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1、收稿日期 2005 -08 -31 基金项目 国家自然科学基金资助 （30428012， 30470378） 作者简介 孙 琰 （1980 - ） ， 女， 山东省莱州市人， 在读硕士 生。 *通讯联系人， E-mail：yeqn nic. bmi. ac. cn 具有多种剪接形式的 RNA 结合蛋白基因的克隆、 表达及其细胞内 定位 孙 琰，张 浩 ， 叶棋浓* （军事医学科学院生物工程研究所， 北京 100850） 摘要 目的： 构建具有多种剪接形式的 RNA 结合蛋白 （RBPMS） 基因的真核表达载体， 并在真核细胞中进行表达， 确定 RBPMS 在细胞中的定位。方法： 采用 PCR
2、技术， 从人卵巢文库中扩增 RBPMS 基因的完整编码序列， 将所扩增基 因克隆到带 FLAG 标签的真核表达载体上， 转染人胚肾细胞 293T， Western 印迹鉴定 RBPMS 的表达。然后将所扩增 基因克隆到带绿色荧光标签的 pEGFP-C1 表达载体上， 转染乳癌细胞 ZR75-1， 观察 RBPMS 在细胞中的定位情况。结 果： 经限制性内切酶分析和 DNA 序列测定鉴定构建的重组表达载体正确， Western 印迹实验证明 RBPMS 表达成功， 通 过激光共聚焦显微镜观察， RBPMS 分布在胞质中， 在 40% 50% 细胞中 RBPMS 呈聚集状分布。结论： 成功构建了
3、RBPMS 基因的真核表达载体， 该基因产物分布在胞质中， 在40% 50%细胞中 RBPMS 呈聚集状分布。 关键词 RBPMS； 克隆； 基因表达； 细胞内定位 中图分类号 Q786； R737. 9文献标识码 A 文章编号 1000-5501 （2006） 02-0106-04 Cloning，expression and cellular localization of gene of RNA binding protein with multiple splicing（RBPMS） SUN Yan，ZHANG Hao，YE Qi-Nong* （Institute of Biotech
4、nology， Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China） Abstract Objectives： To construct the eukaryotic expression vector of RBPMS gene，express RBPMS protein in eu- karyotic cells and to investigate the cellular localization of RBPMS protein. Methods： The complete coding sequence of RBPM
5、S gene was amplified by PCR technique from human ovary cDNA library. The product of PCR was inserted into the pcDNA3-FLAG vector. Then human embryo kidney 293T cells were transfected with the recombinant plasmid and the expression of RBPMS gene was identified by Western blot. The coding sequence of
6、RBPMS gene was also inserted into the pEGFP-C1 vector with green fluorescence tag，and then human breast cancer ZR75-1 cells were transfected with the recom- binant plasmid. The green fluorescence was observed by confocal laser microscope. Results： The expression vectors of RBPMS gene were constructe
7、d and confirmed by restriction enzyme digestion and DNA sequence analysis. The green fluo- rescence could be seen in cytoplasm under confocal laser microscope， and cytoplasmic RBPMS was concentrated in granular structures in 40% -50% of transfected cells. Conclusion： The eukaryotic expression vector
8、s of RBPMS gene are construc- ted successfully. RBPMS protein is located in cytoplasmic，and cytoplasmic RBPMS is concentrated in granular structures in 40% -50% of transfected cells. Key words RBPMS；cloning；gene expression；cellular localization 具有多种剪接形式的 RNA 结合蛋白 （RNA binding pro- tein with multiple
9、 splicing， RBPMS） 基因是 1996 年在研究 Werner 综合征时首次发现的， 该基因位于人类染色体 8p11- 12 上， 染色体 8p 是与 Werner 综合征有关的基因的富集 区 1， 一些医学上重要的基因也位于 8p 上， 包括结直肠癌、 前列腺癌等肿瘤抑制基因 2， 3。RBPMS 又名 hermes， 是一种 RNA 结合蛋白， 在心脏分化过程中起重要作用， 在分化的心 肌中高表达， 可以调节心肌分化所需要的成熟 RNA。然而 在发育的胚胎中， 如果 RBPMS 过表达却会抑制心脏的发育， 导致一些编码心肌分化标志物的成熟 RNA 缺失， 全部的心 肌形态学发
10、育停止 4。RBPMS 在肾脏分化所需要的 mRNA 代谢过程中也起调节作用 4。 目前关于 RBPMS 的研究比较少。根据 RNA 结合蛋白 的识别模序是否存在， 在脊椎动物中已经发现了上百种 601 军事医学科学院院刊 2006 年 4 月 第 30 卷 第 2 期 Bull Acad Mil Med Sci，Apr 2006； Vol 30 No 2 RNA 结合蛋白， 尽管这些蛋白的具体功能目前仍不知道， 但 是它们中很大一部分可能参与基因表达的转录后调控 4。 因此推断， RBPMS 作为一种具有多种剪接形式的 RNA 结合 蛋白， 也可能参与基因表达的转录后调控。Northern
11、印迹实 验表明， RBPMS 在卵巢、 心脏、 前列腺和肠中有高表达， 在骨 骼肌、 脾脏、 胸腺、 脑和外周血粒细胞中表达较低 1。 为了进一步研究该基因的功能， 我们构建了 RBPMS 的 真核表达载体， 进行了基因表达产物的亚细胞定位实验， 为 深入了解该基因的功能奠定了基础。 1 材料与方法 1. 1 材料 1. 1. 1 质粒、 菌株和细胞株 pcDNA3-FLAG 表达载体、 绿 色荧光蛋白表达载体 pEGFP-C1， E. coli DH5， SV40 转化的 人胚肾细胞 293T 和乳癌细胞株 ZR75-1 均由本室保存。 1. 1. 2 抗体 抗 FLAG 单克隆抗体购自 S
12、igma 公司， 辣根过 氧化物酶偶联的羊抗鼠 IgG 购自 Santa Cruz 公司。 1. 1. 3 分子生物学试剂 各种分子生物学试剂分别购自 NEB， Qiagen， Pierce 及 Invitrogen 等公司。 1. 2 方法 1. 2. 1 重组质粒的构建 以卵巢 cDNA 文库 （Clontech 公司 产品） 为模板， 利用上游引物 5-CCCAAGCTTATGAACAACG- GCGGCAAA-3 和 下 游 引 物 5-GCTCTAGATCAACATGG- GAGCTCCCTC-3，PCR 扩增 RBPMS 基因。PCR 反应条件： 94预变性 3 min， 94 3
13、0 s， 54 30 s， 72 1 min， 72 延 伸 7 min， 共 30 个循环。用 Hind 和 Xba双酶切 PCR 产 物， 将 PCR 产物插入到用同样酶进行双酶切的 pcDNA3- FLAG 载体中， 即得重组质粒 pcDNA3-FLAG-RBPMS。 为了观察 RBPMS 蛋白在细胞中的定位情况， 我们将 RBPMS 与绿色荧光蛋白 EGFP 的 C 端融合表达。以 pcD- NA3-FLAG-RBPMS 质粒 DNA 为模板， 利用上游引物 5- CCGCTCGAGCTATGAACAACGGCGGCAAA-3和下游引物 5- CGGAATTCTCAACATGGGAGC
14、TCCCT-3，PCR 扩增 RBPMS 基因。PCR 反应条件： 94 预变性 3 min， 94 30 s， 64 30 s， 72 1 min， 72延伸 7 min， 共 30 个循环。用 Xho和 EcoR双酶切 PCR 产物， 将 PCR 产物插入到用同样酶进行 双酶切的 pEGFP-C1 载体中， 得 到 重 组 质 粒 pEGFP-C1- RBPMS。 1. 2. 2 哺乳动物细胞的转染 细胞用含 10% 新生牛血清 和双抗的 DMEM 培养基培养， 用不含双抗、 含 10%新生牛血 清的 DMEM 培养基将人胚肾细胞 293T 接种于 12 孔板中， 接种量以转染时细胞密度达
15、到 90% 为宜， 培养 24 h 后进行 转染。将 1. 0 g pcDNA3-FLAG-RBPMS 重组质粒与 80 l 无血清无抗生素的 DMEM 培养基混合， 再将 2. 5 l Lipo- fectamine 2000 与 80 l 无血清无抗生素的 DMEM 培养基混 合， 然后将上述两种溶液轻轻混合， 室温放置 20 min， 加入到 12 孔板中。37， 5% CO2常规培养 24 h 后收获细胞， 以转 染空载体 pcDNA3-Flag 的 293T 细胞作为对照。 1. 2. 3 Western 印迹分析 293T 细胞转染 24 h 后， 收集细 胞， 加入 SDS 加样
16、缓冲液， 煮沸10 min， 离心后取上清液进行 SDS-PAGE， 电泳结束后转移至硝酸纤维素膜上， 用 5% 脱脂 奶粉 4封闭过夜， 然后用 5% 脱脂奶粉稀释的抗 FLAG 单 克隆抗体室温轻摇 1 h， TBST 洗膜 3 次， 每次 7 min， 加入用 5%脱脂奶粉稀释的辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠 IgG， 室 温轻摇1 h， TBST 洗膜3 次， 每次7 min， 用化学发光法显色5 min， 压片显影。 1. 2. 4 RBPMS 蛋白的细胞内定位检测 将重组质粒 pEG- FP-C1-RBPMS 转染 ZR75-1 乳癌细胞。首先将 ZR75-1 乳癌 细胞接种于盛有盖玻
17、片的 6 孔板中， 转染过程按 1. 2. 2 中所 述进行。同时转染空载体 pEGFP-C1 对照。 37， 5% CO2常规培养 24 h 后将细胞进行固定染核。 吸弃培养基， 用 PBS 洗细胞。4% 多聚甲醛室温固定细胞 30 min， 用 PBS 洗细胞 3 次， 每次 10 min。DAPI 染色 5 min， 用 PBS 洗细胞 2 次， 每次 5 min。将盖玻片封片固定到载玻 片上， 通过激光共聚焦荧光显微镜观察荧光的表达。 2 结果 2.1 带有 FLAG 标签的重组质粒 pcDNA3-FLAG-RBPMS 的鉴定 首先从人卵巢 cDNA 文库中 PCR 扩增 RBPMS
18、基因的完 整编码区， 获得长约 660 bp 的 cDNA 片段 （图 1） ， 将所扩基 因片段克隆到带 FLAG 标签的经 Hind和 Xba双酶切的 真核表达载体 pcDNA3-FLAG 上， 构建的重组质粒 pcDNA3- FLAG-RBPMS 经菌落 PCR 鉴定， 得到约 660 bp 的外源 DNA 插入片段。可是对所提质粒进行双酶切鉴定时却切不出目 的片段， 可能是由于限制性内切酶 Xba识别序列中的碱基 被甲基化， 导致该 DNA 切不开。对重组质粒进行序列测定， RBPMS 编码区序列完全正确 （数据略） ， 并含有 Hind和 Xba酶切位点， 证明克隆成功。 图 1 R
19、BPMS 基因 PCR 扩增产物琼脂糖电泳图 1. DNA 标志物 （DL-2000） ； 2. PCR 扩增的 RBPMS 基因片 段 2. 2 带有 FLAG 标签的 RBPMS 的表达 将重组质粒 pcDNA3-FLAG-RBPMS 转染 293T 细胞， 同 时转空载体 pcDNA3-FLAG 作为对照。收集细胞总蛋白质进 行 SDS-PAGE 和 Western 印迹分析。结果表明， 转染 pcD- NA3-FLAG-RBPMS 的真核细胞表达了相对分子质量约 30 103的蛋白质， 而转染空载体后无蛋白质条带， 与预期结果相 同 （图 2） ， 证明构建的重组质粒能介导 FLAG-
20、RBPMS 在真 核细胞中表达。 701 第 2 期 孙 琰， 等 . 具有多种剪接形式的 RNA 结合蛋白基因的克隆、 表达及其细胞内定位 图2 Western 印迹检测 FLAG-RBPMS 在 293T 细胞中的表达 1. 空载体 pcDNA3-FLAG； 2. 重组质粒 pcDNA3-FLAG- RBPMS 2. 3 带有 EGFP 荧光标签的重组质粒 pEGFP-C1-RBPMS 的鉴定 将 RBPMS 基因克隆到带绿色荧光标签的 pEGFP-C1 表 达载体上， 构建好的重组质粒 pEGFP-C1-RBPMS 经 Xho和 EcoR 双酶切鉴定， 得到约 660 bp 的外源 DN
21、A 插入片段 （图 3） ， 而空载体 pEGFP-C1 经同样酶切后无插入片段， 证明 克隆成功。 图 3 重组质粒 pEGFP-C1-RBPMS 的酶切鉴定 1. DNA 标志物 （DL-2000） ； 2. pEGFP-C1 + Xho + EcoR； 3. pEGFP-C1-RBPMS + Xho + EcoR 2. 4 RBPMS 蛋白在细胞内的定位 将重组质粒 pEGFP-C1-RBPMS 转染 ZR75-1 细胞。激光 共聚焦荧光显微镜观察发现 （图4） ， 转染了重组质粒 pEGFP- C1-RBPMS 的细胞中的荧光分布于胞质中， 在 40% 50% 的 细胞中 RBPMS
22、呈聚集状分布。而转染空载体 pEGFP-C1 的 细胞中荧光分布于整个细胞。 3 讨论 RBPMS 基因是 1996 年在研究 Werner 综合征时首次发 现的， 该基因位于人类染色体 8p11-12 上， 约 230 kb， 已发现 16 个外显子 1。RBPMS 的 N 端有 RNA 结合模序， 该模序在 脊椎动物和昆虫中是保守的， C 端富含 螺旋结构， 该结构 对于 RNA 识别的序列特异性具有重要作用。以前研究表 明， 为了有效地结合 RNA， RNA 结合蛋白经常组合成多蛋白 复合体的形式 4。RBPMS 蛋白的不同剪接体的 N 端高度同 源， C 端具有差异 1。5端邻近的 4
23、 个外显子编码的序列与 果蝇属的 couch potato 蛋白有 67% 的同源性， 与人类剪接体 蛋白 snRNP U1A 有 22% 的同源性 5， 并且含有高度保守的 RNA 结合序列 RNP1 和 RNP2 6。 RBPMS 蛋白虽然与果蝇属的 couch potato 蛋白有很高的 同源性， 但是 2 个蛋白可能具有不同的生物学功能。因为果 蝇属的 couch potato 蛋白在周围神经系统的发育中具有重要 图 4 带 EGFP 标签的 RBPMS 在 ZR75-1 细胞中的表达 A. 转染重组质粒 pEGFP-C1-RBPMS； B. 转染空载体 pEGFP-C1； 1. pE
24、GFP-C1-RBPMS； 2， 5. DAPI 染色的细胞核； 3. 1 和 2 的合并 图； 4. pEGFP-C1； 6. 4 和 5 的合并图 作用， 而在人脑中通过 Northern 杂交试验显示了一个很弱的 RBPMS 探针杂交带 1。 许多转录因子可以与 RBPMS 基因的启动子区域结合， 从而调节基因的转录活性 1。为了有效地与 RNA 结合， RNA 结合蛋白通常需要组装成多蛋白复合体 4。免疫沉淀 实验表明， 细胞中 RBPMS 蛋白以多拷贝形式存在 4。这种 蛋白质间的相互作用几乎是所有生物学过程都必需的重要 的生理过程， 已成为国内外生命科学研究的热点之一。 目前关于
25、RBPMS 的报道比较少， RBPMS 蛋白的生物学 功能仍有待阐明。为了进一步研究 RBPMS 的功能， 我们利 用 Hind和 Xba位点成功构建了 RBPMS 基因的真核表达 载体， 但在鉴定重组质粒的过程中， PCR 鉴定为阳性克隆， 而 用 Hind和 Xba双酶切不能获得插入的目的片段。据文 献报道， 当 Xba位点 （5-TCTAGA-3） 的 3端存在 TC 时， 即 变成 5-TCTAGATC-3时， 在大肠杆菌中 Xba常发生甲基 化， 导致不能酶切。在本实验中， 该 TC 序列是由于 Xba位 点紧靠 RBPMS 基因的终止密码 TGA （其互补序列为5-TCA- 3）
26、造成的。序列分析结果表明 （数据略） ， RBPMS 重组质粒 中含有 Xba和 Hind位点。由于 RBPMS 重组质粒可被 Hind 切成一条线性条带 （数据略） ， 而Xba则不能， 更进 （下转第 112 页） 801军事医学科学院院刊 2006 年 4 月 第 30 卷 第 2 期 血现象发生， 电镜下观察到微血管受到破坏， 毛细血管基板 不连续， 这说明 4 链在基底膜新生毛细血管的形成和结构 的完整性方面有重要作用 6。在脑部肿瘤如多形性成神经 胶质细胞瘤、 星形细胞瘤、 脑膜瘤， 4 链过表达 （overexpres- sion） 可能成为神经胶质瘤的诊断指标之一 7。 200
27、0 年， Talts 等 8在哺乳细胞中表达了层黏连蛋白 4 链 LG1-3 和 LG4-5 组件， 结果 LG1-3 和 LG4-5 组件折叠成球 状， 二者都可以和肝素、 硫酯类、 fibulin-1 及 fibulin-2 结合， 但 是和层黏连蛋白 2 链的 G 结构域相比， 促进细胞黏附和 - 肌营养不良蛋白聚糖结合的能力较弱， 重组层黏连蛋白 4 链 LG1-3 的上述活性比 LG4-5 要强。2002 年， Okazaki 等 9 利用重组的层黏连蛋白 4 链 G 结构域和合成肽研究了 G 结构域的活性位点， 发现重组全长 G 结构域可以促进细胞的 黏附， 但是这种细胞黏附活性被
28、肝素完全抑制， 而 EDTA 可 以部分抑制该活性， 利用合成肽发现 20 个活性肽段和该活 性有关， 其中 4 个肽段 LAIKNDNLVYVY、 DVISLYNFKHIY、 TLFLAHGRLVFM 和 LVFMFNVGHKKL 与肝素结合。 层黏连蛋白是糖蛋白， 糖基化对于层黏连蛋白的功能是必 需的， 哺乳动物细胞中的表达量较低， 毕赤酵母表达系统因其表 达量高、 翻译后对产物的加工和修饰过程与高等真核细胞相似， 兼有大肠杆菌表达系统中的若干优点， 如繁殖速度快、 能高密度 发酵等， 近年来受到研究者的青睐。为了解 LG1-3 组件的晶体 结构和更多生物学功能位点， 本实验获得了 LG1
29、-3 cDNA， 将 LG1-3 组件序列中的 Sac酶切位点进行了突变， 然后整合到毕 赤酵母染色体上， 在甲醇诱导下表达了 LG1-3 组件蛋白， 酵母表 达宿主菌的获得为后续工作奠定了基础。 参考文献 1 Anon. A manual of methods for expression of recombinant proteins using pPICZ and pPICZ in Pichia pastoris P . Invitrogen Corpo- ration （Catalog no K1740 -01） . 2 张艳宇， 张玉静， 朱世成， 等. 人层黏连蛋白 4 链 LG2
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34、， 277 （40） ： 37070 -37078. （本文编辑 孙承媛） （上接第 108 页） 一步说明 Xba位点存在甲基化修饰。对表达蛋白细胞内 定位的研究表明， RBPMS 蛋白主要定位在胞浆中， 在 40% 50%细胞中 RBPMS 呈聚集状分布， 而转染空载体质粒的细 胞中荧光信号弥散分布于整个细胞内。RBPMS 定位在胞 质， 可能会调节翻译过程和 mRNA 的稳定性。本研究为进 一步了解 RBPMS 基因的功能奠定了基础。 参考文献 1 Shimamoto A，Kitao S，Ichikawa K，et al. A unique human gene that spans o
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