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1、现代中西医结合杂志M o d e r nJ o u r n a lo fI n t e g r a t e dT r a d i t i o r l a lC K n e s ea n dw e s t e r nM e d i c i n e2 0 0 8Ju l ，1 7 ( 2 0 ) 啤酒花中蛇麻酮诱导细胞凋亡的实验研究 韩勇 ( 河北省卢龙县医院，河北卢龙0 6 6 4 0 0 ) 摘要】 目的 观察啤酒花中成分蛇麻酮对肿瘤细胞S G C 一7 9 0 1 和H e p G 一2 诱导细胞凋 亡的作用，并揭示其作用机制。方法采用M 1 v r 法观察蛇麻酮体外抗肿瘤作用，采用流式细胞
2、 仪观察蛇麻酮对肿瘤细胞周期及细胞凋亡的影响。结果蛇麻酮对肿瘤细胞S G C 一7 9 0 1 及 H 印G 一2 均有较好的疗效。蛇麻酮作用于S G C 一7 9 0 1 和H e p G 一2 细胞5 0h 后，肿瘤细胞均有 明显凋亡峰出现。嫱论蛇麻酮可以将肿瘤细胞S G c 一7 9 0 1 和H e p G 一2 的细胞周期阻滞在 G 0 G 】和S 细胞期，升高细胞凋亡指数。 关键词】啤酒花；蛇麻酮；抗肿瘤；细胞凋亡；细胞周期 中图分类号】R 一3 3 2 文献标识码】A 文章编号1 0 0 8 8 8 4 9 ( 2 0 0 8 ) 2 0 3 0 9 5 0 2 E x p e
3、r i m e n ts t d yo f I p u l O n ei nh u m u l 璐l u p u I 吣i n d 眦i 唱a p o p t 惦i s H a n Y o n g ( L u l o n gC c I u n t yH o s p i t a l ，L u l o n g0 6 6 4 0 0 ，H e b e i ，C h i n a ) A b s t n c t ：o b j e c t i v e 工ti st oo b s e r v et h ea c t i o no fl u p u l o n ei nh 哪u l u sl u p u l
4、u si n d u c i n ga p o p t 0 S i s0 nt u n l o rc e S ( 一 7 9 0 1a n dH e p G 一2a n dt or e v e a lt h em e c h a n i s m M e t h 似l sT h ea n t i t m o re f f e c t0 fl u p u l o n ei nv i t r ow 必o b s e n r e dw i t h M T Tm e t h o d T h ei n n u e n c eo f l u p u l o n eo nc e l lc y c l ea n
5、 da p o p t o s i so ft 啪o rc e l lw a so b s e r 、，e dw i t hn o wc ”o m e t e r R 鹤u l t s L u p u l o n eh a db o t hb e t t e rc u r a t i v ee f f e c t so nt u m o rc e l lS G C 一7 9 0 1a n dH e p G 一2 A f t e rl u p u l o n e “f e c t i n g0 nS G C 一7 9 0 1 a n dH e p G 一2f o r5 0h ，t 啪o rc d
6、 l sa l lh a da p p e a r e do b v i o u sa p o p t o s i sp e a k C c I 砸i o L u p u l o n ec a nb l o c kt h ec d lc y c l eo f t u n 科c e l lS G C 一7 9 0 1a n dH 印G 一2a tG 0 qa n dSp h a S ea n dc a nh e i g h t e na p o p t o s i si n d e x K e yw o r d s ：h u m u l u sl u p u l u s ；l u p u l o
7、 n e ；a n t i - t u n r ；a p o p t o s i s ；c e l lc ”1 e 啤酒花学名蛇麻，为大麻科律草属多年蔓生草本植物，其 主要成分是薇草酮和蛇麻酮。啤酒花中含量最多的为树脂 类成分，树脂可分为硬树脂及软树脂2 大类：硬树脂是指不溶 于低沸点的烷烃化合物；而软树脂是指溶于低沸点的烷烃化 合物，啤酒花中的软树脂类成分主要为a 一酸类及口一酸类化 合物。n 一酸类成分主要包括薛草酮( 又名酒花酮、香蛇麻 酯) 、异莓草酮A 、异薇草酮B 、类蓓草酮等。而_ B 一酸类成分 主要包括蛇麻酮、类蛇麻酮等 2 】。本实验主要研究啤酒花中 蛇麻酮的抗肿瘤作用并进
8、一步观察其对肿瘤细胞凋亡的诱导 作用，及对人胃癌细胞S G c 一7 9 0 l 与人肝癌细胞H 印G 一2 的 影响，以揭示其抗肿瘤作用机制 3 - 4 。 l实验材料 1 1 肿瘤细胞系人胃癌细胞S G C 一7 9 0 1 与人肝癌细胞 H 印G 一2 由中国医学科学院药物研究所提供。 1 2 试剂 R P MI 一1 6 4 0 培养基，G i b c o 产品；小牛血清。 G i b c 0 产品；F l u o 一3 A M 荧光探针，美国M o l e c u l a r P r o b e 公 司，D M S 0 ( 二甲基亚砜) 。 1 3 主要仪器设备超速离心机O P l
9、r M I A x L 一1 0 0 K ，贝克 曼公司；O 晓培养箱F o m l 3 1 2 l ，美国生命科学集团；酶标仪 【f 乍者简介】韩勇( 1 9 5 2 一) ，男，副主任药师，研究方向为抗肿瘤 药物及其他药物的临床应用。 E L 3 1 1 ，美国B 1 0 一T E K 公司；C o 一1 5 0 C 0 2 恒温培养箱，日 本O l 舯p u s ( 三洋) 公司；超净工作台S w C J 一2 F D ，中国苏 州苏净集团；流式细胞仪F A a 讫C a l i b u 。 2 实验方法 2 1肿比色分析法取对数生长期S G C 一7 9 0 l 与H 印G 一2 细胞
10、，用含1 0 胎牛血清的R P M I 一1 6 4 0 培养液调整细胞浓 度至5 1 0 4 个m L ，每孔1 0 0 肛L ，加样至9 6 孔板，3 7 体积 分数为5 C Q 培养箱中培养2 4h 后，倾去培养液，用蛇麻酮 及阳性药4 个浓度分别加入孔内，每一浓度加6 个平行孔，每 孔1 0 0p L ，使药物终浓度分别为10 0 0 、1 0 0 、1 0 、lm g L ，对照 组加同量培养液，体积分数为5 C q 的3 7 培养箱中培养 7 0h 后，倾去药液及培养液，每孔加入1 0 0 弘L 的M T T ( 0 5g L ) 继续孵育4h ，去上清，每孔加D M S o (
11、二甲基亚砜) 2 0 0 肚L ， T L 2 0 0 0 M M 一型振荡器振1 0m i n ，E L 3 “型酶标仪检测 各孔吸光度( A ) 值，依据测得的吸光度值计算抑制率及 I C 5 0 5 】。抑制率= ( 对照组平均吸光度值一给药组平均吸光 度值) 例照组平均吸光度值1 0 0 。 2 2 对细胞周期及细胞凋亡的影响选择对数生长期的 S G C 一7 9 0 l 与H e p G 一2 细胞，常规消化后，体积分数为5 a 现的3 7 培养箱中培养2 5h ，随机分为空白对照组、阳性 药组和给药组，终质量浓度分别为0 1 ，1 ，1 0m g L ，对照组加 入等量的培养液，阳
12、性药组为终质量浓度为1 0m g L 的阿霉 万方数据 3 0 9 6 现代中西医结合杂志M o d e mJ o u n do fI n t e g r a t e dT r a d i t i o n a lC h i n e s ea n dw e s t e mM e d i d n e2 0 0 8Ju l ，1 7 ( 2 0 ) 索。给药后1 8 ，2 4 和4 8h 各组分别取样到一次性试管，用质 量分数为7 0 的乙醇处理后于4 固定1 2h ，离心，P B S 液洗 涤除尽乙醇离心后悬于P I 染液中室温染色3 0m i n ，流式细胞 仪测定，以凋亡指数( A P O )
13、 表示细胞凋亡情况，A P o = 凋亡细 胞数所测细胞数1 0 0 。 3实验结果 3 1对肿瘤细胞抑制作用M 1 v r 实验的原理是根据活细胞 能将溴化四氮唑蓝还原为蓝紫色的可溶于D M S O 的甲簪化 合物，而死细胞则不能。溶于D M S 0 的甲簪化合物在5 7 0r l n l 处有较强的吸收峰，且此吸收值与活细胞数成较好的线性关 系。实验结果表明，蛇麻酮对肿瘤细胞有较强的抑制作用，见 表1 。 表1蛇麻酮对肿瘤细胞抑制作用 3 2 对细胞周期及细胞凋亡的影响蛇麻酮作用于S G C 一 7 9 0 1 和H e p G 一2 细胞5 0h 后，肿瘤细胞均有明显凋亡峰出 现，说明蛇
14、麻酮对s G C 一7 9 0 1 和H e p G 一2 的抑制作用与诱导 肿瘤细胞凋亡有关，细胞周期分析表明，加蛇麻酮将肿瘤细胞 s C 一7 9 0 1 和H e p G 一2 的细胞周期阻滞在G o G 1 和S 细胞 期，从而抑制细胞的增殖，如表2 、表3 所示。 表2蛇麻酮对S G c 一7 9 0 1 细胞周期的影响 4 讨论 细胞凋亡的概念在1 9 7 2 年首次由K e r r 等【6 】提出，并从 形态学的角度描述细胞的生理死亡，认为这是维持细胞动力 学平衡的一种基本生物学现象，同时指出其是在一定的生理 或病理条件下遵循自身的程序、自己结束生命的过程。它是 指像秋天树叶凋谢
15、一样，细胞在一定的生理或病理条件下，遵 循自身的程序，自己结束生命的生理性死亡。细胞凋亡是受 高度调节的一种生理性细胞死亡过程，是受基因调控主动连 表3 蛇麻酮H e p G 一2 细胞周期的影响 续的程序化反应。通过细胞凋亡的发生，使特定的细胞群体 在特定的时间和特定的部位死亡。从而使生物体在总体上保 持其细胞数量及形态和功能的平衡。细胞凋亡在肿瘤发生发 展和治疗中具有重要作用。诱导肿瘤细胞凋亡是许多天然药 物杀伤肿瘤的机制。天然药物诱导肿瘤细胞凋亡，已在实验 与临床实践中得到许多证实。凋亡细胞由于D N A 总量降低， 于正常G o G 1 细胞群前出现一D N A 低染细胞群，称为“A
16、O 细 胞群”或“亚G 】细胞群，S G l ”即凋亡细胞群，该现象被认为 是细胞发生凋亡的标志之一。本研究中，M 1 v r 法测得蛇麻酮 对S G C 一7 9 0 1 和H e p G 一2 半数抑制浓度I C 5 0 分别为0 2 9 m g L 和0 7 9m g L ，说明其对S G C 一7 9 0 1 和H e p G 一2 都有 明显的细胞毒性作用。从流式细胞仪检测结果可以看出，蛇 麻酮作用于S G c 一7 9 0 1 和H e p G 一2 细胞5 0h 后，肿瘤细胞 有明显凋亡峰出现，说明蛇麻酮对S G c 一7 9 0 1 和H e p G 一2 的 抑制作用与诱导肿
17、瘤细胞凋亡有关。通过对给药后细胞凋亡 的观察，蛇麻酮主要将这2 种肿瘤细胞的细胞周期阻滞在 G 0 G l ，S 细胞期，诱导细胞凋亡，实验测得细胞凋亡指数也反 映出这一特点。给药后相应时间段凋亡指数较空白对照组明 显升高。 【参考文 献】 1 肖祟厚中药化学 M 上海：上海科学技术出版社，1 9 8 7 ：4 0 2 2 雷敬敷酒花中a 一酸的含量及其影响因素 J 食品科学， 1 9 9 4 。1 5 ( 2 ) ：1 2 1 5 3 陆豫，王远兴，吴芬反相液相色谱法测定啤酒花浸膏中的口一 酸和8 一酸 J 南昌大学学报，2 0 0 2 ，2 6 ( 1 ) ：7 9 8 1 4 季宇彬，李
18、明泽，邹翔。等啤酒花中蛇麻酮诱导细胞凋亡及机 制研究 J 哈尔滨商业大学学报( 自然科学版) ，2 0 0 7 ，2 4 ( 2 ) ： 1 2 9 1 3 3 5 季宇彬高世勇。张秀娟羊栖菜多糖体外抗肿瘤作用及其诱导 肿瘤细胞凋亡的研究 J 中草药，2 0 0 3 ，3 4 ( 7 ) ：6 3 8 6 4 0 【6 K e r rJ F ，w y u i eA H ，C u r T i eA R A p o p t 西：ab 船i c b i o l o g i c a Ip h e n o m e n o nw i t hw i d e r a n g i n gi I 】1 p h c B t i o i I lt i 韶K i I l e t i 鹊 J B rJ C 如c e r 。1 9 7 2 ，2 6 ( 4 ) ：2 3 9 2 5 7 收稿日期】2 0 0 8 一0 2 一0 1 万方数据