， PGF 2 不能进一步增 强膜去极化而诱导胰岛素分泌。 2. 4 氯通道阻断剂对 PGF 2 诱导胰岛素分泌的影 响 在 5. 5 mmol L -1葡萄糖下， 100 mol L-1 DIDS 不抑制胰岛素的分泌 （P 0. 05） ， 而在16. 5 mmol L -1葡萄糖浓度下， 却明显抑制了葡萄糖刺激的胰岛 素分泌 （表 3） 。16. 5 mmol L -1葡萄糖浓

19、度刺激下， 预先给予100 mol L -1 DIDS 再给 PGF 2 ， 胰岛素分 泌不仅未增加， 反而较单用 DIDS 时进一步减少， 说 明 DIDS 可以抑制 PGF 2 诱导胰岛素分泌的作用。 提示 PGF 2 诱导胰岛素分泌增加的作用可能与激活 氯通道有关。 Fig 1. Effects of 5 #mol L -1 PGF 2 on 16.5 mmol L -1 glucose-stimulated insulin secretion from NIT- 1 cells in the presence of 60 mmolL -1 KCl +250 #mol L -1 diaz

20、oxide.PGF 2 was added 10 min after KCl + diazoxide. -x s，n =6. * *P 0. 05） ， 说明细胞 Ca2 + i没有变化 （图 2B） 。 89Chin J Pharmacol Toxicol 2006 Apr； 20 （2） Fig 2. Effect of 5 !mol L -1 PGF 2“ onCa2 + iin NIT-1# cells in the presence of 16. 5 mmol L -1 glu- cose.A：the basalCa2 + i. B： Ca 2 + i subsequent to 6

21、0 mmol L -1 KCl +250 mol L -1 diazoxide. C： Ca2 + isubse- quent to 100 mol L -1 DIDS. 预先给予 100 mol L -1 DIDS， 内钙动力曲线迅 速下降后逐渐进入新的平台期，Ca2 + i 降低了 （38 7） % （P 0.01） ， DIDS 显著抑制了高糖下的细 胞 Ca2 + i升高； 接着给予 PGF 2 ， 与新平台期相比， 细胞 Ca2 + i又一次下降了 （25 13） % （P 0.05） ， 说明在 DIDS 作用下， PGF 2 不能诱导细胞 Ca2 + i的 升高， 反而显著降低细

22、胞 Ca2 + i （图2C） 。 3 讨论 众所周知， 细胞膜去极化是诱导胰岛素分泌 的一个重要因素 7。在小鼠 细胞， 钾通道阻断剂 TEA 在 20 mmol L -1浓度下能够阻断 细胞膜上的 ATP 敏感钾通道 （KATP） 、 钙激活钾通道 （KCa） 和延 迟整流性钾通道， 可在 细胞胰岛素分泌机制研究 中作为一种膜去极化试剂 8， 9。本研究发现， 在 16. 5 mmol L -1葡萄糖刺激下， PGF 2 5 molL -1和 TEA 20 mmolL -1均能增强 NIT-1 细胞胰岛素分 泌； 然而先给予 PGF 2 再给 TEA， 或先给予 TEA 再给 PGF 2

23、， 均不能进一步升高胰岛素的分泌， 说明 PGF 2 增强胰岛素分泌可能与 TEA 的作用机制相 似， 即通过促进细胞膜去极化。其他证明还有， 在 5.5 mmol L -1的葡萄糖刺激下， PGF 2 不能促进胰岛 素分泌， 但先给予 TEA 再给 PGF 2 ， 胰岛素分泌明显 增加， 说明 TEA 使 NIT-1 细胞膜去极化， PGF 2 可 能进一步增强了这种作用， 从而促进胰岛素分泌。 有研究显示 10， 11， 在 KCl 60 mmolL-1和钾通 道开放剂二氮嗪 250 mol L -1作用下， 葡萄糖刺激 的 细胞处于最大去极化状态，细胞外钙内流最 强，Ca2 + i 升高

24、达最大值。本实验预先给予相同 浓度的 KCl 和二氮嗪， 使 NIT-1 细胞膜处于最大去 极化状态， 可见 PGF 2 不能进一步增强胰岛素分泌， 说明 PGF 2 促进 NIT-1 细胞胰岛素分泌可能通过 增强膜去极化的机制。细胞 Ca2 + i 研究显示， 在 60 mmol L -1 KCl 和250 molL -1 二氮嗪作用下， NIT-1 细胞 Ca2 + i 迅速升高后稳定在较高值， 应 用 PGF 2 不能进一步升高细胞 Ca2 + i， 也显示了 PGF 2 的作用可能是通过增强膜去极化升高细胞内 钙， 同时也验证了先前高钾和二氮嗪共同作用使 细胞处于最大去极化状态和细胞

25、Ca2 + i升高达最 大值的研究结论 10， 11。 在 细胞， 葡萄糖刺激引起膜去极化促进胰岛 素分泌主要是由于关闭了 KATP通道 12。最近研究 发现，使 细胞上的氯通道开放在增强膜去极化中 也有重要作用 13。 细胞在高浓度葡萄糖刺激下， 可以激活容积调节性氯通道， 增强细胞膜去极 化 14； 同时细胞 Ca2 + i 升高， 激活钙激活的氯通 道， 也可进一步引起 细胞去极化 15。 有文献报道， PGF 2 也可以激活氯通道， 引起细 胞去极化， 从而调节生物功能 16。在很多细胞， PGF 2 引起的 Ca2 + i 升高， 可以激活钙激活氯通 99中国药理学与毒理学杂志 20

26、06 年 4 月； 20 （2） 道， 胞内氯离子外流， 引起细胞去极化， 尽管 Ca2 + i 释放升高， PGF 2 也同时激活 KCa通道， 使细胞复极 化， 但在多数情况下， 激活钙激活的氯通道占主导地 位， 细胞表现为去极化而调节生物学功能 16。 PGF 2 促进 NIT-1 细胞膜去极化是否也通过激活氯 通道途径？本实验可见， 氯通道阻断剂 DIDS 100 mol L -1 （许多 细胞研究证明此浓度的 DIDS 主 要阻断容积调节性氯通道， 而对其他非氯通道无明 显影响 17 19） 显著抑制 16. 5 mmol L-1葡萄糖浓度 刺激下的 NIT-1 细胞胰岛素分泌。说明

27、在 NIT-1 细胞， 高浓度葡萄糖激活氯通道引起细胞去极化可 能在增加胰岛素分泌中也发挥重要作用。而预先给 予 DIDS 再给 PGF 2 ， 胰岛素分泌甚至表现为抑制作 用。可能的原因为， 在 DIDS 作用下， 细胞的氯通 道被阻断， 细胞由去极化状态转变为复极化状态， 此 时加入 PGF 2 ， PGF 2 激活的 KCa通道占主导作用， 细 胞进一步复极， 胰岛素分泌反而被抑制。细胞 Ca2 + i研究也显示， 在 DIDS 作用下细胞 Ca 2 + i 迅速下降， 恢复平台期后 （这与国内外许多研究结 论一致 13， 17 19） 再应用 PGF 2 又会再引起 NIT-1 细胞

28、Ca2 + i迅速下降。由于 细胞 Ca 2 + i 的变 化与细胞膜动作电位变化密切相关， 故也验证了作 者上述的假设。总之， 在氯通道阻断剂阻断 NIT-1 细胞氯电流引起的膜去极化状态下， PGF 2 不能发挥 其作用， 说明 PGF 2 诱导膜去极化而发挥其生物学 作用可能与激活 细胞氯通道有关。但仍需进一 步证明， 如通过膜片钳实验， 记录 PGF 2 作用下氯电 流的改变； 应用分子生物学方法， 如 RNA 干扰特异 性的阻断相关类型氯通道， 从而避免目前氯通道阻 断剂特异性不够高的问题， 将更具有说服力， 这也是 作者下一步实验的目标。 在不同类型细胞， PGF 2 增强细胞去极

29、化的作用 机制复杂。在 NIT-1 细胞， 尽管作者证明 PGF 2 能 够增强膜去极化 （可能通过激活氯通道） ， 升高细胞 Ca2 + i， 促进胰岛素分泌。但是 PGF 2 如何增强细 胞去极化的机制仍需要进一步深入研究。当然， PGF 2 促进膜去极化可能并不是其诱导胰岛素分泌 的唯一机制。 4 参考文献： 1 Peredo HA，Feleder EC，Adler-Graschinsky E. Time- course of the alterations in prostanoid production and in contractile responses of mesenter

30、ic beds isolated from streptozotocin diabetic rats J . Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids， 1999， 60 （4） ： 269 -274. 2 Landgraf R， Landgraf-Leurs MM.The prostaglandins system and insulin release.Studies with the isolated perfused rat pancreas J . Prostaglandins，1979，17 （4） ： 599 -613. 3 Moran M

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41、 2 on glucose-induced insulin secretion through membrane depolarization and elevation of intracellular calcium in NIT-1 cells YE Chun-Ling 1* ，YUAN Zhen-Yu1，REN Sheng-Hua1，YE Tao2，ZHONG Ling1，JIANG Jia-Hua3 （1. Department of Pharmacology，Pharmacy College， 2. Huaqiao Hospital，Jinan University，Guangzh

42、ou 510632，China； 3. Department of Physiology，Medical Science Building， Toronto University，Toronto，Canada） Abstract： AIM To explore the cellular mecha- nisms in which prostaglandin F 2 （PGF 2 ）aug- ments glucose stimulated insulin secretion in NIT- 1 cells. METHODS Insulin content in super- natant wa

43、s measured by radioimmunoassay. Intra- cellular calcium concentration（ Ca2 + i）of NIT- 1 cells was determined by confocal laser scan- ning method with Fluo-3/ AM as a fluorescent probe. RESULTS In the presence of 16.5 mmol L -1 glucose， 5 mol L -1 PGF 2 or 20 mmol L -1 tetraethylammonium（TEA，a potas

44、sium channel blocker）both increased significantly insulin se- cretion，while combination of TEA and PGF 2 could not induce more elevation in insulin secre- tion. In the presence of 5. 5 mmol L -1 glucose， PGF 2 did not increase insulin secretion.But when pretreated with TEA，PGF 2 significantly enhanc

45、ed insulin secretion stimulated by 5. 5 mmol L -1 glucose. PGF 2 did not potentiate insu- lin secretion stimulated by 16.5 mmol L -1 glucose when NIT-1 cells were in depolarized condition in the presence of 60 mmolL -1 KCl and 250 molL -1 diazoxide or pretreated with chloride channel blocker 4， 4-di

46、isothiocyanatostilbene-2， 2- disulfonic acid （DIDS） . Otherwise，PGF 2 signifi- cantly elevated NIT-1 cellsCa2 + i，but pre- treated with 60 mmol L -1 KCl and 250 mol L -1 diazoxide， the effect was canceled. DIDS not only decreased significantlyCa2 + i of NIT-1 cells， but also reversed the effect of P

47、GF 2 from increas- ingCa2 + i to decreasingCa2 + i. CONCLU- SION Potentiation of PGF 2 on the glucose-in- duced insulin secretion may be mediated by mem- brane depolarization through activation of chloride channels and elevation ofCa2 + i. Key words：prostaglandin F 2 ；insulin；cells， NIT-1；calcium，cytosolic；chloride channels Foundation item：The project supported by Natural Sci- ence Fondation of Guangdong Province（04010463） ；and by National Natural Science Foundation of China（30070873） *Corresponding author. （本文编辑 董立春） 101中国药理学与毒理学杂志 2006 年 4 月； 20 （2）