何首乌对Aβ140诱导的大鼠海马神经元内BDNF表达的影响.pdf

《何首乌对Aβ140诱导的大鼠海马神经元内BDNF表达的影响.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《何首乌对Aβ140诱导的大鼠海马神经元内BDNF表达的影响.pdf（6页珍藏版）》请在三一文库上搜索。

1、中南大学学报 （医学版） J Cent South Univ（Med Sci） 2006， 31 （2） * 何首乌对 A1-40 诱导的大鼠海马神经元内 BDNF 表达的影响 邱 光， 伍校琼， 罗学港* （ 中南大学湘雅医学院人体解剖学与神经生物学系， 长沙 410013） 摘要 目的： 探讨 A1-40 对海马 CA1 区神经元脑源性神经营养因子 （ brain-derived neurotrophic factor， BDNF） 表达的影响， 以及何首乌对其的干预作用。方法： 右侧海马微量注射 A1-40， 观察海马 BDNF 的表达变化； 并使用何首乌浸膏对大鼠模型进行干预治疗。动物

2、存活 30 d 后， 用 “ Y”迷宫检测各 组动物学习和记忆能力； 采用免疫组织化学方法和 Western-blot 检测海马 CA1 区神经元 BDNF 的表达； 应用尼氏染色法观察海马 CA1 区神经元数目和形态。结果：A1-40 能够导致大鼠学会躲避电刺激所 需的 “ 尝试次数” 明显增加； BDNF 蛋白的表达明显下降， 并可以在海马观察到 A1-40 的沉积； CA1 区的 神经元出现胞体肿胀、 排列散乱等形态改变， 且使用何首乌对动物模型干预治疗 30 d 后， 大鼠的躲避电 刺激所需的 “ 尝试次数” 明显下降； 海马 CA1 区神经元 BDNF 表达明显上调。结论： 使用 A

3、1-40 在体内 能够下调海马 CA1 区神经元 BDNF 表达。何首乌干预治疗 30 d， 能够改善动物的学习和记忆能力， 并能 减少 A1-40 对海马 CA1 区神经元 BDNF 表达的抑制作用。 关键词 海马； 脑源性神经营养因子； 何首乌； 大鼠 中图分类号 R282. 71 文献标识码 A 文章编号 1672-7347 （2006） 02-0194-06 Effect of polygonum multiflorum thunb on BDNF expression in rat hippocampus induced by amyloid beta-protein（A）1-40

4、QIU Guang，WU Xiao-qiong，LUO Xue-gang* （ Department of Anatomy and Neurobiology， Xiangya School of Medicine，Central South University，Changsha 410013， China） Abstract： Objective To explore the effect of polygonum multiflorum thunb（ PMT）on the expression of brain-drived neurtrophic factor（BDNF）in hippo

5、campus CA1 in rats induced by A1- 40. Methods The rat model was established by injecting A1-40 into the right dorsal hippocampus in rats，and their behavior was observed by Y-maze. The morphological changes of rat hippocampus were examined by the Nissl staining. The expression of BDNF in hippocampus

6、CA1 neurons was also examined by immunohistochemistry and Western blot. Results After the administration of A1-40， the times of rats learning how to elude electric stimulation were significantly increased，and the ex- pression of BDNF in hippocampus CA1 were obviously reduced. The aggregation of A1-4

7、0 in hip- pocampus and the morphological changes of CA1 hippocampus were found. After the treatment with PMT for 30 days，the times learning how to elude electric stimulation were obviously reduced，while the expression of BDNF in hippocampus CA1 was also increased. Conclusion PMT can reverse the down

8、-regulation of BDNF expression in hippocampus CA1 induced by A1-40. Key words： hippocampus； brain-drived neurtrophic factor； polygonum multiflorum thunb； rats J Cent South Univ（Med Sci） ，2006， 31 （2） ： 0194-06 491 *收稿日期： 2005-05-18 作者简介： 邱光 （1977-） ， 男， 湖南汨罗人， 硕士研究生， 主要从事中枢神经系统退行性疾病的基础研究。 *通讯作者， E-m

9、ail： xgluo xysm. net 基金项目： 教育部科学技术研究重大课题 （104141） 何首乌对 A1-40 诱导的大鼠海马神经元内 BDNF 表达的影响 邱光， 等 脑源性神经营养因子 （ brain-drived neurtrophic factor， BDNF） 是神经营养因子家族的一个重要成 员， 广泛分布于中枢神经系统， 它有重要的神经保 护作 用 1。同 时， 研 究 还 发 现 在 Alzheimer disease （ AD） 患 者 海 马、 皮 层、 基 底 前 脑 神 经 元 中 BDNF 和它的受体 trkB （ tyrosine kinase B， trk

10、B） 表达明显 下降， 提示 BDNF 可能与 AD 呈 一 定 的 相 关 性 2。 因此， 探 讨 BDNF 在 AD 患 者 脑 内 表 达 下 降 的 原 因， 并寻找有效药物以抑制细胞内下调 BDNF 表达 的信号通路或增加细胞内 BDNF 表达成为治疗 AD 的措施之一。Tong 等 3发现， A1-40 在体外能够 下调 BDNF 的转录， 从而减少 BDNF 的表达， 因此 A1-40 的沉积被认为是导致 AD 患者 BDNF 表达 下降的原因之一， 但 A1-40 在体内对 BDNF 表达 变化影响未见报道。研究表明， 何首乌能改善 AD 病人的认知功能和 AD 动物模型的学

11、习和记忆能 力 4， 5； 其机制可能通过抗氧化、 抗氧自由基、 提高 组织中超氧化物歧化酶的作用。而最近张兰等 6 实验表明， 何首乌对 淀粉样蛋白细胞毒作用的 拮抗不仅通过其抗氧化机制， 可能还包含其他神 经保护机制。本文通过大鼠右侧海马微量注射聚 集态 A1-40 建立动物模型 5， 观察动物存活 30 d 后海马 CA1 区神经元 BDNF 的表达变化， 以及何 首乌干预 治 疗 对 其 的 影 响， 以 期 探 讨 A1-40 对 BDNF 的表达影响， 并进一步了解何首乌保护作用 的机制， 为其临床应用提供理论基础。 1 材料与方法 1. 1 实验动物 健康雄性 SD 大鼠 46

12、只， 体质 量约 200 220 g， 由湖南农业大学动物中心提供。 动物饲养在通风良好、 食物和水充足的动物室， 并 保证动物 24 h 正常昼夜节律。 1. 2 实验方法 1. 2. 1 动物行为学的观察 动物行为学的观 察方法参照张石宁等 5的 “ Y” 迷宫检测方法 （ 图 1A） ， 采用三等分辐射式迷路箱 （ “ Y” 迷宫） 。三 臂相互之间夹角为 120 度， 臂长 40cm， 箱底铺以 直径 3 mm， 间距 12 mm 的铜棒， 每臂顶端有刺激 信号灯。实验时， 灯 光 信 号 示 安 全 区 （ 不 通 电） ， 安全区的方位随机变换， 动物在分组前和手术结 束后 30

13、d 进行实验。开始进行 “ Y” 迷宫测试时， 先将大鼠放入迷宫中； 3 个支臂灯全打开， 让其适 应环境 1 min， 然后关灯。打开鼠不在的任一臂的 灯 （ 条件信号） ， 同时记录时间。经 2 s 延迟后， 灯 不亮的两只 臂 通 电 （ 非 条 件 刺 激） ， 电 击 电 压 50 V， 记录动物躲避至安全区的时间， 灯亮保持 10 s， 即完成一次训练。规定大鼠受电击后从起步区直 接逃至安全区为 “ 正确反应” ， 否则为错误反应。 每测试 一 次 后 动 物 休 息 30 s， 测 10 次 后 休 息 5 min。大鼠学习记忆能力以连续 10 次测试中有 9 次为 “ 正确反应

14、” 时， 所需的电击次数 （ 即尝试次 数） 表示其学习获得能力。若尝试次数超过 30 次 则不再测试， 并以 30 次为最大值计数。各组大鼠 躲 避 电 刺 激 所 需 的 尝 试 次 数 以 均 数 标 准 差 表示。 1. 2. 2 动物的筛选和分组 通过 “ Y” 迷宫筛 选动物， 淘汰动物 10 只， 选择活跃、 电击逃避迅速 的大鼠 36 只参与实验。动物随机分为假手术组 （4 只） ， 右侧海马注射生理盐水 （ NS）+ 生理盐水 灌胃干 预 组 （ NS + NS 组， 8 只 ） ， 右 侧 海 马 注 射 A1-40 + 生 理 盐 水 干 预 灌 胃 组 （ A + NS

15、 组， 12 只） ， 右侧海马注射 A1-40 + 何首乌 （ PMT） 干预 灌胃组 （ A1-40 + PMT 组， 12 只） 。 1. 2. 3 动物手术 将 500 g A1-40 溶于 50 L 注射用生理盐水中， 用电动混悬器充分混匀， 置于37 温箱中孵育 1 周， 使其变为聚集状态的 A1-40。 然后置于 4 冰箱中备用 5。 将 A1-40 + NS 组和 A1-40 + PMT 组 SD 大 鼠用 10% 水合氯醛 （0. 35 mg / kg） 麻醉后置于立 体定位仪上， 切开皮肤， 找到前囟所在位置。参考 大鼠图谱和相关文献 7确定前囟后 3. 0 mm， 中线

16、旁开 2. 0 mm， 以牙科钻钻开一骨窗， 将微量注射 器固定在立体定位仪上， 进针约 2. 8 mm， 缓慢均 匀注入 A1-40 1 L； 5 min 注射完毕， 留针 5 min， 以保证溶液充分弥散， 然后缓慢撤针。假手术组 仅切开皮肤、 牙科钻钻孔， 不注射任何溶液， 然后 缝合皮肤。NS + NS 组只注射等量生理盐水， 余操 作同上。术后即动物保温至清醒。A1-40 + PMT 组手术苏醒后第 2 天使用何首乌浸膏灌胃 8 g / （ kg d ） ， 每 日 分 2 次 进 行 灌 胃， 分 别 为 上 午 9: 00 am 和下午4: 00 pm。NS + NS 组、 A1

17、-40 + NS 组灌胃等量的生理盐水。连续灌胃 30 d。 1. 2. 4 动物灌注取材 麻醉动物动物后，4% 多聚甲醛灌注、 断头取脑， 置 4% 多聚甲醛后固定 2 h， 入 30% 蔗糖直至标本沉底。恒冷切片机在注 射点附近连续冠状切片， 片厚 40 m。 1. 2. 5 Nissl 染色 组织标本切片后， 置 75% 酒精脱脂 30 min 后， 以 0. 5% 焦油紫进行 Nissle 染 591 中南大学学报 （医学版） ， 2006， 31 （2） 色， 脱水透明后中性树胶封片。 1. 2. 6 BDNF 免疫组化检测和定量分析 为了 检测 BDNF 的表达， 实验参照 Mur

18、er 等 8的方法进 行 BDNF 的 免 疫 组 化 检 测。 阴 性 对 照 反 应：用 0.01 mol/ L PBS 代替一抗， 排除二抗的非特异性染 色。选取对应大鼠海马层面各 4 张切片， 用 Motic 摄像系统照片， 并用 25 m2计数板在 Motic 显微镜 下 （ 100） 计数每只大鼠右侧海马 CA1 区相同视 野 BDNF 阳性神经元数。计数镜下能够分清细胞 轮廓的细胞。 1. 2. 7 Western blot 检测 BDNF 蛋 白 的 表 达 提取各组大鼠 （ 每组 6 只） 右侧海马新鲜的组织蛋 白。蛋白浓度用 Lowry 法蛋白定量。进行电泳、 转 膜、 和

19、免疫检测 （ I 抗1: 1 000 兔抗 BDNF，30 ，3 h） 按 ECL 免疫检测试剂盒进行显色、 曝光、 照相。 Band Leader 图像分析系统测量 BDNF 蛋白条带的 OD 值。计算方法为： BDNF 相对表达量 = BDNF 蛋 白质条带光密度值 / 上样量。 1. 3 统计学处理 统计各组数据， 以均数 标 准差表示。实验数据用 SPSS10. 0 统计软件分析， 同组动物 手 术 前 后 的 比 较 用 单 样 本 均 数 的 t 检 验， 动物手术前后各组间的比较用单因素的方差 分析。P 0.05） ， 提示海马内注射生理盐水不能引起大鼠学 习记忆 能力 的改变；

20、 A1-40 + NS 组 手 术 后 30 d 大鼠学会躲避电刺激的 “ 尝试次数” 明显多于手术 前动物躲避电刺激的 “ 尝试次数” （ P 0. 05） ， 提示经何首乌灌胃 处理的 AD 大鼠学习记忆能力在手术前后无明显 变化 （ 假手术组和 NS + NS 组之间无明显差异， 因 此将假手术组合并到 NS + NS 组） 。手术前各组 间大 鼠 的 学 习 记 忆 能 力 之 间 差 异 没 有 显 著 性 （F =0.245，P 0. 05， 表 1， 图 1B） ， 手术后 30 d， A1-40 + NS 组与 NS + NS 组比较， 大鼠获得记忆 的尝试次数之间差异有统计学

21、意义 （ P 0.05 Fig. 2 QuantitativeanalysisofBDNFpositivecellsineachgroup， * vs NS +NS， P 0.05 Fig. 4 Quantitative analysis of BDNF expression in rats * vs NS + NS，P 0.05 表 1 各组大鼠 “Y” 迷宫测试学会躲避 电刺激的 “尝试次数”（-x s， 次） 组 别n 获得记忆尝试次数 术 前术后 30 d NS + NS 组1214.11 3.6215.44 2.92 A1-40 + PMT 组1215.2 4.5917.20 3.4

22、6 A1-40 + NS 组1215.4 4.6424.33 2.18* 与手术前比较，* P 0.05； 与 NS + NS 组比较； P 0.05； 与 A1-40 + PMT 组比较， P 0.05 3 讨 论 许多研究报道了注射 A1-40 后， 能够引起动 物行为学的改变， 可以表现为参考记忆的认知能 力、 学习巩固能力、 物体辨别能力、 工作记忆能力 等下降。各实验室报道的认知能力差异， 可能是 由于各实验使用的 A1-40 的片段长度、 注射的方 式和部位、 A1-40 注射和动物行为学检测的时间 间隔等不同 造 成 的。与 大 部 分 实 验 方 法 一 致 的 是， 本实验选

23、取海马作为注射点， 直接注射聚集状 态的 A1-40， 通过 “ Y” 迷宫检测动物学习和记忆 能力。实验发现 A1-40 + NS 组 与 NS + NS 组 之 间， 动物的学习和记忆能力差异有显著性， 与张石 宁 5等结果一致； 说明 A1-40 能够导致动物学习 和记忆能力障碍 （ 表 1） 。 Nissl 染色显示，A1-40 + NS 组海马 CA1 区， 只有少数细胞出现胞体肿胀， 排列散乱等形态学 改变， 但 是 细 胞 丢 失 不 明 显 （ 图 1D， 图 1E） 。同 时， 发现 A1-40 + NS 组的海马 CA1 区 BDNF 的表 达有显著性的降低， 提示外源性的

24、 A1-40 可能影 响局部海马 CA1 区神经元的 BDNF 表 达。因 此， 在体内 A1-40 能够影响 BDNF 的表达。 目前 A1-40 影响细胞 BDNF 表达的具体机制 尚不明确， 但 Tong 等 3通过体外的实验发现 A1- 40 可能通过抑制 PKA 通路下调皮质神经元中的 cAMP response element binding （ CREB） 基因表达， 而 CREB 能够调 控 BDNF 的 启 动 子 1， 3 的 表 达。而 且， 研究还发现在 AD 患者脑内 CREB 的表达也明 显下调， 故 A1-40 可能通过 PKA 通路影响 CERB 的磷酸化， 从

25、而下调 BDNF 表达。值得注意的是， 在 AD 患者的海马、 皮层、 基底前脑胆碱能神经元 中， BDNF， BDNF mRNA 和 BDNF 的 启 动 子 1， 2， 3 表达都明显下降 9， 10。本实验发现， A1-40 在体 内能够下调海马 CA1 区神经元 BDNF 表达， 说明 A 对细胞 BDNF 表达的抑制作用可能是 AD 患者 脑内 BDNF 表达下降的原因之一。 本实验发现经何首乌干预治疗 30 d 后， A1- 40 + PMT 组大鼠学会躲避电刺激的尝试次数” 明 显少于 A1-40 + NS 组； 而与 NS + NS 组比较， 上 述尝试次数差异无显著性， 提示

26、何首乌可能通过 抑制细胞的氧化损伤来发挥作用。但张兰等 6实 验表明， 何首乌对 A1-40 细胞毒作用的拮抗不仅 通过其抗氧化机制， 可能还包含其他神经保护机 制。本实验通过免疫组织化学方法和 Western blot 检测， 发现在何首乌干预组动物的海马 CA1 区神 经元 BDNF 表 达 明 显 高 于 A1-40 + NS 组， 而 与 NS + NS 组相比， 差异无显著性。这说明何首乌能 够减少 A1-40 对海马 CA1 区神经元 BDNF 表达 的抑制作用， 提示何首乌可能通过上调细胞 BDNF 的表达， 从而发挥神经保护作用。 BDNF 是神经营养因子家族的一个重要成员，

27、实验证明 BDNF 能够抑制神经元的凋亡， 保护神经 元免受缺 血、 轴 突 切 断、 谷 氨 酸 兴 奋 性 毒 性 的 损 伤。而且， BDNF 能够从结构和功能上调节突触可 塑性， 与 LTP 等 密 切 相 关； 参 与 学 习 和 记 忆 的 调 控。有研究发现， 通过脑室灌注 A1-40 能够导致 海马 CA1 区的 LTP 明显减弱， 这可能与 BDNF 表 达下降有关， 且认为 AD 中突触可塑性的变化可能 最终将导致 AD 其他病理改变和临床症 状 出 现。 因此， 认为 BDNF 可 能 是 治 疗 AD 的 有 效 药 物 之 一。但由于直接运用外源性的 BDNF 存在许

28、多困 难， 如因其分子量较大、 静脉注射难以通过血脑屏 障、 长期脑室内治疗易引起损伤和感染、 价格昂贵 等， 它的临床应用受到一定的限制。很多文献已 报道， 祖国传统中药能够上调神经营养因子和 / 或 891 何首乌对 A1-40 诱导的大鼠海马神经元内 BDNF 表达的影响 邱光， 等 神经营养因子受体的表达 11。胡雅儿等12发现， 知母的活性成分 ZMS 能提高老龄大鼠的 BDNF 表 达水平， 说 明 某 些 中 药 可 能 通 过 提 高 内 源 性 的 BDNF 来参与神经保护作用。本实验的结果提示， 何首乌可能含有导致体内产生某些能通过血脑屏 障的小分子物质， 阻断 A1-40

29、 下调 BDNF 表达的 信号通路， 或者直接促进 内 源 性 BDNF 合 成 和 释 放， 从而参与神经保护作用。这对于保护和修复 神经元、 改善学习记忆功能和防治 AD 等神经退行 性疾病具有重要意义。 参考文献： 1 Kaplan DR，Miller FD.Neurotrophin signal transduction in the nervous system J .Curr Opin Neurobiol，2000， 10 （3） ： 381-391. 2 Ferrer I，Marin C，Rey Mj，et al. BDNF and full-length and truncat

30、ed TrkB expression in Alzheimer disease.Implications in therapeutic strategies J .J Neuropathol Exp Neurol， 1999， 58 （7） ： 729-739. 3 Tong L，Thornton Pl，Balazs R，et al.Beta -amyloid- （ 1- 42）impairs activity-dependent cAMP-response element-bind- ing protein signaling in neurons at concentrations in

31、which cell survival is not compromised J . J Biol Chem，2001， 276 （20） ： 17301-17306. 4 李旻， 杜小平， 杨期东， 等. 何首乌对海人藻酸致大鼠脑 AchE 神经元及纤维损伤的保护作用 J . 卒中与神经 疾病， 2002，9 （5） ：299-302. 5 张石宁， 陈明. 淀粉样肽致大鼠 Alzheimer 病模型的研究 J . 中国老年学杂志， 1999， 19 （6）331-333. 6 张兰， 李林， 李雅莉. 何首乌有效成 分 二 苯 乙 烯 甙 对 神 经细胞保护作用的机制 J . 中国临床康复

32、，2004，8 （1） ： 118-121. 7 包新民， 舒斯方. 大鼠脑立体定位图谱 M . 北京： 人民 卫生出版社， 1991. 40-50. 8 Murer MG，Boissiere F，Yan Q，et al. An immunohistochem- ical study of the distribution of brain-derived neurotrophic fac- tor in the adult human brain，with particular reference to Alzheimers disease J .Neuroscience，1999， 88（

33、 4 ） ： 1015-1032. 9 Hock C，Heese K，Hulette C，et al. Region-specific neuro- trophin imbalances in Alzheimer disease：decreased levels of brain-derived neurotrophic factor and increased levels of nerve growth factor in hippocampus and cortical areas J .Arch Neurol，2000， 57 （6） ： 846-851. 10Garzon D，Yu

34、G，Fahnestock M. A new brain-derived neuro- trophic factor transcript and decrease in brain-derived neuro- trophic factor transcripts 1，2 and 3 in Alzheimer s disease parietal cortex J .J Neurochem，2002， 82（ 5 ） ： 1058- 1064. 11 张兰， 李林， 李斌， 等. 中药复方 962 胶囊对老年大鼠海 马神经生长因子 及 其 受 体 表 达 的 影 响 J . 中 国 自 然 医学杂志，2002，2 （4） ： 195-199. 12 胡雅儿， 孙启祥， 夏宗勤. ZMS 对老年大鼠脑内 NGF 和 BDNF 的影响 J . 中 国 药 理 学 通 报， 2003，19（ 2 ） ： 149-151. （ 本文编辑 傅希文） 991