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1、第2 4 卷第7 期 2 0 0 6年 7月 中医药学刊 C H I N E S E A R C H I V E S OF T R A D I T I ON A L C H I N E S E ME D I C I N E . 2 4 N o . 7 20 0 6 和络泄浊方对肾间 质纤维化大鼠转化生长因子p ; 表达的影响 于俊生， 刘丙欣 ( 青岛市中医医院， 山东 青岛2 6 6 0 3 3 ) 摘要: 目 的: 探讨中药和络泄浊方对肾间质纤维化的作用机制。方法: 将6 0只W i s t a r 大鼠随机分为4组 ( 正常对照组、 正常灌胃 组、 造模组及造模灌胃 组) ， 运用单侧拾
2、尿管结扎法( U U O ) 制造肾间质纤维化模型， 术后5 周取术侧肾 胜组织 做H E染色， 并应用免疫组化检浏各组大鼠转化生长因 子p , ( T G F 一 p I ) 的 表达。结果: 肾间质 纤维 化后致纤维化因 子T G F - p ， 表达 上调， 经和络泄浊 方灌胃 后， 肾间 质T G F 一 p ， 表达下调， 纤维 化程度较造模 组显著改 善。 结论: 和络泄浊 方可 通过抑制T G F 一 p ; 的 表达， 改 善肾间 质纤维 化。 关健词: 肾间 质纤维化; 转化生长因子P i ; 养血活血; 和络泄浊 中圈分类号: R - 3 3 2文献标识码: B文章编号:
3、1 0 0 9 - 5 2 7 6 ( 2 0 0 6 ) 0 7 一 1 2 2 0 - 0 2 1 2 2 0 ， 材料与方法 1 . ， 实脸动物 健康W i s t a r 大鼠6 0 只， 雌雄各3 0 只， 体 重2 2 0 - 2 6 0 g ， 平均体重2 3 5 8 ， 由 青岛 市动物研究所提供。 于室温2 3 C， 用标准大鼠 饲料分笼喂养， 自 由 饮水。 1 . 2 实脸药物及试剂 和络泄浊方， 药用: 当归、 川芍、 赤 芍、 白 术、 制大黄、 六月雪、 土获荃等， 由青岛市中医医院制 剂室制成灭菌浓煎密封制剂， 药物比 重为1 . 1 0 了L ， 生药含 f
4、为1 . 8 g / m L o T G F 一 0 : 兔抗鼠 多 克隆 抗体 试剂、 非 生物 素检侧试剂盒、 D A B显色剂， 均由北京中山生物技术工程 公司提供。 1 . 3 模型制作及分组 6 0 只W i s t a r 大鼠相同条件喂养1 周后随机分为4 组: 正常对照组( I 组) 1 2 例、 正常灌胃组 ( II 组) 1 2 例、 造模组( I Q 组) 1 8 例、 造模灌胃组( N组) 1 8 例。 参考( 现代医学实验动物学) ， 采用单侧输尿管结扎法 ( U U O ) 进行肾间质纤维化模型制备。正常对照组开腹后 不结扎输尿管， 直接缝合。造模灌胃 组于术后1
5、周开始与 正常灌胃 组同时给予和络泄浊方灌胃， 每天2 次， 每次1 . 5 M L ， 持续4 周。造模组与正常对照组同时给予等量生理盐 水灌胃。 4 组大鼠 术后均以原方式喂养。 1 . 4 标本收集与 病理切片 4 组大鼠均于灌胃4 周后宰 杀。每只大鼠 麻醉后， 切开腹腔， 立即取出肾脏， 沿矢状面 切成两半后放人装有1 0 %中 性甲 醛缓冲液的小瓶中保存， 送病理科制成蜡块。经玻片处理， 1 0 %甲 醛室温固定， 清水 浸泡洗涤， 梯度酒精脱水; 然后5 8 石蜡浸演， 石蜡包埋， 冷冻凝固， 修整， 制作3 p m厚的连续切片。 1 . 5 免疫组化 烤片， 脱蜡至水， 滴加3
6、 %过氧化氢， 湿盒 内 室温放置1 0 m i n 后， 单蒸水洗; 根据抗体说明书要求， 分 别进行热修复、 酶消化; 滴加正常动物非免疫血清( 山羊血 清) 封闭液， it于湿盒内， 室温放置1 0 m i n ; 甩干后勿冲洗， 直接 滴加T G F 一 p : 兔抗鼠多克隆抗体， 置于湿盒内孵育 2 h ， 或4 冰箱过夜; 依次甩干， 0 . 0 1 M P B S 洗， 先后滴加 中医药 收稿日 期二 2 0 0 6 - 0 1 一 1 3 作者简介: 于俊生( 1 9 5 8 一 ) ， 男， 山东惠民人， 教授、 主任医师， 博 学刊 士， 研究方向: 肾脏病的中西医结合临床
7、诊治。 P V 试剂盒内试剂一、 二， 置于湿盒内室温放置; 甩干， 0 . 0 1 M P B S 洗， 滴加1 滴新配置的D A B 显色剂， 显色后水冲洗; 苏木素轻度复染。乙醇脱水， 二甲苯透明， 封片。 2 观察项目 与判定标准 2 . ， 肾 小管一 间 质病理变化 按陈晓 农等川引 用A b e . S 的方法， 光镜下对肾小管间质病变进行半定量分级。 0 级: 肾小管无明显病变， 间质中无或极少见炎性细胞， 无纤维化 组织增生， 病变 5 0 %。 2 . 2 免疫 组化 检测T G F - p ， 在肾 组织的 表达 根据染色 程 度 及 染 色 细 胞 百 分 率 进 行分
8、 析 评定z : 基本不着色 者为 0 分， 着色淡者为1 分， 着色较深者为2 分， 着色细胞占 计 数细胞百分率: 5 %以下为0 分， 6 %一 2 5 %为1 分， 2 6 %- 5 0 %为2 分， 5 1 %以上者为3 分。将每张切片染色程度与 染色细胞百分率各自 相乘， 为其最后得分。得0 一 1 分为阴 性( 一 ) ， 得2 - 3 分为阳 性( + ) ， 得4 分及4 分以上为强阳 性( + ) 。 2 . 3 统计学处理 各组资料均采用R i d i t 分析检验, P 0 . 0 5 ) 0 表1 H E染色各组病理改变状况 肾小管间质病变程度 R i d i t 值
9、P ,几 0 级1 级2 级 0 . 0 5 0 . 0 5 0 . 0 1 0 . 0 1 0 . 0 1 功。而造模灌胃 组大鼠 小管上皮细胞亦可见萎缩， 但无空 泡样变性及大片坏死， 浸润的炎症细胞较模型组明显减少， 间质变窄， 纤维化组织成束状排列， 与模型组相比有较显著 改善。 T G F 一 日 是目 前发现的最强促肾间质纤维化分子， 它 的上调表达是所有人类和实验动物肾间质纤维化的特 征6 ， 并 可 在R I F 发 生 发 展的 多 个 环 节 起 作 用7 1 。 T G F 一 p 在促肾间质纤维化过程中的作用主要有以下几方面: 刺 激成纤维细胞等促进E C M成分的产生
10、， 包括蛋白多糖、 胶 原 I , D I , N以及纤连蛋白( F N ) ， 层毅蛋白( L N ) 的表达。 刺激小管上皮细胞转分化为肌成纤维细胞。通过抑制 E C M降解酶( 如基质金属蛋白 酶、 纤溶酶原激活物等) 的活 性及促进纤溶酶激活抑制剂( P A I ) 和组织基质金属蛋白抑 制物( T I M P ) 的合成而减少E C M的降解。增加E C M受 体如整合素的表达， 从而增加E C M与细胞的相互作用 s 1 。 本实验免疫组化结果显示， T G F 一 p : 在正常肾组织仅 散在表达于肾小管上皮细胞中， 肾小球、 肾间质及肾血管均 未见表达。 造模组大鼠T G F
11、一 P : 不但广泛表达于肾小管上 皮细胞胞浆中， 而且在纤维化的肾间质中 亦有较强表达， 造 模灌胃 组较造模组大鼠小管间质T G F 一 p : 的表达明显下 降， 说明和 络泄浊方可能通过抑制T G F 一 R ， 的表达而影响 肾间质E C M的 合成或降解， 延缓纤维化进展。 参考文献: 1 陈晓农， 俞海瑾， 王伟铭， 等. 肾小管间质病变与慢性肾脏疾 病进展关系的 研究 J . 上海医学， 2 0 0 1 , 2 4 ( 2 ) : 7 5 2 张治新. I L 一 1 0 对实 验性肝纤维化大鼠 转化生长因子日 ; 表 达的 影响【 J . 中 西医 结合肝病杂志， 2 0 0
12、 2 , 1 2 ( 2 ) : 9 2 一 9 4 3 邹合群. 小管间质性肾病学【 M . 北京: 中国医药科技出版 社， 2 0 0 0 . 4 5 一 6 5 4 刘丙欣， 于俊生. 运用络病理论辨治慢性肾功能衰竭探析 J :中医药学刊， 2 0 0 5 , 2 3 ( 3 ) : 5 0 5 - 5 0 6 5 K l a h r S , M o r r i s s e y J . O b s t r u c t i v e n e p h r o p a t h y a n d re n a l f b r o s i s J . A m J P h y s i o l R e n
13、 a l P h y s i o l , 2 0 0 2 , 2 8 3 ( 5 ) : 8 6 1 一 8 7 5 6 赵建荣， 屈磊， 李晓 玫. 黄茂当 归合剂对梗阻性肾病大鼠肾间 质纤维化的防治作用 J l . 北京大学学报( 医学版) , 2 0 0 4 , 3 6 ( 2 ) : 1 2 1 7 李才. 器官纤维化一 基础与临床 M . 北京: 人民卫生出版 社， 2 0 0 3 . 1 1 3 8 O D o n n e ll M P . R e n a l t u b u l o i n t e r s t it i a l fi b r o s i s . N e w t h
14、 o u g h t s ， i t s d e v e l o p m e n t a n d p r o g r e s s i o n J . P o s t g r a d M e d , 2 0 0 0 , 1 .0 8 1 5 9一1 7 2 中医药学刊 注: P i : 与1 组比 较; P 2m 组与N 组比 较。 4 讨论 慢性肾功能衰竭是各种慢性肾脏疾病发展到晚期， 引 起体内氮质及其他代谢产物大量醋留， 不能正常维持水、 电 解质、 酸碱平衡而导致的一系列临床症状， 多病情危重， 严 重危害人类健康。而肾间质纤维化( R I F ) 几乎是各种肾脏 疾 病进展到 终 末
15、期肾 衰竭的 共同 途径和主 要病理基础 3 1 0 因此， 如果能有效延缓肾间质纤维化的进展速度， 就可以在 很大程度上延缓肾衰的进展。 笔者认为， 肾间质纤维化属中医络病范畴， 在纤维化进 展过程中， 可出现“ 肾络窟滞” 的特征， 针对肾络癖滞的病 机特点， 临证选用和络泄浊方治疗。和络泄浊方以当 归、 川芍为君， 养血活血， 行气和络， 疏通肾络， 祛癖生新。 当归补血活血， 为血中之气药， 补而不腻Oil芍活血祛寮、 行 气开郁， 二者配伍， 可使络中新血生， 癖血去， 癖滞之络渐 通， 气血精微重新输布， 濡养全身。以白术健补脾气， 葫芦 巴温肾祛湿， 共为臣药， 健脾化痰， 温阳
16、祛湿。佐以赤芍除 血痹， 破坚积; 海藻消痰软坚; 大黄、 六月雪、 土获荃解毒排 毒， 泄浊通络。综观全方， 扶正与祛邪并重， 缓攻缓补， 以通 为用， 以和为期， 取其生生不息之意， 使泄而不伤正， 补而不 滞邪。 临床上， 输尿管梗阻是导致肾间质纤维化的常见原因， 而啮齿类动物的U U O模型可反映人类梗阻性肾病和纤维 化肾 脏 疾 病 过 程s 7 。 为 此， 笔 者采 用U U O 方 法 建 立 大鼠 肾 间质纤维化模型， 观察了梗阻过程中大鼠肾间质的病理变 化。U U O的特点是进行性小管萎缩及间质纤维化。术后4 周发现术侧近端输尿管及肾脏极度扩张， 肾门消失， 整个肾 脏皮质
17、变薄， 呈淡黄色。H E染色可见造模组大鼠肾小管 上皮细胞萎缩、 空泡样变性、 管腔闭塞， 大量单核巨噬细胞、 淋巴细胞浸润， 间质变宽， 出现多灶性纤维化， 说明造模成 犷 一 tit M ;根 据 国 家 标 准 G B 335 一 82 统 计 学 名 词 及 符 号 1 书 规 定: 样 本的 算 术 平均 数 用英文大 写斜体X， 不 用英卜 书*， 、 二; . 。，二，*， 1、 二，、_二二，*、，卜 4 S D ; ， 检 验 用 英 文 小 写 斜 体 , F 检 验 用 英 文 大 写 斜 体卜 ; F ; 卡 方 检 验 用 希 文 小 写 斜 体 X Z ; 样 本 的 相 关 系 数 用 卜 寻 英 文 小 写 斜 体 r ， 自 由 度 用 希 文 小 写 斜 体， ， 概 率 用卜 书 英 文 大 写 斜 体尸 ; 样 本 数 用 英 文 小 写 斜 体。 . 来 稿 请卜 琢 参 照 书 写 。卜 1 2 2 1 ( 本刊编辑 车- r r T r T r T r r r r r - r T r T r r - r - r r r T r - r r r r - er