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1、上 海 交 通 大 学 学 报（ 医 学 版 ） Journal of Shanghai Jiaotong University （Medical Science）Vol. 26 No. 1 Jan. 2006 【基金项目】 上海市科委课题基金 （34119818） 资助项目 【作者简介】 孙海燕 （19)3 * ） ， 女， 安徽六安人， 主治医师， 博士生 【通讯作者】 崔+斌， E-mail： bcui,sibs. ac. cn 【文章编号】 + 02-8 *-898 （2006） 01 *0022 *03专题报道 嗜铬细胞瘤 SDHD 和 MEN1 基因突变与杂合性缺失研究 孙海燕，
2、苏!为， 崔 斌， 姜 蕾， 李小英， 宁 光， 张军妮， 王卫庆 （上海交通大学医学院瑞金医院内分泌代谢病科 上海市内分泌代谢病临床医学中心 上海市内分泌代谢病研究所，上海 200025） 【摘 要】 目的 探讨抑癌基因 SDHD 和 MEN1 的突变与杂合性缺失， 在嗜铬细胞瘤 （PCC） 发病机制中的作用。方法 采用 DNA 直接测序法对 SDHD 和 MEN1 基因的全部外显子及其侧翼进行分析， 寻找基因突变。选用荧光标记 11q13 区 - 23 区的 8 个多 态性微卫星位点对 37 例 PCC 进行杂合性缺失频率检测。分析上述检测结果与临床资料的关系。结果 在 37 例 PCC
3、肿瘤组织 中未发现 SDHD 和 MEN1 基因突变。发现 3 种 SDHD 基因内含子改变 （15519972c/ g， 15521745c/ t， 15520001c/ a） ， 2 种 MEN1 基 因内含子改变 （9879384a/ g，9878352C/ T） 。SDHD 所在区域 11q23 的杂合性缺失频率为 30. 8% 。MEN1 所在区域 11q13 的杂合 性缺失频率为 26. 9% 。结论 PCC 中未发现 SDHD 和 MEN1 基因突变； 发现一定比例的 11q13 区 - 23 区域的杂合性缺失， 提示 在该区域可能存在其他的抑癌基因参与 PCC 的发病机制。 【
4、关键词】SDHD； MEN1； 杂合性缺失； 突变； 嗜铬细胞瘤 【中图分类号】 .736/ 6； .754； .730/ 231 【文献标识码】0 嗜铬细胞瘤 （pheochromocytoma，PCC） 是以嗜铬 组织分泌儿茶酚胺类物质引起高血压、 头痛、 出汗、 心悸等症状和体征为特征的神经内分泌肿瘤。作为 内分泌性高血压的常见原因， 早期诊断和及时治疗 可有效控制血压， 降低死亡率， 减少高血压并发症的 发生。PCC 最常源自肾上腺髓质， 但也可来自神经 嵴起源的交感神经节及沿内脏自主神经分布的嗜铬 组织， 即肾上腺外 PCC 或称副神经节瘤。PCC 包括 散发型、 综合征相关两种类型
5、。PCC 发生的机制有 待进一步研究明确， 寻找标志物以预测肿瘤的发生、 生物学行为、 良恶性判断、 家族遗传倾向等始终是值 得探讨的热点问题。 近期的研究 1认为线粒体复合物 II （琥珀酸脱 氢酶） 亚单位编码基因 SDHD， 作为抑癌基因参与 PCC 的发生； 另有研究 2 - 3发现 PCC 的 11 号染色体 长臂的杂合性缺失频率较高， 目前已知的 2 种与内 分泌肿瘤相关的抑癌基因 SDHD 和 MEN1 均位于 11 号染色体长臂。研究 3 - 5发现 SDHD 和 MEN1 的突 变频率远小于 11 号染色体长臂杂合性缺失频率。 本研究对 37 例 PCC 进行 SDHD 和
6、MEN1 基因突变 分析， 并对其中 26 例进行杂合性缺失研究， 以探讨 二者在 PCC 发病机制中的作用。 材料与方法 病例与标本 2003 年 1 月2004 年 12 月， 上海 瑞金医院行手术治疗的 PCC 患者 37 例。其中 27 例 为散发， 8 例为副神经节瘤， 2 例为多发性内分泌肿瘤 II 型； 37 例中 3 例为恶性肿瘤。上述诊断均经病理检 查证实。手术切除的肿瘤标本迅速置液氮中储存。其 中 26 例留取血液 ACD 抗凝后，- 80 保存。血液和 组织 DNA 均按常规方法统一提取后， -70 保存。 突变分析 用 Primer 5 设计引物覆盖 SDHD 和 ME
7、N1 的外显子及其侧翼。SDHD 设计 4 对引物， MEN1 设计 12 对引物 （引物序列略） ， 由上海申能博 彩生物科技有限公司合成。PCR 反应体系： 2 mL DNA 模板，10 pmol PCR 引物，4 种脱氧核苷酸各 10 mmol/ L，1 U Taq DNA 酶，10 PCR buffer 缓冲液 （上海申能博彩生物科技有限公司） ， 加双蒸水至终 体积 20 L。PCR 反应在德国 Eppendorf Mastercycle Gradient 梯度 PCR 仪上进行 （杭州飞域实验室设备 有限公司） 。反应条件： 95 变性 30 s， 根据引物的 不同分别在 55 6
8、2 退火 30 s， 72 延伸 30 s， 30 个循环。PCR 产物 5 L 在 1. 5% 琼脂糖凝胶上 电泳，用 DL 2000 标记鉴定。PCR 产物进行微柱纯 化法纯化 （上海申能博彩生物科技有限公司 PCR 纯 化试剂盒） ， 以制备测序模板， 采用双脱氧链终止法 在 ABI 3700 测序仪上进行测序， 用 Chromas V 2. 13 软件在 Blaster 上将测序结果与正常序列进行比对， 寻找基因突变。样本均经双向测序， 结果一致。 杂合性缺失分析 利用 NCBI 生物信息查询分 布于 11q23 区域与 SDHD 紧密连锁的 4 个微卫星多 态性标记 D11S2000
9、、 D11S1986、 D11S1998、 D11S4464， 以及分布于 11q13 区域与 MEN1 紧密连锁的 4 个微 22 No. 1孙海燕， 等：嗜铬细胞瘤 SDHD 和 MEN1 基因突变与杂合性缺失研究 卫星 多 态 性 标 记 D11S1985、 D11S2006、 D11S2371、 D11S2002。引物序列源自 GenBank。利用引物荧光 标记的原理， 在引物 5 端接上能够与标记了荧光基 团的 M13 引物相配对的一段序列。带有荧光标记的 PCR 产物用 CEQ 8800 自动 荧 光 测 序 仪 （ Beckman Coulter） 电 泳 后， 以 片 段 分
10、析 软 件 （ Beckman Coul- ter）进行基因分型。等位基因 2 个片段的最高峰 被赋予峰 高 值， 并 与 相 邻 泳 道 的 正 常 对 照 （ 血 液 DNA 模板） 进行比较分析， 计算等位基因比值 （allele ratio） （等位基因比值 = 肿瘤组织峰高值比 / 正常组 织峰高值比） ，比值 1. 5 或 0. 67 被视为杂合性 缺失。 结 果 临床资料 37 例患者中男性 13 例， 女性 24 例， 中位年龄 44. 2 岁。37 例中 27 例为散发， 8 例为副神 经节瘤， 2 例为多发性内分泌肿瘤 II 型； 其中恶性肿 瘤有 3 例。患者平均收缩压
11、（173. 9 8. 7） mmHg （1 mmHg =0.133 kPa） ， 平均舒张压 （102. 2 3. 8） mmHg。实验室检查： 血甲氧基肾上腺素 （1267. 4 405. 1） pg/ mL、 血甲氧基去甲肾上腺素、（2566. 8 479. 4）pg/ mL， 尿肾上腺素 （201. 3 52. 2）g/24 h、 尿去甲肾上腺素 （728. 5 141. 3）g/24 h、 尿多巴胺 （523. 4 219. 7）g/24 h； 上述指标的正常参考值分 别14. 090. 0、 19. 0121. 0 pg/ mL 和 22. 0、 7 65、 75440 g/24 h
12、。 上述检查提示血和尿中儿茶 酚胺类激素的高水平， 然后进行 CT 检查定位， 手术切 除， 病理诊断证实为 PCC。术后随访血压下降明显。 突变和杂合性缺失分析 所有肿瘤组织中未发 现 SDHD 和 MEN1 基因突变， 发现 3 种 SDHD 基因内 含子改变 （15519972c/ g，15521745c/ t，15520001c/ a） ， 2 种 MEN1 基因内含子改变 （9879384a/ g，9878352C/ T） 。26 例 PCC 肿瘤组织中 8 例发现 SDHD 所在区 域 11q23 的杂合性缺失， 频率为 30.8% 。26 例 PCC 肿 瘤组织中 7 例发现 M
13、EN1 所在区域 11q13 的杂合性缺 失， 频率为 26.9% 。未发现杂合性缺失与肿瘤表型之 间的联系。杂合性分析结果见表 1 和图 1。 表 1 PCC 杂合性缺失分析结果 病例 D11S198$ $8. % Mb D11S&( $9. $Mb D11S&%)1 )%. &Mb D11S& )9. (Mb D11S& 1$. 1Mb D11S198( 11. )Mb D11S1998 11). &Mb D11S*(* 1&%. 1Mb 1+ &+ %+ * (+ )+ 8V+V+ 9+ 1V 11+ 1$V 1(+ 18+ &+ &1+ &$+ &)+ &9+ %+ %1+V+ %&+
14、 %+ %*+ %$ %(+ %)+ SDHD 紧密连锁的 * 个微卫星多态性标记 D11S&、 D11S198(、 D11S1998 和 D11S*(*； MEN1 紧密连锁的 * 个微卫星多态性标记 D11S198$、 D11S&(、 D11S&%)1 和 D11S&； MEN1：(*. % Mb；SDHD：111. $ Mb； ： 杂合性缺失 （ratio , 1. $） ；+ ： 纯合现象；： 非杂合性缺失； V： 无信号 32 上 海 交 通 大 学 学 报（ 医 学 版 ）Vol. 26 图 1 肿瘤组织 （A） 和相应正常组织 （血液）（B） 的杂合性缺失图例 讨 论 SDHD
15、基因位于 11q23， 有 4 个外显子， 3 个内含 子， 长约 19 kb， 编码 159 个氨基酸构成的多肽链。 SDHD 参与线粒体复合物的呼吸链电子传递及三羧 酸循环中琥珀酸脱氢酶催化作用。近期的研究 6认 为 SDHD 作为抑癌基因参与 PCC 的发生。 SDHD 基因突变导致蛋白功能障碍， 这种功能缺 失引起细胞慢性缺氧状态， 最终引起细胞增生。研 究 7 - 8发现， 无论肾上腺或肾上腺以外的 PCC， 家族 性或散发性副神经节瘤， 均能发现一定比例的线粒 体复合物 II 亚单位编码基因 SDHD 种系突变。Neu- mann 等 9随访 271 例散发 PCC 患者， 发现
16、4% 的 SDHD 基因突变， 携带基因突变的患者临床表现为发 病年龄早 （中位数 25 岁） ， 多发部位肿瘤和肾上腺以 外 PCC 倾向。建议对 PCC 患者常规检测上述基因 以提高 对 伴 发 PCC 综 合 征 的 诊 断。尚 有 部 分 研 究 2 - 3， 10 - 11未发现散发性 PCC 中 SDHD 种系突变， 但在 SDHD 区域发现杂合性缺失。 在散发 PCC 中 SDHD 区域的杂合性缺失频率与 该基因突变频率的不一致现象， 提示在 SDHD 毗邻 区域可能有其他抑癌基因参与 PCC 的发生。目前已 知的两种与内分泌肿瘤相关的抑癌基因 SDHD 和 MEN1 均位于 1
17、1 号染色体长臂。同样有趣的现象发 生在 MEN1 区 域， 即 一 些 内 分 泌 肿 瘤 的 研 究 发 现 MEN1 区域的杂合性缺失频率与基因突变不一致 5。 SDHD 与 MEN1 在 PCC 发病机制中是否存在相互作 用， 迄今为止尚无有关报道。在本研究中， 我们发现 37 例 PCC 的 SDHD 和 MEN1 基因突变筛查未发现基 因突变。26 例 PCC 进行 SDHD 和 MEN1 区域的杂合 性缺失分析， 8 例发现 SDHD 所在区域 11q23 的杂合 性缺失， 频率为 30. 8% ； 7 例发现 MEN1 所在区域 11q13 的杂合性缺失， 频率为 26. 9%
18、 。但未发现杂合 性缺失与肿瘤表型之间的联系。SDHD 和 MEN1 区 域同时发生杂合性缺失的一致性近 80% ， 即 PCC 在 较长的 11q 区域发生杂合性缺失。由于未发现 2 种 抑癌基因突变， 提示在 11q13-23 区域可能存在未知 的抑癌基因参与肿瘤发生机制。扩大样本量和进一 步的精细定位研究， 将有助于发现 PCC 发病新基因。 【参考文献】 1 Gimm O，Armanios M，Dziema H，et al. Somatic and occult germ- line mutations in SDHD，a mitochondrial complex II gene，i
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