内皮素1及其受体拮抗剂对HSCT6肝星状细胞收缩作用机制的体外研究.pdf

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1、实验研究 内皮素- 1及其受体拮抗剂对H S C - T 6 肝星状细胞收缩作用机制的体外研究 张军 张忠涛 王宇 王萍 唐淑珍 周延忠 李建设 【 摘要】 目的 研究内皮素及其受体拮抗剂对肝星状细胞(h e p a t i cs t e l l a t ec e l l,H S C) 的收缩作 用及其作用的受体机制。方法 采用胶原晶格法(c o l l a g e nl a t t i c e) 观察E T - 1及其受体拮抗剂B Q - 1 2 3、B Q - 7 8 8和选择性E T B受体协同剂I R L - 1 6 2 0对肝星状细胞收缩的影响。结果 与空白对照组 相比,E T -

2、1组和E T - 1+B Q - 7 8 8组收缩面积百分比显著降低(0 . 5 0 40 . 0 8 2v s0 . 8 4 80 . 0 3 8,P0 . 0 5) ; 与空白对照组相比,E T - 11 0n m o l/L+I R L - 1 6 2 01m o l/L组收缩面积 百分比显 著 降 低 (0 . 4 2 90 . 1 1 7v s0 . 7 5 80 . 0 3 6,P0 . 0 5) 。结论 内皮素- 1引起 肝星状细胞的收缩是由内皮素受体A介导的, 选择性内皮素受体A拮抗剂B Q - 1 2 3可以抑制内皮素- 1介导的肝星状细胞的收缩, 而内皮素B受体拮抗剂则无此

3、作用; 选择性内皮素B受体协同剂I R L - 1 6 2 0能抑制较低浓度的E T - 1引起的肝星状细胞的收缩。 【 关键词】 肝星状细胞; 内皮素- 1; 胶原晶格; 收缩性; 内皮素A受体; 内皮素B受体 E f f e c t so fe n d o t h e l i n - 1a n di t sa n t a g o n i s t so nc o n t r a c t i l i t yo fH S C - T 6c e l l si nv i t r oZHANG J u n, ZHANGZ h o n g t a o,WANGY u,e t a l.D e p a r

4、t m e n t o fG e n e r a lS u r g e r y,B e i j i n gF r i e n d s h i pH o s p i - t a l,C a p i t a lU n i v e r s i t yo fM e d i c a lS c i e n c e s,B e i j i n g1 0 0 0 5 0,P.R.C h i n a 【A b s t r a c t】 O b j e c t i v e T os t u d yt h ee f f e c t so fe n d o t h e l i na n di t sa n t a g

5、 o n i s t so nc o n t r a c t i l i t yo f H S C - T 6c e l l s .M e t h o d s C o l l a g e nl a t t i c ew a su s e dt oi n v e s t i g a t et h ee f f e c t so fe n d o t h e l i n - 1(E T - 1) , s e l e c t i v eE TAr e c e p t o ra n t a g o n i s tB Q - 1 2 3,s e l e c t i v eE T Br e c e p t

6、 o ra n t a g o n i s tB Q - 7 8 8a n ds e l e c t i v e E T Br e c e p t o rs y n e r g i s t I R L - 1 6 2 0o nc o n t r a c t i l i t yo fh e p a t i cs t e l l a t ec e l l s . R e s u l t s T h ep e r c e n t a g eo f c o n t r a c t i n ga r e a i nE T - 1g r o u pa n dE T - 1+B Q - 7 8 8g r o

7、 u pw a so b v i o u s l yl o w e rt h a nt h a ti nc o n t r o l g r o u pa n dE T - 1+B Q - 1 2 3g r o u p(P0 . 0 5). I R - 1 6 2 0c o u l d i n h i b i t t h e c o n t r a c t i l - i t y i n d u c e db y1 0 0 p M E T - 1.H o w e v e r,t h i sa c t i o nw a sn o t o b v i o u s i nE T - 11 0 n Mg

8、 r o u p . C o n c l u s i o n s B Q - 1 2 3c a ns i g n i f i c a n t l yi n h i b i tH S Cc o n t r a c t i l i t yi n d u c eb ye n d o t h e l i n .B u tB Q - 7 8 8h a sn os u c h e f f e c t . E TAr e c e p t o rc a n i n d u c e t h ec o n t r a c t i l i t yo fH S C. I R L - 1 6 2 0c a ni n h

9、 i b i tH S Cc o n t r a c t i l i t yi n - d u c e db y l o wl e v e l o fE T - 1. 【K e yw o r d s】 H e p a t i cs t e l l a t ec e l l; E n d o t h e l i n - 1; C o l l a g e nl a t t i c e; C o n t r a c t i l i t y; E n d o - t h e l i nt y p eAr e c e p t o r; E n d o t h e l i nt y p eBr e c e

10、 p t o r 基金项目: 北京市重点学科项目资助(1 9 9 8卫科扶字1 1号) 作者单位:1 0 0 0 5 0 北京市, 首都医科大学附属北京友谊医院普外科 ( 张军、 张忠涛、 王宇、 周延忠、 李建设) , 病生理实验室( 王萍、 唐淑珍) 肝星状细胞位于肝窦D i s s e间隙内, 肝损伤时 H S C发生活化, 活化的H S C具有收缩性, 它通过对 肝窦的收缩调节肝窦血流, 使肝窦的血流阻力增加, 造成门静脉压力升高。H S C的活化在肝硬化门静 脉高压症的形成过程中起中心环节作用 1,2, 肝硬 化和门静脉高压时, 血浆和肝组织中内皮素的含量 明显升高 3, 内皮素是迄

11、今发现的多种缩血管物质 中作用最强大的一种, 肝星状细胞是E T在肝内作 用的主要靶细胞 4。本研究目的在于通过胶原晶格 法来研究内皮素对肝星状细胞的收缩作用及其作用 机制, 进一步了解肝硬化门静脉高压的发病机制。 材料与方法 1.实验材料: (1) 肝星状细胞H S C - T 6细胞系 848 中华肝胆外科杂志2 0 0 5年1 2月第1 1卷第1 2期 C h i nJH e p a t o b i l i a r yS u r g,D e c2 0 0 5,V o l . 1 1,N o . 1 2 由北京友谊医院肝病中心惠赠。内皮素- 1( e n d o - t h e l i n

12、 - 1) 、 选择性E TA受体拮抗剂B Q - 1 2 3、 选择性 E T B受体拮抗剂B Q - 7 8 8、 选择性E T B受体协同剂 I R L - 1 6 2 0均购自美国S i g m a公司。DMEM( 高糖 型) 、 胎牛血清为美国G I B C O公司产品。( 2) 胶原 溶液: 3 . 5%(w/v) 鼠尾胶 原,0. 1%醋 酸, 参 照 文 献 5的方法自行制备, 4冰箱保存待用。 2.实验方法: (1) 细胞培养和胶原晶格的制作: 基本方法参照文献 6 。培养皿或六孔培养板中每 皿加入8 0 0l鼠尾胶原溶液, 随之点加0 . 1m o l/L N a OH溶液

13、调整溶液 p H 值至7 . 2, 再加入1 5 0l 1 0P B S溶液, 摇匀, 最后加入5 5 0m l冰冷的无菌 无离子水, 胶原终浓度为1 . 8 7m g/m l。将平皿置入 温箱, 3 7,1h使呈凝胶状, 制备成胶原晶格。将 肝星状细胞H S C - T 60 . 51 0 6 m l细胞数1m l加入 平皿中, 孵育过夜使细胞贴附于凝胶表面。次日, 更 换细胞 培 养 液 为 无 血 清DMEM, 并 保 持 无 血 清 DMEM环境4h, 细胞以无血清DMEM洗4次。 然后加入相关药物进行干预试验, 将胶原晶格重新 放回培养箱, 4 8h后观察实验结果, 用数码相机拍 照

14、并储存后, 计算机图像处理计算凝胶直径和面积, 进行统计学分析。凝胶面积的计算采用如下公式: 凝胶 面 积=( 图 像 凝 胶 直 径/图 像 平 皿 直 径 3 5 mm/2) 23 . 1 4。( 2) 实验分组: 第一组: 内皮素及 其拮抗剂实验: 制备胶原晶格, 分组方式如下:空 白对照, B Q - 1 2 31m o l/L, B Q - 7 8 81m o l/ L, E T - 11 0n m o l/L,V E T - 11 0n m o l/L+B Q - 1 2 3 1m o l/L, E T - 1 1 0 n m o l/L + B Q - 7 8 8 1m o l/

15、L。方法同前述, 制备星状细胞胶原晶格 后, 依次加入上述试剂, 4 8 h后观察并记录实验结 果, 重复进行三次实验。第二组: I R L - 1 6 2 0实验: 方 法同前, 分组方式如下:空白对照, E T - 11 0 0 p m o l /L, E T - 11 0n m o l/L,I R L - 1 6 2 01m o l/ L,V E T - 11 0n m o l/L+I R L - 1 6 2 01m o l/L, E T - 11 0 0p m o l/L+ I R L - 1 6 2 01m o l/L。 3.统计学分析: 数据结果以均数标准差(-x s) 来表示,

16、多组间的比较采用随机单位组资料设计 的方差分析, 统计分析及图表制作采用统计分析软 件S P S S 6 . 0版。 结 果 1.内皮素及其拮抗剂实验: 实验结果参见表1。 从表1可以看出: 与空白对照组相比,E T - 1组和 E T - 1+B Q - 7 8 8组收缩面积百分比显著降低(0 . 5 0 4 0 . 0 8 2v s0 . 8 4 80 . 0 3 8,P0 . 0 5;0 . 7 2 40 . 0 6 1v s0 . 7 5 8 0 . 0 3 6,P0 . 0 5) 。结果表明: 选择性E T B受体协 同剂I R L - 1 6 2 0对肝星状细胞的胶原晶格无收缩作

17、用; 加入I R L - 1 6 2 0能抑制1 0 0p m o l/L浓度的E T - 1 引起的肝星状细胞的收缩, 而在1 0n m o l/LE T - 1 组, 则无明显的抑制作用。 表1 受体机制实验结果( 凝胶面积百分比%,- xs,n=3) 空白对照 B Q - 1 2 3组B Q - 7 8 8组E T - 1E T - 1+B Q 1 2 3E T - 1+B Q 7 8 8 0. 8 4 80. 0 3 80. 8 2 90. 0 4 90. 8 1 90. 0 1 70. 5 0 40. 0 8 2*0. 8 6 50. 0 2 50. 4 9 80. 1 0 2* 注

18、:*与空白对照组比较P0 . 0 5, 其余各组间无统计学差异 表2 I R L 1 6 2 0受体机制实验结果( 凝胶面积百分比%,- xs,n=3) 空白对照 E T - 11 0 0p m o l/LE T - 1n m o l/LI R L - 1 6 2 0m o l/L E T - 11 0n m o l/L+ I R L - 1 6 2 0 1m o l/L E T - 11 0 0p m o l/L+ I R L - 1 6 2 0 1m o l/L 0. 7 5 80. 0 3 60. 5 3 00. 1 0 8*0. 3 7 30. 0 6 2*0. 8 4 20. 0 6

19、 2#0. 4 2 90. 1 1 7*0. 7 2 40. 0 6 1# 注:*与空白对照组相比P0 . 0 5,E T - 11 0 0p m o l/L+I R L - 1 6 2 01m o l/L组与E T - 11 0 0p m o l/L相比 P=0 . 0 9 1 948 中华肝胆外科杂志2 0 0 5年1 2月第1 1卷第1 2期 C h i nJH e p a t o b i l i a r yS u r g,D e c2 0 0 5,V o l . 1 1,N o . 1 2 讨 论 H S C的活化在肝硬化门静脉高压症的形成过 程中起中心环节作用, 而H S C的收缩对

20、肝窦阻力 的调节作用尤其引人注目。在肝脏的血管结构中, 肝窦是最狭窄的区域, 也是血管阻力最高的区域。 因此, 肝窦作为调节肝脏血流的重要区域, 其灌流的 失调将导致肝脏损伤的加重, 促进肝硬化门静脉高 压的发展 7。在肝硬化和门静脉高压时, 血浆和肝 组织中内皮素的含量明显升高 3。E T导致肝窦收 缩和阻力升高的变化与E T引起H S C的收缩有关, 内皮素是引起H S C收缩的最显著的物质 8。 关于内皮素引起H S C收缩的机制, 目前研究 认为内皮素与其同族的受体结合引起G蛋白双受 体介导的磷酸酯C - ( P L C - ) 的活化, 从而导致磷脂 酰肌醇- 4, 5 -二磷酸(P

21、 I P 2) 的分解和细胞内信使1, 4,5 -三磷酸肌醇(I P 3) 和甘油二酯的释放,I P 3 -介导 的细胞浆内质网释放储存的钙离子, 导致肌球蛋白 轻链激酶活化从而引起细胞收缩 2。但是, 对于 E T - 1介导H S C收缩效应的受体种类尚有不同的报 道,R o c k e y 9的研究认为 E T - 1对H S C的收缩效应 是由E T B受体介导。最近,R e i n e h r等 1 0通过对大 鼠H S C的体外研究表明E T - 1通过刺激H S C的 E TA受体来介导H S C的收缩, 而应用E T B受体协 同剂S a r a f o t o x i nS

22、6 c刺激E T B受体则抑制H S C 的收缩。 本研 究 结 果 表 明, 选 择 性E TA受 体 拮 抗 剂 B Q - 1 2 3能显著抑制E T - 1引起的H S C的收缩, 而 选择性E T B受体拮抗剂则对此无明显作用。说明 E T - 1引起H S C的收缩是通过内皮素A受体介导 的。同时, 应用选择性E T B受体协同剂I R L - 1 6 2 0 作用于H S C不但不能引起其收缩, 而且还能够抑 制较低浓度E T - 1( p g级) 引起的H S C的收缩, 其机 制可能是I R L - 1 6 2 0刺激E T B受体后引起细胞内 c AM P的升高,c AM

23、P通过作用于L型钙离子通道来 降低细胞内钙离子浓度, 从而抑制H S C的收缩 2。 依据本研究结果, 我们可以认为对于应用内皮 素受体拮抗剂治疗肝硬化门静脉高压症来讲, 单独 应用内皮素A受体拮抗剂( 如B Q - 1 2 3) , 可抑制升 高的E T - 1( 病理状态下) 介导的H S C的收缩, 从而 可以降低门静脉的压力, 该结论支持了G o t t a r d i的 研究结果: 即门静脉高压大鼠模型长期口服选择性 E TA受体拮抗剂能明显降低门静脉的压力, 而应用 E T B受体拮抗剂则增加了门静脉的压力 1 1。本研 究从肝星状细胞水平得出的结论, 是对肝硬化门静 脉高压症发病

24、机制更进一步的了解, 希望能有利于 该病的临床治疗。 参 考 文 献 1 A h e r nM,H a l lP,H a l l i d a yJ,e ta l .H e p a t i cs t e l l a t ec e l ln o - m e n c l a t u r e .H e p a t o l o g y,1 9 9 6,2 3:1 9 3. 2 R e y n a e r tH,T h o m p s o nMG,T h o m a sT,e t a l .H e p a t i c s t e l l a t e c e l l s:r o l e i nm i c r

25、 o c i r c u l a t i o na n dp a t h o p h y s i o l o g yo fp o r t a lh y - p e r t e n s i o n. G u t,2 0 0 2,5 0:5 7 1 - 5 8 1. 3曲维恺, 张忠涛, 鲍晓力, 等.内皮素在肝外型门静脉高压发病机 制中的作用.中华肝胆外科杂志,2 0 0 1,6:3 6 3 - 3 6 7. 4 R o c k e yD C,F o u a s s i e rL,C h u n gJ J,e ta l .C e l l u l a r l o c a l i z a t i o

26、 n o fe n d o t h e l i n - 1a n d i n c r e a s ep r o d u c t i o n i n l i v e r i n j u r y i nt h e r a t: p o t e n t i a l f o ra u t o c r i n ea n dp a r a c r i n ee f f e c to ns t e l l a t ec e l l .H e p - a t o l o g y,1 9 9 8,2 7:4 7 2 - 4 8 0. 5鄂征, 主编.组织培养和分子细胞学技术.北京: 北京出版社, 2 0 0 1

27、. 1 4 0 - 1 4 1. 6 R e y n a e r tH,V a e y e n sF,Q i nH,e t a l . S o m a t o s t a t i ns u p p r e s s e s e n d o t h e l i n - 1 - i n d u c e dr a th e p a t i c s t e l l a t e c e l l c o n t r a c t i o nv i as o m - a t o s t a t i nr e c e p t o rs u b t y p el .G a s t r o e n t e r o l

28、 o g y,2 0 0 1,1 2 1:9 1 5 - 9 3 0. 7 N a k a t aK,L e o n g G F,B r a u e rRW.D i r e c t m e a s u r e m e n t so f b l o o dp r e s s u r ei n m i n u t ev e s s e l so ft h el i v e r .Am JP h y s i o l, 1 9 6 0,1 9 9:1 1 8 1 - 1 1 8 8. 8 R o c k e yD C. H e p a t i cb l o o d f l o wr e g u l a

29、 t i o nb ys t e l l a t e c e l l i nn o r - m a l a n d i n j u r e d l i v e r . S e m i nL i v e rD i s,2 0 0 1,2 1:3 3 7 - 3 4 9. 9 R o c k e yD C.C h a r a c t e r i z a t i o no fe n d o t h e l i nr e c e p t o r sm e d i a t i n g r a th e p a t i cs t e l l a t ec e l l c o n t r a c t i o

30、 n. B i o c h e mB i o p h y sR e sC o m - m u n,1 9 9 5,2 0 7:7 2 5 - 7 3 1. 1 0 R e i n e h rR,F i s c h e rR,H a u s s i n g e rD. R e g u l a t i o no f e n d o t h e l i n - Ar e c e p t o rs e n s i t i v i t yb yc y c l i ca d e n o s i n em o n o p h o s p h a t ei nr a t h e p a t i cs t e

31、l l a t ec e l l s .H e p a t o l o g y,2 0 0 2,3 6:8 6 1 - 8 7 3. 1 1 G o t t a r d iA D,S h a wS,S a g e s s e rH,e t a l . T y p eA,b u t n o t t y p eB, e n d o t h e l i nr e c e p t o r a n t a g o n i s t s i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e p o r t a l p r e s s u r e i n p o r t a l h y p e r t e n s i v e r a t s . JH e p a t o l,2 0 0 0,3 3:7 3 3 - 7 3 7 . ( 收稿日期:2 0 0 4 - 0 8 - 2 6 修回:2 0 0 4 - 1 2 - 1 4) 058 中华肝胆外科杂志2 0 0 5年1 2月第1 1卷第1 2期 C h i nJH e p a t o b i l i a r yS u r g,D e c2 0 0 5,V o l . 1 1,N o . 1 2