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1、化合物 G004 在大鼠体内的绝对生物利用度研究 李晓宇1， 王广基1， 巫冠中2， 谢海棠1， 孙建国1， 王 旋1 （中国药科大学 1. 药物代谢动力学重点实验室、 2. 药理学教研室， 江苏 南京 210038） 收稿日期： 2006 -02 -05， 修回日期： 2006 -04 -12 基金项目： 国家高技术研究发展计划 （863 计划） 基金资助项目 （No 2003AA2Z347A） ； 江苏省药物代谢动力学重点实验室资 助项目 （No BM2001201） 作者简介： 李晓宇 （1971 - ） ， 男， 博士生， 研究方向： 药代动力学， Tel： 025-85391089，
2、 E-mai： xyllxb yahoo. com. cn； 王广基 （1953 - ） ， 男， 博士， 教授， 博士生导师， 研究方向： 药代 动 力 学， 通 讯 作 者， Tel： 025-83271544， Fax： 025- 85306750， E-mail： gjwang mailbox. cpu. edu. cn 中国图书分类号： R-332； R 446. 11； R 973. 2； R 977. 15 文献标识码： A 文章编号： 1001 -1978 （2006） 06 -0698 -04 摘要： 目的 建立测定化合物 G004 血浆药物浓度的液相色 谱 - 电喷雾离子
3、- 质谱联用 （LC-ESI-MS） 的分析方法， 探讨 其在大鼠体内的药代动力学和绝对生物利用度研究中的应 用。方法 SD 大鼠 ig 和 iv 化合物 G004， 剂量分别为5. 0 和 2. 5 mgkg -1， 给药后不同时间点取血， 分离血浆， LC-ESI- MS 法测定血浆中化合物 G004 的药物浓度， 用 DAS 软件计 算其药代动力学参数， 求算化合物 G004 在大鼠体内的绝对 生物利用度。结果 化合物 G004 在 0. 02 5. 0 mgL -1浓 度范围内线性关系良好 （r2=0. 9995） ， 样品在血浆中的提取 回收率大于 87%， 批内和批间的 RSD 均
4、小于 15%。大鼠 iv 2. 5 mgkg -1化合物 G004 后主要药代动力学参数 T1 2 、 CLs、 Vd、 AUC（0-）分别为 （1. 91 0. 65）h、（0. 36 0. 22）Lh -1、 （0. 78 0. 36）Lkg -1、 （9. 52 3. 53）mgL -1h-1； 大鼠 ig 5. 0 mgkg -1化合物 G004 后主要药代动力学参数 T max、 Cmax、 T1 2 、 AUC（0 - ）、 MRT（0 -12h）分别为 0. 83 h、（3. 33 0. 80） mgL -1、 （1. 77 0. 21）h、（10. 04 2. 43）mgL -
5、1h-1和 （2. 75 0. 31）h。经过剂量校正后求得的化合物 G004 在大 鼠体内的绝对生物利用度为 52. 69%。结论 该法专属性 强， 灵敏度高， 可用于化合物 G004 的体内定量分析。 关键词： 化合物 G004； 液相色谱 - 电喷雾离子 - 质谱联用法 （LC-ESI-MS） ； 药代动力学； 绝对生物利用度 新型磺酰脲类化合物 G004 是运用拼合原理， 以具有降糖活性的磺酰脲结构为母核连接抗血小板 聚集活性的化学基团设计而成， 分子式为 C22H28 BrN3O5S2， 化学式为 1- 4- 2- （4-溴苯磺酰胺基） 乙 基 苯磺酰 -3- （反-4-甲基环己基）
6、 脲。初步药理学 研究表明化合物 G004 及其同类物 G003 具有较好 的抗实验性血栓形成和降血糖作用 1， 2。但其药代 动力学特征如何？与现有的第 2、 3 代磺酰脲类药物 在药代动力学特性上有何不同还未见报道。本文利 用 LC-MS 联用技术， 建立了简便、 快速、 高灵敏的体 内分析方法， 初步研究了大鼠 ig 和 iv 化合物 G004 后的药代动力学过程并评价了其在大鼠体内的绝对 生物利用度。 1 材料与方法 1. 1 仪器与试剂 LC-MS 2010 型液相色谱 - 质谱 联用系统： 包括双高压泵， 在线真空脱气机，LC-MS solution version 2. 04 S
7、ul-H3 工作站， CTO-10 Avp 柱 温箱， SIL 10 ADvp 自动进样器， Thermo IEC 高速离 心机 （Micromax RF） ， Thermo Savant SPD 1010 离心 浓缩装置， Milli-Q Gradient A10 超纯水器 （Millipore Inc. USA） ， Votex-800 型漩涡混匀器。化合物 G004 及其标准品由中国药科大学新药研究中心提供 （批 号： 050616） ， 内标格列苯脲由中国药品生物制品鉴 定所提供 （批号： 135-9402） 。乙腈为色谱纯， 德国 Merck 公司产品。乙酸乙酯 （特级纯） ， 江苏
8、汉邦科 技有限公司产品，其余试剂均为分析纯。 1. 2 药液的配制 静脉注射用药： 取化合物 G004 适量， 用少量无水乙醇超声溶解后再用生理盐水稀 释成所需浓度， 按 3 mlkg -1剂量由尾静脉给药。 灌胃给药： 取化合物 G004 适量， 用质量分数为 0. 05 的 CMC-Na 将其配成相应浓度的混悬液， 按 10 ml kg -1的剂量灌胃给药。 1. 3 动物 SD 大鼠， 体重 200 250 g， 由中国药科 大学实验动物中心提供， 合格证号： SCXK2002- 0011。 1. 4 色谱条件 色谱柱： Kromasil C18柱， 3. 5 m， 2. 0 mm 15
9、0 mm （Phenomenex，USA） 。流动相为 乙腈 - 水 =70 : 30 （V/ V） ， 水相含体积分数为 0. 05 的冰醋酸， pH 值约为 4. 3， 流速为 0. 2 mlmin -1， 柱温 40。 1. 5 质谱检测条件 检测模式为电喷雾离子化方 式 （ESI） ， 采用选择性离子检测 （SIM） ， 检测离子为 负离子， 化合物 G004： m/ z =558. 00， 格列苯脲： m/ z =492. 25， 雾化气流速 1. 5 Lmin -1， 反吹气流速 2 Lmin -1， 曲形脱溶剂装置 （CDL） 温度： 250， 电压 25 V， 加热块 （Blo
10、ck） 温度 200， 离子源电压 （Probe 896中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2006 Jun； 22 （6） ： 698 701 Fig 1 Chromatograms of compound G004 in rat plasma 1： Glibenclamide（internal standard） ；2：compound G004. A：blank plasma；B：blank plasma spiked with compound G004 and Glibenclamide；C： plasma sample after iv
11、 compound G004 2 min in rats（plasma was diluted by blank rat plasma for 10 times） ；D：plasma sample after ig compound G004 30 min in rats Voltage） 4. 5 kV， 检测电压 1. 35 kV。 1. 6 标准工作液的配制 精密称取适量化合物 G004 标准品， 用乙腈配制成 1. 0 gL -1贮备液， 于 4避光保存备用。临用时用乙腈稀释配制成 0. 1、 0. 25、 0. 5、 1、 2. 5、 5. 0、 10. 0、 25. 0 mgL -
12、1浓度的标 准工作液备用。另精密取格列苯脲适量， 用乙腈溶 解并稀释成 3. 0 mgL -1的溶液备用。 1. 7 大鼠血浆样品的处理方法 自大鼠球后静脉 丛取血约 150 l， 分离血浆， 精取血浆 50 l， 加入格 列苯脲内标液 （3 mgL -1）10 l， 混匀后， 加 0. 2 molL -1的 HCl 10 l， 振荡30 s， 加入乙酸乙酯1. 0 ml， 振荡 3 min， 14 000 rmin -1， 离心 5 min， 取上层 有机相0. 8 ml， 置离心浓缩装置中吹干， 0. 5 ml 乙腈 溶解残渣， 4 下14 000 rmin -1 高速离心 10 min
13、后， 取上清液 10 l 进样， 用样品与内标峰面积比进 行定量分析。 1. 8 实验方案 取 SD 大鼠 12 只， 实验前 12 h 禁 食不禁水， 实验时称重， 其中6 只 iv 2. 5 mgkg -1化 合物 G004， 给药结束后分别在 0、 2、 5、 8、 15、 30、 45 min 和 1、 2、 4、 8、 12 h 时采血分离血浆置于 -20冰 箱中备用。另外 6 只大鼠灌胃 5 mgkg -1化合物 G004 混悬液， 给药结束后分别在 0、 5、 15、 30、 45 min 和 1、 2、 4、 6、 8、 12 h 采血分离血浆置冰箱中备用。 实验时按 “血浆样
14、品处理方法” 项下提取测定。 1. 9 数据分析 将所得的化合物 G004 在大鼠体 内的血药浓度时间数据用 DAS 软件程序处理， 求算 其在大鼠体内的药代动力学参数及其绝对生物利用 度。 2 结果 2. 1 色谱行为 LC-MS 法测定化合物 G004 时， 样 品峰及内标峰的保留时间分别为 4. 34 和 3. 57 min （Fig 1） 。采用选择性离子检测方式专属性强， 灵敏 度高， 血浆中内源性物质不干扰样品和内标的测定。 2. 2 化合物 G004 在大鼠血浆中的标准曲线 取 大鼠空白血浆 40 l， 精密加入不同浓度的化合物 G004 标准工作液10 l， 制备成含化合物 G
15、004 浓度 分别为 0. 02、 0. 05、 0. 1、 0. 2、 0. 5、 1. 0、 2. 0、 5. 0 mg L -1的系列血浆， 按 “血浆样品处理方法” 项下操作 并测定， 分别记录峰面积， 以化合物 G004 峰面积 （As） 对内标峰面积 （Ai） 比值 （f） 为纵坐标， 化合物 G004 浓度为横坐标 （C） 作线性回归， 得标准曲线的 回归方程为 f =0. 5249 C -0. 0064（r2=0. 9995） ， 表 明化合物 G004 在 0. 02 5. 0 mgL -1范围内线性 良好。按上法测得化合物 G004 在大鼠血浆中最低 996中国药理学通报
16、Chinese Pharmacological Bulletin 2006 Jun； 22 （6） 定量浓度为 0. 02 mgL -1 （S/ N 10） 。 2. 3 化合物 G004 在大鼠血浆中的提取回收率 配制含化合物 G004 浓度为 0. 05、 0. 5、 2. 0 mgL -1 的血浆样品， 加入内标液10 l， 按 “血浆样品处理方 法” 项下操作。另配制 0. 05、 0. 5、 2. 0 mgL -1浓度 的纯品溶液， 加入内标， 同法操作， 测定样品峰面积 As和标准品峰面积 Ai， 按下式计算样品提取回收 率： r% = As/ Ai n 100% （n =1. 2
17、5/1） 。结果表明 高、 中、 低 3 种浓度的提取回收率 （n = 5） 分别为： 87. 11% 4. 29%、 91. 61% 5. 37% 和 87. 30% 8. 12%。 2. 4 批内及批间 RSD 测定 配制含化合物 G004 浓度为 0. 05、 0. 5、 2. 0 mgL -1的血浆质控样品， 按 “血浆样品处理方法” 项下操作， 测得高、 中、 低浓度 的批内 RSD 分别为 5. 04%、 10. 48% 和 12. 35% （n =5） ； 连续 5 d 测得高、 中、 低浓度的批间 RSD 分别 为 6. 57%、 5. 26% 和 11. 41%， 结果表明高
18、、 中、 低 3 种浓度的批内及批间 RSD 均小于15%， 符合生物样 品的测定要求。 2. 5 化合物 G004 在大鼠体内的药代动力学参数 及绝对生物利用度测定 6 只大鼠单剂量 iv 2. 5 g L -1的化合物 G004 后， 测定不同时间的血药浓 度， 血药浓度 - 时间曲线见 Fig 2； 另 6 只大鼠单剂 量 ig 5. 0 gL -1的化合物 G004 后， 测定不同时间 的血药浓度， 血药浓度 - 时间曲线见 Fig 3， 将数据 用 DAS 软件进行分析， 求算出化合物 G004 在大鼠 体内 iv 和 ig 给药后的药代动力学参数 （Tab 1， 2） ， 并根据下
19、式计算化合物 G004 在大鼠体内的绝对生 物利用度： Fab （%）= （AUC 口服D 静脉注射） / （AUC 静脉注射D 口服）100%。经计算化合物 G004 在大鼠体内的绝对生物利用度为 52. 69%。 Fig 2 Plasma concentration-time profile after iv 2. 5 mgkg -1 compound G004 in rats （%x s， n =6） Fig 3 Plasma concentration-time profile after ig 5. 0 mgkg -1compound G004 in rats （% x s， n =
20、6） Tab 1 Main pharmacokinetic parameters of compound G004 after iv 2. 5 mgkg -1in rats（% x s， n =6） ParametersValue T1 2 / h 0. 18 0. 15 T1 2 / h 1. 91 0. 65 V/ Lkg -1 0. 78 0. 36 K10/1h -1 2. 28 0. 79 K12/1h -1 5. 32 0. 77 K21/1h -1 1. 43 1. 11 AUC（0 - ）/ mgh -1L-1 9. 52 3. 53 CL/ Lh -1 0. 36 0. 22
21、 Tab 2 Main pharmacokinetic parameters of compound G004 after ig 5. 0 mgkg -1in rats（% x s， n =6） ParametersValue Tmax/ h0. 83 0. 13 Cmax/ mgL -1 3. 33 0. 80 V/ F/ Lkg -1 1. 28 0. 51 T1 2 / h 1. 77 0. 21 AUC（0 - ）/ mgh -1L-1 10. 04 2. 43 MRT（0 -12 h）/ h2. 75 0. 31 3 讨论 糖尿病 （diabetes mellitus， DM） 是一
22、类由于体内 胰岛素相对或绝对不足而导致机体内糖、 蛋白质和 脂类代谢异常的综合症， 它以高血糖为主要症状同 时伴有机体多系统的慢性病变 3。目前随着生活 水平的提高， DM 的发病率在不断上升， 研究和开发 新型的抗 DM 药物也成为当前一项紧迫的任务。磺 酰脲类药物由于其口服吸收好， 不良反应少， 药效作 用强， 用药剂量小的特点而发展迅速。基础和临床 研究表明， 第 2、 3 代的药物如格列苯脲和格列美脲 有很好的降血糖作用 4 6。化合物 G004 为一种新 007中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2006 Jun； 22 （6） 合成的磺
23、酰脲类药物， 药代动力学研究表明静脉注 射 2. 5 mgkg -1该药后， 在大鼠体内的药代动力学 参数 T1 2 为 （1. 91 0. 65）h， Vd为 （0. 78 0. 36）L kg -1， AUC （0 - ）为 （9. 52 3. 53）mgL -1h-1， 表 明该化合物分布容积较小， 预示该药有较高的血浆 蛋白结合率， 与同类药物如格列美脲等高蛋白结合 率的特性相似 7。而口服 5. 0 mgkg-1该药后大 鼠体内的药代动力学参数 Tmax为 0. 83 h， Cmax为 （3. 33 0. 80）mgL -1， T 1 2 为 （1. 77 0. 21）h， AUC
24、（0 - ）为（ 10. 04 2. 43 ） mg L -1 h -1； MRT （0 -12 h）为 （2. 75 0. 31）h。表明该药口服吸收 达峰时间较快，Cmax较格列苯脲等药物要高， 但静注 和口服的 T1 2 均与其他磺酰脲类药物近似 8。上述 结果表明， 化合物 G004 与其他磺酰脲类药物有相 似的药动学特性。绝对生物利用度的结果表明化合 物 G004 口服后可能有部分经过首关消除而遭到破 坏或者不完全吸收， 具体原因有待于实验的进一步 证实。 本文首次对化合物 G004 在大鼠体内的药代动 力学特性进行了研究， 为该药的进一步研究提供了 参考。 参考文献： 1 巫冠中，
25、 洪 钢， 王广基. 化合物 G003 的降血糖作用及其机 制 J . 中国药理学通报， 2004， 20 （9） ： 1026 -30. 2 张文平， 巫冠中， 刘国卿. G004 抗实验性血栓形成作用及机制 J . 中国临床药理学与治疗学， 2005， 10 （2） ： 162 -7. 3 田金英， 张天骄， 叶 菲. 口服降血糖药物概况 J . 临床和实 验医学杂志， 2005， 4 （2） ： 105 -8. 4 Massi-Benedetti M. Glimerpiride in type 2 diabetes mellitus： A re- view of the worldwid
26、e therapeutic experience J .Clin Ther， 2003， 25 （3） ： 799 -816. 5 刘朝晖， 张 璇， 富胜瑛. 新型降血糖药物介绍 J . 海峡药 学， 2005， 17 （2） ： 111 -2. 6 钱德明， 沈洪征， 刘丽群， 等. 格列美脲降血糖作用实验研究 J . 药物分析杂志， 2003， 23 （6） ： 446 -51. 7 周大炜， 王怀峰， 李发美. 格列美脲蛋白结合作用的高效液相 色谱 - 迎头分析法 J . 药学学报， 2005， 40 （1） ： 39 -41. 8 崔华东， 汪文德， 朱禧星， 等. 格列苯脲微粉片剂
27、在 4 名健康中 国男性志愿者中的药代动力学和相对生物利用度 J . 中国 药理学报， 1993， 14 （3） ： 193 -7. Absolute bioavailability of compound G004 in rats LI Xiao-yu1， WANG Guang-ji1， WU Guan-zhong2， XIE Hai-tang1， SUN Jian-guo1， WANG Xuan1 （1. Key Laboratory of Drug Metabolism and Pharmacokinetics， 2. Dept of Pharmacology， China Pharma
28、ceutical University，Nanjing 210038，China） Abstract：Aim To establish an analytical method for determination of compound G004 concentration in plas- ma and investigate its application to pharmacokinetics and absolute bioavailability in rats.Methods 5. 0 and 2. 5 mgkg -1 compound G004 were given via ig
29、 and iv respectively to SD rats. Blood samples were col- lected at various time points after administration. Plas- ma concentration of compound G004 in rats was deter- mined by LC-ESI-MS.Pharmacokinetic parameters were calculated by DAS program and absolute bioavail- ability was also calculated. Res
30、ults The method was linear over the range of 0. 02 5 mg L -1（ r2 = 0. 9995 ） . The recovery of compound G004 in rat plas- ma was more then 87%. Intra- and inter-day preci- sion，expressed as the relative standard deviation （RSD）was less than 15%. After iv compound G004， the main pharmacokinetic param
31、eters T1 2 ，CLs，Vd， AUC （0 - ）were（1. 91 0. 65）h， （0. 36 0. 22）L h -1， （0. 78 0. 36）L kg -1， （9. 52 3. 53）mg L -1h-1 respectively. The major pharmacokinetic pa- rameters Tmax， Cmax， T1 2 ， AUC （0 - ）， MRT（0 -12h）were 0. 83 h，（3. 33 0. 80）mgL -1， （1. 77 0. 21）h， （10. 04 2. 43）mgL -1h-1 and（2. 75 0. 3
32、1） h after ig compound G004. The absolute bioavailability was 52. 69% after correction of dosage. Conclusion The method is sensitive and specific which is applica- ble to pharmacokinetic analysis of compound G004 in rats. Key words： compound G004；high performance liquid chromatography； electrospray ionization mass spectrom- etry；pharmacokinetics；absolute bioavailability 107中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2006 Jun； 22 （6）