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1、文章编号：1 0 0 1 5 9 4 9 ( 2 0 0 9 ) 0 2 0 1 3 3 0 3实验研究 兔胸段脊髓损伤后不同组穴的针刺血清 对体外脊髓神经元生长的影响 宋秀娟1 ，陈唏2 ，汪洋3 ，孙双历1 【摘要】目的观察脊髓损伤后针刺不同组穴的血清对体外神经元培养的影响，找出最佳治疗穴组。方法 用改良的A L L E N S 致伤法，造成T 。脊髓不完全损伤模型，然后按不同组穴( A ，、A ：、A 3 ) 进行电针治疗，于电针治 疗第1 3 天取针刺m 清，同时设立造模组( c ) 、空白组( D ) 、正常组( E ) 、胎牛血清组( F ) 作为实验对照。以各组血清 制备培养液，
2、对胎兔的脊髓神经元细胞进行培养，7 2 h 观察单细胞树突的长度。结果单细胞核实的长度，A 。组 ( 1 4 5 3 9 6 5 2 0 ) ，如组( 9 3 7 2 5 2 0 6 ) ，A 3 组( 1 0 0 9 3 5 8 1 0 ) 。C 组( 6 4 6 5 4 7 0 1 ) ，D 组( 7 6 4 34 - 5 0 3 2 ) ，E 组( 7 9 3 7 4 3 9 4 ) ，F 组( 9 9 7 84 - 5 6 8 5 ) 。结论电针3 组穴对胸段脊髓损伤后的血清均有积极影响，督脉穴组 对胸段脊髓损伤后血清的影响最为显著。 关键词】兔；针刺；血清；脊髓损伤；神经元 【中图分
3、类号 R 一3 3 2 文献标识码】A T h ee f f e c t so fa c u p u n c t u r ea td i f f e r e n tg r o u p so fa c u p o i n t sO i lc u l t u r e sn e u r o n s8 f t e rr a b b i ts p i n ec o r di n j u r y S O N G 瓜“- j u a n 。e ta 1 ( T r a d i t i o n a lC h i n e s eM e d i c i n eH o s p i t a lo fY i n e h
4、 u a n ，Y i n e h u a n7 5 0 0 0 1 ，C h i n a ) A b s t r a c t O b j e c t i v e T oo b s e r v et h ee f f e c t so fa c u p u n c t u r ea td i f f e r e n tg r o u p so fa c u p o i n t so nc u l t u r e so fn e u r o n s M e t h o d s T h ei n c o m p l e t e l yp a r a l y s i sm o d e lo fr a
5、 b b i t sw i t hs p i n a lc o r di n j u r yW a gm a d eb yt h em o d i f i e dA l l e n bm e t h o da n ds e p a r a t e l yc u r e dw i t he - l e c t r o a c u p u n c t u r ea td i f f e r e n tg r o u p so fa e u p o i n t s ( A l ，A 2 ，A 3 ) O nt h e1 3 md a ya f t e re l e c t r o a c u p u
6、 n c t u r e ，s e r u n lw a sc o l l e c t e d a n du s e di nc u l t u r e so fn e u r o n so ff e t a lr a b b i t sw i t ht h ec o n t r o lg r o u p s ( C ) ，t h eb l a n kc o n t r o lg r o u p s ( D ) ，n o r m a lg r o u p ( E ) a n df e t a l b o v i n es e m m ( F ) T h el e n g t h so fp r
7、 o t u b e r a n c e so fn e u r o n sw e r ed e t e c t e da f t e r7 2 h R e s u l t sT h el e n g t h so fp r o t u b e r a n c e so fl t 尬l l r o n g f r o mt h r e eg r o u p so fe l e c t r o a c u p u n c t u r e ( A I ：1 4 5 3 9 6 5 2 0 ；A 2 ：9 3 7 2 5 2 0 6 ；A 3 ：1 0 0 9 34 - 5 8 1 0 ) s h
8、o w e ds t a t i s t i cs i s n m - c a n c ec o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o lg r o u p sa n df e t a lb o v i n es e r u m ( C ：6 4 6 5 4 7 0 1 ；F ：9 9 7 8 5 6 8 5 ) ，w h i l er i os t a t i s t i cs i g n i f i c a n c e c o m p a r e dw i t ht h eb l a n kc o n t r o lg r o u p sa n dn o r
9、 m a lg r o u p ( D ：7 6 4 3 5 0 3 2 ；E ：7 9 3 7 4 3 9 4 ) C o n c l u s i o n I ts h o w st h a ta l lt h e t h r e eg r o u p so fa c u p o i n t sc u r e dw i t he l e c t r o a c u p u n c t u r eh a sa c t i v ee f f e c t so ns 唧mo fs p i n a lc o r di n j u r y ，e s p e c i a l l y1 ) u m a i
10、a c u p o i n t s K e yw o r d s R a b b i t ；A c u p u n c t u r e ；S e r u m ；S p 流越c o r di ，分町；N e u r n o s 目前，在脊髓损伤( s p i n a lc o r di n j u r y ，S C I ) 的实 验研究领域中，对针灸的体外效应学的研究越来越 多，针刺血清方面的研究更为深入，但是对不同组穴 针刺血清对体外神经元生长的影响研究较少。本 研究采用临床常用的三种取穴方法，观察电针胸段 损伤后不同组穴的血清对体外神经元生长的不同影 响，以找出各组穴的治疗特点，为临床更有针
11、对性的 选穴提供实验依据。 1 材料与方法 1 1 实验动物：健康新西兰大白兔3 6 只，6 7 个月 龄，雌雄不限，体重2 0 0 2 6 0 k g ，平均2 3 l k g 。将 动物随机分成6 组，每组6 只。大椎、命门组( A 。， 穴取大椎、命门) ；瘫痪肢体局部取穴组( A ：，穴取 基金项目】国家中医药管理局重点学科建设项目，上海卫生局资助 ( 2 0 0 2 2 0 0 5 A ) 作者单位】1 银川市中医医院，宁夏银川7 5 0 0 0 1 2 复巨大学医科大学解剖组胚实验室，上海2 0 0 0 3 2 3 上海天山中医院，上海2 0 0 0 5 l 足三里、阳陵泉) ；背
12、俞穴和三阴交组( A ，穴取心 俞、肝俞、脾俞、肾俞、三阴交) ；模型对照组( C ，损 伤脊髓但不电针治疗) ；空白对照组( D ，只打开椎 板不损伤) ；正常组( E ) 。动物由上海中医药大学 实验动物中心提供。怀孕2 8 d 的新西兰大白兔1 只，由上海医科大学实验动物中心提供。 1 2 主要仪器：8 0 2 离心沉淀机( 上海手术器械 厂) ，低温冰箱( S A N Y O ，日本) ，C O ：培养箱( H e r a e U S ，德国) ，倒置相差显微镜( O l y m p u sC K 一2 ，日本) ， 超净工作台( 上海净化设备厂) ，L e i c aD M I 图象
13、分析 系统。 1 3 主要试剂：( 1 ) 胎牛血清( 杭州四季青生物工程 材料研究所) ；( 2 ) 胰蛋白酶( T r y p s i n 美国进口，上海 试剂采购供应站分装厂分装) ；( 3 ) D H a n k 液( 上海 医科大学解剖组胚实验室自配) ；( 4 ) N e u r o b a s A L + 神经元培养液( G i b c o 公司，美国) ；( 5 ) 消毒过滤后的 各实验组血清( A l 组；A 2 组；A 3 组；c 组；D 组；E 组； 万方数据 F 缀) 。 1 4 方法 1 4 1 实验组搬清制备：以3 戊巴比妥钠耳缘静 脉注射( 3 0 m g k g
14、 ) 对动物进行麻醉，常规消毒后取 背正中切口，切除相应椎板，暴露I 。，脊髓，采用改良 的A I 志E N S 锤击法，给予1 2 9 5 e m 的打击；缝合包 扎籍按改良T a r l o v s 评分法迸行评定，确定模越成 功后1 0 m i n 电针备组按不同取穴分别进行针刺治 疗，电针均采用疏密波l 一3 H z ，以动物针刺局部肌 肉有明显抖动为度；每臣1 次，每次针刺2 0 m i n 。连 针5 d ，铼息l d ，再歼始下1 个疗程。对照缱不予钟 刺，空白对照组只打开椎板不损伤，观察时间点同电 针组。正常兔予麻醉前进行心脏采血，离心 ( 3 5 0 0 r p m ，1 0
15、 m i n ) ，共得血清l O m l ，一4 0 冷藏，先 菱常维盘清；损伤第1 3 天按照圊样方法裁备电针各 组、对照各组及空翻对照组血清，一钧冷藏，所制 备盥清供配制成实验用神经元培养液，胎牛血清配 制成胎牛血清组即F 组。加入到体外培养的脊髓神 经元细胞中进行观察。 l 。4 。2 实验用墙莽液的配制：9 0 神经元培养液 N e u m b a s A L + B “ + 1 0 实验各组血清，配制成实验 组培养液，胎孛壶清缀融购神经元培养渡N e u m b a s A L + B 2 7 + 1 0 胎牛血清配制。 1 4 3 体外脊髓神经元细胞培养：孕兔处死后取胎 兔脊髓，
16、予显微镜下剥去外膜，在D H a n k S 液中剪 碎；以0 1 2 5 的胰酶3 7 演化l O m J n ，加入瘟清终 止消化，静置5 m i n ，吸取细胞悬液。用D H a n k s 液机械吹打未消化组织，静置2 m i n ，吸取上清液，如 此反复歪组织基本消失为止。将收集的细胞悬液离 心( 1 5 0 0 r p m ，5 m i n ) ，夯上清液，用神经元培养液悬浮 缨施，黻l 1 0 6 的细胞密度种植予涂有多聚赖氨酸 的2 4 孔板内，放入3 7 、3 0 C 0 2 培养箱内，4 h 后 观察到各孔均有细胞贴臆；置换入各实验组培养液， 仍放入培养箱内培养7 2 h
17、，应用L e i c aD M I R B 图象分 析系统，i ：Al z m 为单位对实验各缰进褥单缨胞树突 长度的测定。 1 5 统计方法：建立E x c e l 数据库，应用S P S S l l O 统计软件进行单向方熬分析，仪= 0 0 5 。 2 结鬃 譬，损伤组体羚培养神经元生长情况见图1 。 突起缨胞数量 圈1T ，；损伤缝巍渍体多 神经嚣生长情凝 将所测得神经元突起长度进行单向方差分析多照维与电锌各组、杰常组神经元树突长度无统计学 重比较，结果见表l 。意义。 裹1T - - 损伤组体外培养神经冗生长情况的3 讨论 比较露s ，岬l 3 1 钳刺血清体外效应学方法的建藏：目前
18、对于针 缝剃数燕 霉s Al组831 4 5 。3 9 6 5 。2 0 国 如组 8 59 3 7 2 5 2 0 6 A 3 组8 7l o o 9 3 5 8 1 0 C 组 4 7 6 4 6 5 4 7 0 1 圆 D 缌 8 7 7 6 ，4 3 5 0 3 2 嚣缍1 2 3衿。3 7 4 3 。9 4 茎缀! 堡2 2 ：2 墨圭堑：墅竺 滋：与所有组比较，F ；1 8 3 6 2 ，P O 0 5 ；D 组与A l 、F 组比较，P O 0 5 ；与其它组比较，p O 。0 5 ；与A l 、C 、D 、E 缀比较，P O 0 5 。 从表l 可以看出电针三组穴中，督脉穴组对
19、胸 段脊髓损伤后血清的影响最为显著，与空白对照组、 胎牛血清组比较亦有统计学意义。模型对照组尚电 针备组和胎牛盘溥组魄较均有统计学意义；空豳对 灸治疗脊髓损伤的橇瑾研究已经发展裂缨缒、基医、 分子水平，但从免疫、循环、微循环到酶和自由基、蛋 白和其撼因表达及神经营养活性物质的研究，血清 都作为一个传输介质在其中发挥着重要的作用口。 2 0 世纪8 0 年代，建立了针灸血清的体外效应学方 法。该方法是指通过销备针灸处理嚣的动物盘清终 为效应物质，加入到体外培养的细胞、组织、器官的 培养液中，通过它们功能及形态学的改变，直接观察 针刺作用效应的研究方法。它可以排除各种于扰因 素对在体实验酶影瞧，直
20、接观察针蒯在体外环境审 产生效墩的作用。大鬣的实验已表明，针灸腧穴詹 可引起衄液中某些活性物质含量的变化，从而产生 针灸效应o 。离体实验具有实验条件易控制，可排 除体逡复杂因素于扰，髓进行直接观察，获得准确 万方数据 的实验结果等优点。本实验通过制备针刺处理过的 兔盘清，观察不同组穴电针藤鑫清对体外培养的脊 髓神经元细胞的影响，分析电针不同组穴对脊髓损 伤后血清的影响，从而找出不同组穴对脊髓损伤后 神经功能的不同作用，更直观地分析电针不同组穴 对脊髓损伤艨的择经功能的不同作胄l 。 3 2 电赞对胸段脊髓损伤露血清砖影响：分柝结栗 表明，电针各组对胸段脊髓损伤后血清均有积极影 响，这可能是针
21、刺刺激了某种对神经生长有促进作 用的因子，使其功能活跃或分泌量增加，从丽对神经 系统存在修复终焉p 。已有研究提示，“针灸逮涛” 中不仅有若干禽量或活性发生改变的活性物质，可 能还存在着某些性质和结构未明的蛋白质哺J 。这些 鬣白质对体外培养的脊髓神经元有积极的作用，从 薅表魄针刺黠脊髓损伤后搬清有积极的影响。曩前 对予电针督脉穴组为主治疗脊髓损伤的梳理已经进 行了深入的研究，大量的研究证明电针督脉穴对脊 髓损伤后神缀递质、多种酶类、基因表达和相关蛋 自、檩关因子、离子等都有良性的调节作用一o ；正是 电针督脉穴有如此广泛的作用，其对盎清审活性戎 分产生的积极作用也比较显著。模型对照组与空白
22、对照组、正常组比较没有统计学意义，可能是以下原 因：( 墨) 6 0 9 c f 的打击量造成的损伤，神经系统本身的 功能亦在恢复，。蛊清中的部分因子对捧经豹作 用需要通过斑脑屏障，血脑屏障的屏蔽作用使得因 子的作用有了部分削弱。通过血脑屏障的因子产 生效果需要的时间可能较长，在本实验的2 周时间 内，难以比较模型对照组与空自对照组、正常缀对体 外培养翦脊髓襻经元影嘀的不同。树突数量的 影响。 针刺全m 清是成分复杂的研究样品，为从中分 离和鉴定出与针刺治疗相关的有效成分，必须对针 刺全盘清进行预初处理，有研究采耀凝获过滤屡析 技术根据分子量大小对针刺全血清成分进行了分段 分离，使针刺全m 清
23、成为分子量大于4 5 、1 4 3 k D 至 4 5 k D 和小于1 4 3 k D 三个分子量段哺J 。对针刺全衄 清进行预处理，分离穰鉴定与针刺相关的有效成分 震瞧锌组各组阕是否有差异，还鬻要进一步研究。 本研究表明电针三组穴对胸段脊髓损伤后斑清 均有积极影响，其中督脉穴组电针的影响最为姓著， 为最佳治疗穴组；关于电针三级穴的血清中原有成 分有何变诧，针裁瞧清产生了哪些活性物质，盎漪中 的与针刺有关的有效成分各组间是否有差异，本实 验未做深入研究，还需要进一步探讨。 【参考文献】 【l 】赵荚侠，王黪，豢逡久，等。锌裁蠢潦辩傣终培养瑗曹绥熬数耋 的影响C J 】中圈针灸，2 0 0 7
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26、2 5【责任编辑】物自革 结构式摘要撰写要求 隽了便予遴褥黉际闻的学术交流，本刊论著文章所辩孛英文摘要采用国际通耀的络构式攘要。中文揍要1 0 0 3 0 0 字，英 文揍要1 5 0 - 2 5 0 词，英文攘要与审文接要对照。在荚文攘要凑客翦黉辩英文文遂、俸纛单位( 包瑟郎敢编码) 及终者姓名( 搭 式同前) 。结构式摘要分“目的”、“方法”、“结果”朔“结论”四部分。现将各部分的撰写簧求分述如下。 1 目的( O b j e c t i v e ) ：简要说明研究的目的，说明提出问题的缘由，表明研究的范围肇妇重要性。 2 方法( M e t h o d s ) ：简要说明研究课题的基本设计，使用材料和方法，如何分组对照，研究范围及精确程度，数据是如何取 褥盼，经舞释统计学方法处理。 3 结果( R e s u l t s ) ：篱要嗣酝疆究的主要结果鞠数据，有赞么薪发糯，说瞬其徐值及鼹隈。叙述要县俸、准确，并蔫给黯绩栗 的主要数据及鬣信值、统计学显蓿性检验的确切值。 4 结论( C o n c l u s i o n ，：简要说明经验证、论证取得的正确观点其理论价值或应用价值，是否可推荐或推广等。 万方数据