体外皮肤移植和TUNEL实验评价猕猴间充质干细胞输注对细胞免疫的影响.pdf

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1、书书书 第 二 军 医 大 学 学 报 A c a dJS e c M i l M e d U n i v 2 0 0 6M a y ;2 7(5) 4 6 5 论 著 体外皮肤移植和T U N E L实验评价猕猴间充质干细胞输注对细胞免疫的影响 黄雅静, 孙琪云, 刘丽辉, 范传波, 胡恺勋, 边 莉, 郭 梅, 艾辉胜 ( 解放军第3 0 7医院血液科, 北京1 0 0 0 3 9) 摘要 目的：通过给猕猴单次无预处理输注猕猴白细胞抗原(R h LA) 不相合供者的骨髓来源的间充质干细胞(MS C s) , 观察 能否抑制供受者之间的免疫反应。方法：无菌抽取MS C s供者猕猴骨髓, 分离

2、单个核细胞, 用2%F C S的DMEM/F 1 2培养液 培养骨髓MS C s, 用流式细胞术检测其表型, 不同培养条件诱导MS C s多向分化以鉴定; 单次无预处理输注MS C s给R h LA不 相合受者, 分别于MS C s输注前及输注后2 0、4 0、6 0d取受者外周血淋巴细胞分别与供者及非供者皮肤体外共培养7 2h, 观察 培养皮肤病理损伤情况, 同时TUNE L法检测培养皮肤石蜡切片中凋亡细胞的比率。结果：输注MS C s后2 0d, 受者淋巴细 胞与供者皮肤呈现减低的免疫反应, 皮肤病理损伤程度较输注前减轻, 凋亡细胞比例由(2 3. 04. 9)%下降到(1 2. 21.

3、9)%; MS C s受者与非供者之间体外皮肤病理片中凋亡细胞比例也由输注前的(2 2. 02. 0)%下降至(1 1. 81. 4)%, 具有显著差异 (P3。公式: 单向S I供受者=R供S受D/R供S供D, 其中R供为供者反 应细胞, S受为受者刺激细胞;S供为供者刺激细胞, D为光密度值。 1. 2 MS C s的分离和培养 速眠新0. 1m l/ k g 肌 注麻醉猕猴,股骨穿刺抽取骨髓约5m l, 肝素抗凝, 小心加于6 0%梯度的P e r c o l l工作液之上, 15 0 0r/ m i n离心2 0m i n, 吸出白膜层细胞,P B S洗2次, 用 含2%胎牛血清(F

4、C S) 的DMEM/F 1 2培养液重悬 细胞, 置3 7、 5%C O2培养箱,4 8h后换液, 以后每 3d半量换液。本实验使用细胞为传代培养的第3 代细胞。 1. 3 MS C s体外诱导分化 当细胞达8 0%融合 时, 以51 0 3/ c m 2接种于2 5c m2培养瓶和6c m直 径的培养皿, 加入成骨分化培养液, 成骨分化体系含 1 0 -7m o l /L地塞米松、 1 0m o l/L-磷酸甘油、0. 0 5 m o l/L维生素C, 隔天换液, 在第4、8、1 2和1 6天检 测钙化小结, 用甲醛溶液固定细胞,V o nK o s s a染 色。加入成脂分化培养液, 脂

5、肪分化体系含1 0 -6 m o l/L地 塞 米 松、0. 5 mm o l/L甲 基 黄 嘌 呤 (I B - MX) 、0. 1mm o l/L维生素C, 在第4、8、1 2和1 6天 检测脂肪滴, 用甲醛溶液固定细胞, 油红O染色。 1. 4 MS C s的体内输注 将培养MS C s的上清液 进行细菌、 真菌培养,P C R法检测支原体。无预处 理向MR猕猴单次股骨髓内注射MS C s。 1. 5 体外皮肤移植试验 分别于MS C s输注前, 输注后2 0、 4 0、6 0d进行体外皮肤移植实验。取MR 外周血淋巴细胞分别与MD、NMD皮肤体外共培养 7 2h, 作H - E染色病理

6、切片及组织化学切片。以与 MD猕猴白细胞抗原 (R h L A) 不相合的无关非受者 猴(n o n - MS C s - r e c i p i e n t,NMR) 的淋巴细胞与MD 皮肤共培养作为实验阳性对照。 1. 5. 1 提取外周血淋巴细胞 取猕猴外周血4m l , 肝素抗凝, P B S稀释1倍, 小心加于4m l淋巴细胞 分离液( F i c o l l) 上,15 0 0r/m i n离心1 5m i n, 吸取中 间白膜层细胞,P B S洗2次, 重悬于1 0% F C SR P - M I1 6 4 0完全培养基中。显微镜下计数, 调整细胞 密度为11 0 7/ m l。

7、用9 6孔培养板培养细胞, 每孔 加入2 0 0l培养液, 其中淋巴细胞数为21 0 6个/ 孔。 1. 5. 2 体外皮肤移植片 猕猴麻醉, 俯卧位, 背部 局部去毛, 碘伏消毒皮肤, 无菌条件下切取约1c m 2 大小全层皮肤, 去除皮下脂肪, 切为1mm1mm 大小皮片, 置9 6孔培养板中。实验分组如下, 实验 组:MR淋巴细胞加MD或NMD皮片; 阳性对照 组:NMR淋巴细胞加MD皮片; 阴性对照组:MD淋 巴细胞加自身皮片; 空白组: 培养液中仅有MD或 NMD皮片。每组重复3孔。3 7、5%C O2培养箱 孵育7 2h。 1. 5. 3 病理分析 与淋巴细胞共孵育后的皮片用 1

8、0%甲醛固定, 军事医学科学院附属医院病理室做 病理切片(H - E染色) , 2位病理学专家双盲读片。 皮肤病理损伤分级参照L e r n e r等 6 1 9 7 4年提出的 移植物抗宿主病的皮损分级。0度: 正常皮肤; 1度: 淋巴细胞浸润, 棘细胞、 基底细胞空泡变性; 2度: 表 皮层细胞空泡变性, 海绵状变性, 有嗜酸小体出现; 3 度: 表皮细胞基底层灶性溶解, 水泡形成伴有2度改 变; 4度: 表皮全层脱落, 伴有3度改变。实验发现 皮肤离体培养7 2h后可以出现02度的损伤, 因 此将空白组皮肤的病理结果视为背景, 实验组出现 2度以下损伤视为阴性结果,34度损伤视为阳性 结

9、果。 1. 6 TUN E L法检测皮肤切片中的凋亡细胞 实 验组体外培养皮肤作石蜡切片, 检测皮肤中凋亡细 胞的比率。TUN E L试剂盒购自武汉博士德生物公 司, 按照试剂盒说明进行实验, 简述如下: 皮肤石蜡 第5期.黄雅静, 等.体外皮肤移植和TUN E L实验评价猕猴间充质干细胞输注对细胞免疫的影响4 6 7 切片二甲苯脱蜡, 梯度乙醇入水( 实验过程中保证石 蜡切片湿润) , 加入蛋白酶K使细胞脱蛋白透明, 依 次加标记液、 封闭液、 抗地高辛抗体、 S A B C,D A B显 色, 苏木精轻度复染, 梯度乙醇脱水, 透明, 封片。阴 性对照片不加标记液, 阳性对照片经D NA酶

10、处理。 光学显微镜下观察, 表皮层中细胞核棕染的为阳性 细胞, 每片计数1 0 0个细胞, 计算阳性细胞的比 例。 1. 7 统计学处理 用S A S软件包进行t检验。 2 结 果 2. 1 MS C s培养鉴定 培养的骨髓单个核细胞大 部分于2 4h内即贴壁, 倒置显微镜下, 贴壁细胞呈 圆形, 有小的胞质突起。7 2h后, 大多数细胞有胞质 突起, 部分呈梭形, 1周后以梭形细胞为主, 胞质丰 富, 核大, 核染色质细, 核仁明显。瑞氏染色后, 于光 镜下可见成纤维样细胞形态, 细胞呈平行或漩涡状 生长 ( 图1 A) 。上 流 式 细 胞 仪 检 测 培 养 第3代 MS C s的细胞表

11、型:F l k为7 3. 7 1%,C D 4 4为1 2%, C D 2 9为9 8. 4 2%,C D 3 4为0. 2 4%,C D 4 5为 0. 2 8%,HL A - D R为0。在脂肪诱导体系中, 可见脂 肪液泡逐渐充满整个细胞, 油红O染色可见红色的 脂肪颗粒( 图1 B) 。在成骨诱导体系中, 细胞形态由 原来的梭形变成了立方形, 随细胞生长密度的增长 形成多层的结节结构,V o nK o s s a染色有明显的钙 化基质沉积( 图1 C) 。 图1 猕猴M S C s正常形态以及诱导分化 F i g1 M o r p h o l o g i c f e a t u r eo

12、 f r h e s u sM S C sa n d i t sd i f f e r e n t i a t i o n A:M o r p h o l o g i c f e a t u r eo f r h e s u sM S C s(t h e 9 t hd a y,1 0 0) ;B:M S C sd i f f e r e n t i a t e d i n t o t h e a d i p o g e n i c l i n e a g e(o i l r e dOs t a i n i n g,4 0 0) ;C: M S C sd i f f e r e n t i a

13、t e d i n t ot h eo s t e o g e n i c l i n e a g e(V o nK o s s as t a i n i n g,4 0 0) 2. 2 MS C s输注后猕猴一般情况 M S C s培养上清 液无细菌、 真菌污染, P C R检测无支原体污染。输注 细胞数为4 1 0 521 06/ k g 。输注后猕猴心率、 呼 吸、 血压正常, 未见皮疹及精神异常, 未见急性毒性反 应。观察3个月血常规、 肝肾功能, 无明显变化。 2. 3 体外皮肤移植病理变化 体外皮肤移植的阳 性对照组均出现严重的4度损伤。MR淋巴细胞与 MD皮肤共培养组, 输注MS

14、 C s之前皮肤移植物病 理均为阳性, 输注后2 0d, 供者的皮肤移植物病理损 伤减轻, 未见皮肤大泡、 嗜酸性小体和表皮脱落等病 理现象, 病理结果为阴性( 图2 A) ; 输注后4 0、 6 0d, 病理损伤加重( 图2 B) , 均为阳性表现( 表1) 。 图2 体外皮肤移植片病理图和T U N E L图 F i g2 P a t h o l o g ya n dT U N E La s s a yo fi n v i t r os k i ne x p l a n t s A:H a e m a t o x y l i na n de o s i ns t a i n e ds k

15、i ns e c t i o nf r o mt h es k i ne x p l a n ta s s a ys h o w i n gag r a d e0 - 1l e s i o n.T h i s i sn o r m a ls k i na n dc o n s i d e r e da s b a c k g r o u n d .M i l dv a c u o l i s a t i o no fb a s a l c e l l s i ss e e n,t o g e t h e rw i t ht h eo c c a s i o n a ld y s k e r a

16、 t o t i cb o d y;B:H a e m a t o x y l i na n de o s i ns t a i n e ds k i n s e c t i o n f r o mt h e s k i ne x p l a n t a s s a ys h o w i n gag r a d e 3 - 4 l e s i o nw i t hd i f f u s ev a c u o l i s a t i o no f b a s a l c e l l s,s c a t t e r e dd y s k e r a t o t i cb o d i e s,a n

17、 ds u b e p i - d e r m a lc l e f t f o r m a t i o n. T h i s i s c o n s i d e r e dap o s i t i v e r e s u l t;C:G r a d e 1TUN E Lb i o p s ys h o w i n g l e s s a p o p t o t i c c e l l s(b r o w nn u c l e i).M o s t o f t h i s s k i ns e c t i o ns h o w i n gn e g a t i v es t a i n i n

18、 g;D:G r a d e3TUN E Lb i o p s y,s h o w i n gm o r ea p o p t o t i cc e l l sw i t hb r o w nn u c l e i 4 6 8 第二军医大学学报 2 0 0 6年5月, 第2 7卷 表1 体外移植皮肤切片病理损伤结果 T a b1 P a t h o l o g y l e s i o no fi n v i t r os k i ne x p l a n t s G r o u p N o .P r e - i n f u s i o n P o s t - i n f u s i o n(t

19、/d) 2 04 06 0 MR+MD1+-+ 2+-+ 3+-+ 4+-+ 5+-+ MR+NMD1+-+ 2+-+ 3+-+ 4+-+ 5+-+ MR:M S C s - r e c i p i e n t;MD:M S C s - d o n o r;N D:N o n - M S C s - d o n o r 2. 4 皮肤移植TUN E L检测结果 选取体外皮肤 移植实验空白组( 病理结果阴性) 和阳性对照组( 病 理结果阳性) 皮肤石蜡切片各1 0例,TUN E L( 图 2 C、2 D) 发现空白组凋亡细胞数多在1 5%以下(8/ 1 0,8 0%) , 阳性对照组凋亡细胞比例

20、1 5%的比率 是9 0%( 9/1 0) 。MD的皮肤移植片凋亡细胞比例由 输注前的( 2 3. 04. 9)%下降到(1 2. 21. 9)%, 具 有显著差异(P0. 0 5) ; 输注后4 0、 6 0d, 凋亡细胞 比例增至( 2 2. 03. 2)%、 (2 2. 02. 5)%, 与输注前 结果比较无显著差异。 MR淋巴细胞与NMD皮片共培养组, 在输注 前和输注后2 0d也检测到病理损伤的减轻, 皮肤切 片中凋亡细胞比例减少, 皮肤移植物石蜡切片凋亡 细胞比例由输注前的( 2 2. 02. 0)%下降到(1 1. 8 1. 4)%, 具有显著差异(P0. 0 5) ; 输注后4

21、 0、6 0d, 凋亡细 胞 比 例 分 别 为 (2 3. 22. 4)%、 (2 4. 0 2. 6)%, 增至输注前水平。 3 讨 论 MS C s在骨髓内可分化为基质细胞, 分泌多种 细胞因子, 产生细胞外基质分子、 黏附分子等, 提示 其参与造血微环境, 促进造血, 影响造血干细胞的归 巢、 增殖、 分化 1,2。在造血干细胞移植中, MS C s可 增加造血细胞植入率、 促进造血恢复、 抑制免疫, 具 有广阔的临床应用前景。实验发现MS C s能够跨越 MHC屏障, 不但输注同种异基因MHC不相合的 MS C s是安全的, 甚至异种间输注MS C s也能完全 耐受。MS C s这种

22、特殊的免疫特性是当今研究的热 点。 B a r t h o l o m e w等 4给狒狒输注 MS C s后能够延 长组织不相容性皮肤移植物的存活时间。本研究进 行皮肤移植预实验发现, 猕猴生性好动, 皮肤移植困 难多, 同时在移植物状态的判断上准确性不高, 因此 设计应用体外皮肤移植实验。体外皮肤移植模型最 早于1 9 8 2年由B e r k m a n建立 7, 之后, D i c k i n s o n和 S v i l a n d等 8,9将其应用于移植前移植物抗宿主病 (GVHD) 的预测, 具有8 5%以上的特异性和敏感 性。本实验借鉴并改进了D i c k i n s o n

23、的方法 1 0, 将 体外皮肤移植应用于评价供受者之间的免疫反应, 同时结合TUN E L实验检测移植皮肤中凋亡细胞的 比例, 量化判断MS C s输注对供受者之间免疫应答 的影响。 实验发现输注MS C s后2 0d, 受者淋巴细胞与 供者皮肤呈现减低的免疫反应, 皮肤病理损伤程度 较输注前减轻, 凋亡细胞比例减低;MS C s受者与非 供者之间体外皮肤病理片中凋亡细胞比例也由输注 前的( 2 2. 02. 0)%下降至(1 1. 81. 4)%, 具有显 著差异; 输注后4 0d和6 0d, 受者淋巴细胞无论对 供者还是非供者的皮肤均产生较强的免疫排斥。实 验结果说明猕猴输注同种异基因MS

24、 C s后, 通过体 外实验可以检测到供受者之间降低的免疫反应, 但 是这种免疫抑制作用是短期的可逆的, 可持续至输 注后2 0d。 许多研究都探讨了MS C s对ML C的作用机 制。K r a m p e r a等 1 1认为 MS C s选择性的抑制已接 触抗原的T细胞, 其抑制作用是通过与T细胞接触 从而阻止T细胞与抗原呈递细胞接触而产生的;L e B l a n c等 5认为 MS C s对ML R的作用与MS C s的 剂量有关, 在ML R中加入( 14)1 0 5的 MS C s对 T细胞的增殖起到抑制作用, 加入1 010 0 0的 MS C s抑制作用减弱, 有时起到刺激增

25、殖的作用, 同 时认为这种刺激作用与MHC无关, 可能是由于 MS C s表面结构起到了刺激源或促分裂源的作用, 使MS C s表面抗原与ML C的HL A - D R抗原共同起 效发挥了刺激作用。与其他研究不同的是, 我们对 猕猴无预处理单次输注MS C s, 然后再检测供受者 之间细胞免疫应答强弱, 发现单次MS C s体内输注 也能对受者淋巴细胞产生诱导作用, 使受者淋巴细 胞对供者及非供者皮肤的免疫排斥减弱, 表现为皮 肤病理损伤的减轻和凋亡细胞的减少。 B a r t h o l o m e w等 4实验中, 给狒狒输注 MS C s 的数量为2 01 0 6/ k g , 获得了延

26、长MHC不相合皮 第5期.黄雅静, 等.体外皮肤移植和TUN E L实验评价猕猴间充质干细胞输注对细胞免疫的影响4 6 9 肤移植物的存活时间。与B a r t h o l o m e w的实验相 比, 我们输注的细胞数较低( 最多为21 0 6/ k g ) , 相 差1 0倍以上, 表明即使输注的MS C s数量较少, 也 同样可以产生免疫抑制作用。 MS C s在体外实验中所表现出来的对T淋巴细 胞的免疫抑制作用有积极的临床意义, 值得进一步 深入研究。既往关于MS C s免疫调节作用的研究大 多是通过体外实验, 在体内实验方面, 不做预处理、 单纯输注异体MS C s来评价其免疫调节作

27、用的研究 报道 很 少。 本 实 验 对 猕 猴 无 预 处 理 单 次 输 注 MS C s, 通过体外实验评价了猕猴单次MS C s输注后 的免疫作用, 对体外皮肤移植物的损伤进行病理分 级, 评判标准与判断皮肤移植体内存活时间相比较 为准确, 同时, 凋亡细胞的增加是皮肤损伤的直接证 据, 对凋亡细胞的检测量化了实验数据, 弥补了对病 理切片 判 断 不 确 切 的 弊 端, 增 加 结 果 的 可 靠 性。 MS C s联合造血干细胞移植可促进植入 1 2,1 3, 减轻 GVHD。MS C s特有的免疫调节作用使得它在造血 干细胞移植中得以应用 1 4,1 5, 但其发挥作用的机制

28、还有待于进一步探讨。本实验检测到MS C s体内输 注后下调了供受者之间的免疫反应, 降低排斥, 为 MS C s在造血干细胞移植中的应用作出理论铺垫。 参 考 文 献 1 P i t t e n g e rMF,M a c k a yAM,B e c kS C,e ta l .M u l t i l i n e a g ep o - t e n t i a lo fa d u l th u m a n m e s e n c h y m a ls t e mc e l l sJ.S c i e n c e, 1 9 9 9,2 8 4:1 4 3 - 1 4 7. 2 G r e g o r

29、 yC A,P r o c k o pD J,S p e e sJ L.N o n - h e m a t o p o i e t i cb o n e m a r r o ws t e mc e l l s:m o l e c u l a rc o n t r o lo fe x p a n s i o na n dd i f f e r - e n t i a t i o nJ. E x pC e l lR e s,2 0 0 5,3 0 6:3 3 0 - 3 3 5. 3 C o n g e tP A,M i n g u e l lJ J . P h e n o t y p i c a

30、 la n df u n c t i o n a lp r o p e r - t i e so fh u m a nb o n em a r r o wm e s e n c h y m a l p r o g e n i t o r c e l l sJ. J C e l lP h y s i o l,1 9 9 9,1 8 1:6 7 - 7 3. 4 B a r t h o l o m e w A,S t u r g e o nC,S i a t s k a s M,e ta l . M e s e n c h y m a l s t e mc e l l ss u p p r e s

31、 sl y m p h o c y t ep r o l i f e r a t i o ni nv i t r oa n dp r o - l o n gs k i ng r a f ts u r v i v a li nv i v oJ. E x pH e m a t o l,2 0 0 2,3 0: 4 2 - 4 8. 5 L eB l a n cK,T a mm i kL,S u n d b e r gB,e ta l .M e s e n c h y m a l s t e mc e l l s i n h i b i ta n ds t i m u l a t em i x e

32、d l y m p h o c y t ec u l t u r e sa n d m i t o g e n i cr e s p o n s e si n d e p e n d e n t l yo ft h em a j o rh i s t o c o m p a t i - b i l i t yc o m p l e xJ. S c a n dJ I mm u n o l,2 0 0 3,5 7:1 1 - 2 0. 6 L e r n e rKG,K a oG F,S t o r bR,e ta l .H i s t o p a t h o l o g yo fg r a f

33、t v e r s u sh o s t r e a c t i o n(GVHR)i nh u m a nr e c i p i e n t so fm a r r o w f r o m HL A - m a t c h e ds i b l i n gd o n o r sJ. T r a n s p l a n tP r o c,1 9 7 4, 6:3 6 7 - 3 7 1. 7 B e r k m a nA,F a r m e rE,T u t s c h k aP,e ta l,S k i ne x p l a n tc u l - t u r ea sam o d e l f

34、 o r c u t a n e o u sg r a f tv e r s u sh o s td i s e a s eJ. E x p H e m a t o l,1 9 8 2,1 0(S u p p l 1 2) :3 3 - 4 0. 8 S v i l a n dL,D i c k i n s o nAM,C a r e yP J,e t a l . A ni n v i t r op r e d i c - t i v e t e s t f o r c l i n i c a l g r a f t - v e r s u s - h o s td i s e a s e i

35、 na l l o g e n e i cb o n e m a r r o wt r a n s p l a n tr e c i p i e n t sJ. B o n e M a r r o w T r a n s p l a n t, 1 9 9 0,5:1 0 5 - 1 0 9. 9 S v i l a n dL,H r o m a d n i k o v aI,S e d l a c e kP,e ta l .H i s t o l o g i c a l c o r r e l a t i o nb e t w e e nd i f f e r e n tc e n t e r

36、 su s i n gt h es k i ne x p l a n t m o d e l t op r e d i c tg r a f t - v e r s u s - h o s td i s e a s ef o l l o w i n gb o n em a r - r o wt r a n s p l a n t a t i o nJ. H u mI mm u n o l,2 0 0 1,6 2:1 2 7 7 - 1 2 8 1. 1 0D i c k i n s o nA,H r o m a d n i k o v aI,S v i l a n dL.U s eo fas

37、k i ne x - p l a n tm o d e l f o rp r e d i c t i n gGVHDi nHL A - m a t c h e db o n em a r - r o wt r a n s p l a n t s - e f f e c to fGVHDp r o p h y l a x i sJ. B o n eM a r r o w T r a n s p l a n t,1 9 9 9,2 4:8 5 7 - 8 6 3. 1 1K r a m p e r aM,G l e n n i eS,D v s o nJ,e ta l .B o n em a r

38、r o w m e s e n - c h y m a l s t e mc e l l s i n h i b i t t h e r e s p o n s eo f n a i v ea n dm e m o r ya n - t i g e n - s p e c i f i cTc e l l s t ot h e i rc o g n a t ep e p t i d eJ. B l o o d,2 0 0 3, 1 0 1:3 7 2 2 - 3 7 2 9. 1 2L a z a r u sHM,K o cON,D e v i n eS M,e t a l . C o t r

39、a n s p l a n t a t i o no f HL A - i d e n t i c a l s i b l i n g c u l t u r e - e x p a n d e d m e s e n c h y m a l s t e m c e l l sa n dh e m a t o p o i e t i cs t e mc e l l si nh e m a t o l o g i cm a l i g n a n c y p a t i e n t sJ.B i o lB l o o d M a r r o w T r a n s p l a n t,2 0 0

40、 5,1 1: 3 8 9 - 3 9 8. 1 3P o l c h e r tD,M o a d s i r iA,N a p o l e sP,e t a l .M e s e n c h y m a l s t e m c e l l sc a nf a c i l i t a t ee n g r a f t m e n ta c r o s s MHCb a r r i e r sa n dc a n r e s c u el e t h a l l yi r r a d i a t e dr e c i p i e n t sJ.B l o o d,2 0 0 2,1 0 0:

41、1 0 8 a . 1 4L eB l a n cK,R i n g d e nO. I mm u n o b i o l o g yo fh u m a nm e s e n c h y - m a l s t e mc e l l sa n df u t u r eu s e i nh e m a t o p o i e t i cs t e mc e l l t r a n s - p l a n t a t i o nJ. B i o lB l o o d M a r r o w T r a n s p l a n t,2 0 0 5,1 1: 3 2 1 - 3 3 4. 1 5D e a n sR J,M o s e l e yA B. M e s e n c h y m a ls t e mc e l l s:b i o l o g ya n d p o t e n t i a l c l i n i c a lu s e sJ. E x pH e m a t o l,2 0 0 0,2 8:8 7 5 - 8 8 4. 收稿日期 2 0 0 5 - 1 1 - 1 1 修回日期 2 0 0 6 - 0 3 - 1 9 本文编辑 孙 岩