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1、书书书 基础医学研究 噬菌体展示 IgA 亲和体随机组合文库的构建 温宗梅1， 潘 卫2， 张玉侠1， 周 波1， 潘 欣2， 陈秋莉2， 周 霞2， 贾建安2， 蒋少华2， 邓松华1 摘要 目的 构建噬菌体展示 IgA 亲和体随机组合文库， 研 究 IgA 结合分子结构与功能的关系。方法 基因合成 IgA 亲和体 ZA1、 ZA2 片段。片段两端引入 Kpn I 酶切位点， 3 端 引入随机连接肽序列， Kpn I 酶切， 随机连接， 克隆于噬菌粒 展示载体 pCANTAB5S 的 Kpn I 克隆位点上， 转化大肠杆菌 TGI， 辅助噬菌体 M13K07 拯救， 构建噬菌体展示随机组合文
2、库。结果 基因合成 IgA 亲和体； 构建噬菌体展示 IgA 亲和 体随机组合文库， 容量为 3. 4 107， 滴度为 1. 6 1012TU/ L； 文库中含 79%以上的阳性克隆； 序列分析显示组合文库由 ZA1、 ZA2 随机组合而成， 连接方式符合随机连接的特点， 各 亲和体之间连接肽序列也呈随机分布。结论 合成 IgA 亲 和体， 构建噬菌体展示 IgA 亲和体随机组合文库， 该文库库 容量、 多样性和随机性可满足体外分子进化研究的要求。 主题词 细菌噬菌体/ 遗传学 自由词 亲和体； 组合文库； 随机连接肽 中图分类号 R 373. 9；R 394 文献标识码 A 文章编号 10
3、00 -1492 （2006） 04 -0361 -04 2006 -03 -24 接收 基金项目： 国家自然科学基金资助项目 （编号： 30472050） ；上海市科 技攻关项目 （编号： 05dz19317） ； 安徽省自然科学基金资助 项目 （编号： 050430706） 作者单位：1安徽医科大学病理生理学教研室， 合肥 230032 2 第二军医大学微生物学教研室， 上海 200433 作者简介： 温宗梅， 女， 28 岁， 硕士研究生； 邓松华， 男， 52 岁， 教授， 硕士生导师， 责任作者， E-mail： desoh126. com IgA 是人体重要的免疫球蛋白， 研究开发
4、高效 特异性检测和纯化 IgA 的试剂在广大医学领域中具 有非常重要的应用价值。IgA 亲和体是国外学者利 用定向分子进化技术将金黄色葡萄球菌蛋白 A 1的 Z 结构域随机突变构建文库 2， 以 IgA 为靶分子进 行亲和筛选， 得到的特异性结合 IgA 的结合分子 3。 IgA 亲和体只存在一个 IgA 结合位点， 而细菌天然 的 Ig 结合蛋白由多个高度同源的 Ig 结合单结构域 串联而成 4， 有研究表明多个 Ig 结合结构域有机串 联可产生明显高于单结构域的结合活性 5 -6； 并且 各结构域之间引入随机连接肽序列， 对其 Ig 结合功 能具有重要影响 7。因此，IgA 亲和体串联是否
5、能 实质性地提高 IgA 结合活性？IgA 亲和体的连接方 式是否影响其 IgA 结合活性？需要多少个亲和体串 联才能实质性地提高 IgA 结合活性？本研究构建噬 菌体展示 IgA 亲和体随机组合文库， 试图通过分子 进化的方法来回答上述问题。 1 材料与方法 1. 1 质粒与菌种 噬 菌 粒 展 示 载 体 pCANTAB- 5S 8、辅助噬菌体 M13K07、 E. coli Top10F 和 E. coli TGI 由第二军医大学微生物学教研室构建和保存。 1. 2 工具酶、 试剂 DNA Taq 酶为上海朝瑞公司产 品； 限制性内切酶 Kpn I、 碱性磷酸酶和 DL 2 000 DN
6、A Marker 为 TaKaRa 公司产品； Ligation High 连 接液为 ToYoBa 公司产品； DNA 凝胶回收试剂盒为 上海华舜公司产品； pMD-18T 试剂盒为 TaKaRa 公 司产品。 1. 3 引物序列 根据文献 3 发表的 IgA 亲和体 序列， 设计编码 IgA 亲和体 ZA1、 ZA2 序列的 8 条引 物。引入 Kpn I 酶切位点 （GGT ACC） 的上游引物 UB-1K： 5-GCT TGT GCG AAT GTG ACC AGC GTA CGC ACG GGT ACC GTT GAC AAC AAA TTC AAC-3； 引入 Kpn酶切位点和随机
7、连接肽编码序 列的下游引物 DB-1K： 5-ACG CTC TGT GCA CTC ACA TCT AGA GGT ACC SNN SNN SNN TTT CGG AGC CTG AGC GTC-3。用 于 噬 菌 粒 展 示 载 体 pCANTAB5S 中克隆片段的 PCR 扩增及测序引物， 上游引物 pCANTAB5S-1： 5-CAA CGT GAA AAA ATT ATT ATT CGC-3， 下游引物 pCANTAB5S-6： 5- GTA AAT GAA TTT TCT GTA TGA GC-3。以上引 物均委托上海英骏生物公司合成 （引物序列见表 1） 。 1.4 IgA 亲和
8、体的基因合成 以表 1 所示的 8 条 引物为模板，Overlap PCR 的方法扩增制备 IgA 亲 和体 ZA1 和 ZA2 片段， 各片段 PCR 产物回收纯化 后分别插入 pMD-18T 载体，试剂盒提取质粒， 鉴定 阳性单克隆， 委托上海英骏生物技术有限公司进行 序列测定。 1. 5 噬菌体展示 IgA 亲和体随机组合文库的构建 163安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2006 Aug； 41 （4） 表 1 基因合成 IgA 亲和体 ZA1、 ZA2 的引物 名称描述 序列 （53） Up-1通用上游引物GGG TCT AG
9、A GTT GAC AAC AAA TTC AAC AAA GAA A2-U-2ZA2 上游引物CGT GAA ATC CGT GAA CTG CCG AAC CTG AAC CAC CAG CAG AAA CTG GCT TTC A1-d-1ZA1 下游引物GGC AGC AGA CGG ATT TCC TGA GAA GCC TGG ATG GTT TCT TTG TTG AAT TTG TTG T A1-U-2ZA1 上游引物CAG GAA ATC CGT CTG CTG CCG AAC CTG AAC GGT CGT CAG AAA CTG GCT TTC A2-d-1ZA2 下游引物
10、GGC AGT TCA CGG ATT TCA CGA GAA GCG ATG ATT TTT TCT TTG TTG AAT TTG TTG T A1/2-U-3ZA1/2 上游引物ACC CGT CTC AGT CTG CTA ACC TGC TGG CTG AAG CTA AAA AAC TGA ACG ACG CTC A A1/2-d-2ZA1/2 下游引物GTT AGC AGA CTG AGA CGG GTC GTC CAG CAG AGA GTG GAT GAA AGC CAG TTT CTGC Down-3通用下游引物GGG TCT AGA TTT CGG AGC CTG AGC
11、 GTC GTT CAG TTT TTT 以克隆于 pMD-18 T 载体上的测序鉴定正确的 ZA1、 ZA2 为模板， 以 UB1-K、 DB1-K 为引物， 扩增携带 Kpn I 酶切位点和随机连接肽的 ZA1、 ZA2 片段， PCR 产物回收纯化后行 Kpn I 酶切回收纯化； 噬菌 粒载体 pCANTAB5S 质粒用 Kpn I + 碱性磷酸酶线 性化处理； 取 ZA1、 ZA2 酶切回收片段和线性化 pCANTAB5S 按 1 : 1 : 2 的比例用 Ligation High 连 接液按操作说明书进行连接反应。连接产物转化 E. coli TGI 感受态细胞， 2. 0 101
12、2TU/ L 的 M13K07 辅助噬菌体拯救， 制备噬菌体展示 IgA 亲和体随机 组合文库， 测定库容量。 1. 6 噬菌体展示 IgA 亲和体随机组合文库的滴度 测定及无菌试验 取 1 l IgA 亲和体随机组合文库 的噬菌体滤液 100 倍系列稀释， 感染对数生长期的 E. coli TGI， 计数不同稀释度的菌落数， 生长菌落数 的稀释倍数乘以 100 即为每毫升噬菌体的转化单位 数 （transformation unit， TU） ， 即滴度。无菌试验： 取 10 l IgA 亲和体噬菌体滤液涂 LB（氨苄） 平皿， 37 温箱过夜培养观察有无菌落生长。 1. 7 噬菌体展示 I
13、gA 亲和体随机组合文库的插入 片段检测 随机挑取 IgA 亲和体随机组合文库的单 克隆 44 个为模板，pCANTAB5S-1 和 pCANTAB5S-6 为引物， 进行 PCR 扩增， 设阳性对照和阴性对照。 1. 2%琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物， 在电泳图上 通过阳性对照和 Marker 比较判断组合文库中单克 隆插入片段的大小和分布情况。 1. 8 IgA 亲和体随机组合文库中组合分子的序列 测定 据 PCR 检测结果， 选择不同大小单克隆样品 9 个， 委托上海英骏生物技术有限公司进行序列测 定， 测序引物为 pCANTAB5S-1 和 pCANTAB5S-6， 测 序结果用
14、DNASTAR 软件分析， 根据测序结果分析 IgA 亲和体随机组合分子的构成形式和随机连接肽 的分布特性。 2 结果 2. 1 基因合成 IgA 亲和体 ZA1、 ZA2 片段 Over- lap PCR 的方法合成 IgA 亲和体 ZA1、 ZA2 片段， 分 别克隆于 pMD-18T 载体，IgA 亲和体理论值为 174 bp，合成的 ZA1、 ZA2 大小与理论值相符， 序列分析 与文献 3 提供序列完全一致。 2. 2 构建噬菌体展示 IgA 亲和体随机组合文库 以 ZA1、 ZA2 片段为模板，以 UB1-K、 DB1-K 为引 物， 制备两端携带 Kpn I 酶切位点 （GGT
15、ACC） 和3 端带有 3 个随机连接肽 （NNS NNS NNS） 的 ZA1、 ZA2 片段， 大小为 195 bp， 见图1 的第1、 3 条带； Kpn I 酶切后片段大小为 183 bp， 见图 1 的第 2、 4 条带。 通过与 DNA Marker 比较， ZA1、 ZA2 片段酶切前后 的大小与理论值相符。ZA1、 ZA2 片段酶切回收， 与 线性噬菌粒载体 pCANTAB5S 连接， 转化， 辅助噬菌 体拯救， 构建 IgA 亲和体随机组合噬菌体展示文库。 库容量为 3. 4 107， 滴度为 1. 6 1012TU/ L ， 无菌 试验为 0， 结果见图 1。 2. 3 噬
16、菌体展示 IgA 亲和体随机组合文库的插入 片段情况 PCR 检测组合文库的插入片段情况， 不 同大小插入片段在文库中的分布比例如下： 在 44 个 单克隆中， 插入 0 个结构域的即 5S 载体自连为 9 个， 百分比为 20%； 1 个结构域的为 27 个， 占 61%； 2 个结构域及以上的为 8 个， 占 18%； 阳性克隆比例 总计达 79%， 结果见图 2。 2. 4 IgA 亲和体随机组合分子的序列分析 挑取 不同大小的单克隆分子 9 个进行序列测定， 从测序 可见， 组合分子中 ZA1 和 ZA2 呈随机排列组合， 无 偏向性， 插入方向正向、 反向均有， 显示该文库中各 结构
17、域以随机方式连接组合， 并且随机连接肽的核 苷酸与氨基酸序列均不相同， 结果见表 2。 3 讨论 IgA 亲和体是一种人工设计筛选得到的新型 IgA结合分子， 在结构和功能特性方面， IgA亲和体 263安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2006 Aug； 41 （4） 图 1 IgA 亲和体 ZA1/ ZA2 片段酶切电泳图 M： DL 2 000 DNA Marker 图 2 IgA 亲和体组合文库插入片段的分布情况 1 22： 单克隆 PCR 产物； C： pCABTAB-5S 的 PCR 产物； M： DL 2 000 Mark
18、er 与细菌 Ig 结合分子的结合单结构域类似，如 SPA 和 Protein L 的 Ig 结合结构域由 5 个序列高度同源 的单结构域串联而成 9 -10， 这些单结构域虽然具有 Ig 结合活性， 但其结合能力远低于天然分子， 本研 究试图通过 IgA 亲和体随机串联构建噬菌体展示随 机组合文库， 以便使用体外分子进化的方法筛选得 到具有高结合活性的新型 IgA 亲和体分子， 研究和 阐述多结构域的组合和空间结构的变化对 IgA 结合 分子功能的影响。 本实验根据文献 3 提供的 IgA 亲和体序列， 设计合成 IgA 亲和体 ZA1、 ZA2 片段， 插入 pMD-18T 载体， 测序显
19、示我们合成的 IgA 亲和体 ZA1、 ZA2 序 列与文献 2 提供的序列完全一致， 大小与理论值 相符。 本实验所构建的 IgA 亲和体随机组合文库具有 以下特点： 为确保连接的多样性， 保证各结构域的结 合活性不会因重新连接组合而受到影响， 我们在各 结构域的 3 端引入 3 个氨基酸大小的随机连接肽 NNS NNS NNS， 与以往建库的方法 6比较， 随机连 接肽扩大了文库中重组分子的数量， 且能产生更多 结构和活性差异的重组分子， 增加了获得定向进化 分子的有效性。以 NNS 为随机连接肽， N 为 A/ T/ C/ G， 四种核苷酸中任意一种核苷酸， S 为 G/ C 2 种 核
20、苷酸之一， 这样的排列组合可以有效的避免终止 密码子的出现， 保证随机化的有效性和多样性 11。 本研究构建的 IgA 亲和体随机组合文库库容量为 3. 4 107， 滴度为 1. 6 1012TU/ L， 无菌试验为 0， 文 库插入片段的检测结果可见， 阳性克隆比例总计达 79%， 可满足体外分子进化试验的要求。并且文库 中阳性克隆随着插入片段数目的增加， 所占比例降 低， 符合重组克隆的规律。重组子的序列分析结果 表明组合文库中 2 种亲和体都存在， 且呈随机排列 组合， 无偏向性， 插入方向正向、 反向均有， 3 种随机 连接肽序列在核苷酸水平与氨基酸水平上均显示良 好的随机性。因此，
21、 我们所构建的组合文库在库容 量、 多样性与随机性方面能满足 IgA 分子进化筛选 的要求。 综上所述， 本实验构建了噬菌体展示IgA亲和 表 2 IgA 亲和体随机组合分子的序列分析 组合分子构成形式随机核苷酸序列随机氨基酸序列 5#A1AGG GCC ATCRAI 16#A2CGG TTC TACRFY 19#A1CGC GTC TTCRVF 10#A1-A2AGG CAC GGC-AAC CTG AACRHG-NLN 18#A1-A1AGG TCG CAC-GCG GGC CGCRSH-AGR 22#A2-A2AAC CCG AGC-ACG TGC CAGNPS-TCQ 23#A2R-A
22、2RCGC AGG ATC-AAG GCG TTGRRI-KAL 30#A1-A2CAG ATC ACG-ATC TGC ATGQIT-ICM 42#A2R-A1RGTG AAG GAC-GTG AAG GCGVKD-VKA R：反向序列 363安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2006 Aug； 41 （4） 体随机组合文库， 为应用 IgA 分子对该文库进行体 外进化筛选， 获得具有新型结合特性的 IgA 组合分 子， 研究 Ig 与 Ig 结合分子相互作用的分子机制建立 基础。本研究组已完成用人 IgA 分子作为配体对该 展示文库
23、的进化筛选， 获得了多种 IgA 结合分子的 新型结构， 目前正表达、 纯化这些分子， 进一步研究 其 Ig 结合特性， 相关研究结果将后续报道。 参考文献 1 Ibrahim S. Immunoglobulin binding specificities of the homology regions（domains）of protein A J . Scand J Immunol， 1993， 38 （4） ： 368 -74. 2 Lendel C， Dincbas-Renqvist V， Flores A， et al. Biophysical char- acterization o
24、f Z （SPA-1）- a phage-display selected binder to pro- tein A J . Protein Sci， 2004， 13 （8） ： 2078 -88. 3 Ronnmark J，Gronlund H，Uhlen M，et al. Human immunoglobu- lin A（ IgA） -specific ligands from combinatorial engineering of protein A J . Biochem， 2002， 269 （11） ： 2647 -55. 4 Kastern W，Sjobring U，Bjo
25、rck L. Structure of peptostreptococcal protein L and identification of a repeated immunoglobulin light chain - binding domain J . Biol Chem， 1992，267 （18） ： 12820 -25. 5 Svensson H G，Hoogenboom H R，Sjobring U. Protein LA，a no- vel hybrid protein with unique single - chain Fv antibody-and Fab- bindin
26、g properties J . Eur J Biol Chem， 1998， 258 （2） ： 890 -6. 6 徐 容，沈毅珺，邓松华， 等. 噬菌粒展示 proteinA 及 proteinL Ig 结合单结构域随机组合文库及 Ig 亲和筛选 J . 生物化学 与生物物理进展， 2005， 32 （6） ： 535 -43. 7 杨 华， 潘 卫， 李连青， 等. 噬菌体展示免疫球蛋白结合分子 单结构域随机组合文库的构建 J . 第二军医大学报， 2005， 26 （4） ： 396 -401. 8 徐 容， 潘 卫， 沈毅珺， 等. 新型噬菌体展示载体 pCANT- AB5S 的构
27、建 J . 安徽医科大学学报， 2004， 399 （2） ： 83 -6. 9 Tashiro M，Montelione G T. Structures of bacterial immunoglobu- lin - binding domains and their complexes with immunoglobulins J . Curr Opin Struct Biol， 1995， 5 （4） ： 471 -81. 10Kastern W，Sjobring U，Bjorck L. Structure of peptostreptococcal protein L and iden
28、tification of a repeated immunoglobulin light chain-binding domain J . Biol Chem， 1992，267 （18） ： 12820 - 5. 11沈毅珺， 潘 卫， 许 燕， 等. 噬菌体展示重组人淋巴毒素突变 体库及受体亲和筛选 J . 生物化学与生物物理进展，2005， 32 （1） ： 75 -80. Construction of phage-displayed random combinatorial library of IgA affibodies Wen Zongmei，Pan Wei， Zhang Y
29、uxia，et al （Dept of Pathophysiology，Anhui Medical University，Hefei 230032） Abstract Objective To construct a phage-displayed random combinatorial library of IgA affibodies，for studying the relationship between its structure and function. Methods The coding sequences of two affibodies，ZA1 and ZA2， we
30、re generated by Overlap PCR. The affibodies with the Kpn I recognition site in both ends and a random linking peptide in 3 terminal were synthesized by PCR and digested by Kpn I and ligated into the Kpn I site of the phagemid pCANTAB5S. The recombinants were transformed into E. coli TGI，and the phag
31、e-displayed random combinatorial library was constructed by the rescue of help virus M13K07. Results Both coding sequences of ZA1 and ZA2 affibodies were synthesized . The phage-displayed random combinatorial library were constructed. The li- brary consisted of about 3. 4 107clones with the titer of
32、 1. 6 1012TU/ L. More than 79% clones in the library were positive for insertion. Sequence analysis showed that inserted fragments of clones in the library were composed of the two single affibodies ligated randomly. The nucleotide acids encoding random linking peptide also distributed randomly. Con
33、clusion The coding sequences of ZA1 and ZA2 affibodies were synthesized. The phage-displayed random combinatorial library of IgA affibodies was constructed. The capacity，variety and random of the library meet the requirements for in vitro molecular evolution study. MeSH bacteriophages/ genetics Free words affibody；combinatorial library；random linking peptides 463安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2006 Aug； 41 （4）