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1、C H I N E S E J O U R N A L O F A N A T O MY V o l . 2 9 N o . 2 2 0 0 6解剖学杂志2 0 0 6 年第2 9 卷第 2 期 地塞米松对豚鼠耳蜗缺血再灌注损伤后细胞凋亡的影响“ 郑鸣 王丰“ 梁书锋 ( 1 福建医科大学解剖学与组织胚胎学系， 福州3 5 0 0 0 4 ; 2 福建中医学院解剖学教研室， 福州3 5 0 0 0 1 ) 摘要目 的: 研究地塞米松对缺血再灌注损伤及细胞凋亡的防治作用。方法: 健康豚鼠， 随机分成正常组、 假手 术组、 地塞米松干预后假手术组、 模型组和干预组( 地塞米松术前腹腔注射) 。后2
2、 组各在缺血3 0 m in 、 再灌注 6 h 及2 4 h 取材。 用T U N E L 法观 察耳蜗缺血及 不同 时间 段内 再灌注的 细 胞凋亡情况， 并与地塞米 熟 扮 干预 后进 行比 较。结果: 干预组的螺旋神经节及螺旋器( C o r t i 器) 较模型组在每个时间点上凋亡小体减少。结论: 地塞米 松可通过抑制诱导型一氧化氮合酶使凋亡细胞明显减少。 关键词缺血再灌注; 细胞凋亡; 地塞米松; 耳蜗; 豚鼠 E f f e c t o f d e x a m e t h as o n e o n c e l l a p o p t o s i s o f i s c h e m
3、 i a - r e p e r f u s i o n i 帕u r e d c o c h l e a r o f g u i n e a p i g s Z H E N G Min g ， WA N F e n ， L I A N G S h u - F e n g ( 1 . D e p a r t m e n t o f A n a t o m y a n d Hi s t o - e m b r y o l o g y ， F u j i a n Me d i c a l U n i v e r s i t y ， F u z h o u 3 5 0 0 0 4 , C h i n
4、 a ; 2 . D e p a r t m e n t o f A n a t o m y ， F u j i a n T r a d i t i o n a l Me d i c i n e C o l l e g e ， F u z h o u 3 5 0 0 0 1 ， C h i n a ) A b s t r a c t 澎e c t i v e : T o o b s e r v e t h e c e l l a p o p t o s i s i n c o c h l e a r a f t e r i s c h e m i a - r e p e r f u s i o
5、 n i n d i f f e r e n t t i m e s a n d i n - v e s t i g a t e t h e e f f e c t o f d e x a m e t h a s o n e o n i t . Me t h o d s : H e a l t h y g u i n e a p i g s w e r e r a n d o m l y d i v i d e d i n t o t h e n o r m a l g r o u p , s h a m o p e r a t io n g r o u p , s h a m o p e r
6、 a t i o n g r o u p a f t e r t h e a p p l i c a t io n o f d e x a m e t h a s o n e , m o d e l a n d d r u g t r e a - t e d g r o u p , w h i c h w a s g iv e n d e x a m e t h a s o n e 2 m g / k g 3 0 m i n b e f o r e o n s e t o f i s c h e m i a . E a c h g r o u p h a d 8 g u in e a p i
7、g s . I n t h e l a s t 2 g r o u p s t h e s a m p l e s w e r e t a k e n a t 3 0 m i n a f t e r i s c h e m i a , 6 h o u r s a f t e r r e p e r f u s i o n a n d 2 4 h o u r s a f t e r r e p e r f u s i o n , r e s p e c t i v e l y . T h e c e l l a p o p t o s i s w a s d e t e c t e d b y
8、T U N E L . R e s u l t s : T h e r e w e r e f e w e r a p o p o t i c b o d i e s i n t h e s p i r a l g a n g l io n a n d t h e C o r t i i n d e x a m e t h a s o n e g r o u p t h a n t h o s e i n t h e m o d e l g r o u p . C o n c l u s i o n s : D e x a m e t h a s o n e c a n d e p r e s
9、 s t h e c e l l a p o t o s i s , m e d i a t e d b y i n h i b i t io n o f i N O S . K e v w o r d s i s c h e mia - r e p e r f u s i o n ; a p o p t o s i s ; d e x a m e t h a s o n e ; c o c h l e a r ; g u i n e a p i g 缺血再灌注使局部组织微循环障碍而导致细 胞的坏死， 如内耳微循环障碍常引起突发性耳聋 等。 周伟等 I 建立新生大鼠 缺氧缺血损伤( H D 动
10、 物模型， 发现在 H I 前给予地塞米松预处理能显著 减少脑细胞的凋亡。为观察缺血再灌注耳蜗组织细 胞的损伤及地塞米松干预后的变化， 本文建立豚鼠 椎基底动脉缺血再灌注动物模型， 观察耳蜗缺血及 不同时间 段内 再灌注的细胞凋亡情况， 探讨地塞米 松对缺血再灌注损伤后细胞凋亡的影响。 1 材料和方法 1 . 1 实验动物与分组 健康豚鼠7 2 只， 雌雄不拘， 由福建医科大学 福建省科学技术厅资助项目( K 0 2 0 7 4 ) 收稿日 期: 2 0 0 5 - 1 2 - 2 8 ; 修回日 期: 2 0 0 6 - 0 1 - 1 0 一2 3 8 一 动物中心提供。随机分成正常组、
11、假手术组、 地塞 米松干预后假手术组、 模型组和干预组( 地塞米松 术前腹腔注射) 。 后二组各在缺血3 0 m i n ( I S ) 、 再 灌注6 h ( I / R 6 ) 和 2 4 h ( I / R 2 4 ) 取材。每组各 8 只。 1 . 2 动物模型的建立 1 0 % 水合氯醛( 1 5 0 m g / k g ) 腹腔注射麻醉， 颈 前正中切口， 分离各层组织， 暴露甲状颈干及其分 支椎动脉和锁骨下动脉， 并分离一侧颈总动脉。 烧灼双侧椎动脉， 并以微动脉夹夹闭颈总动脉后 计时。 再灌注时松开微动脉夹， 手术显微镜下观 察到血液复流即开始计时。 再灌注6 h 或2 4 h
12、 取 组织。干预组在缺血前3 0 m i n 腹腔注射地塞米松 2 m g / k g ， 加生理盐水0 . 5 M I . 1 . 3 耳蜗组织H - E染色 4 %多聚甲醛0 . 1 m o l / L磷酸缓冲液动脉灌 注， 断头取出听泡， 置于上述固定液中4 后固定 2 4 h , 1 0 g / L E D T A脱钙7 - 1 0 d ， 常规脱水、 石蜡 包埋、 切片、 H - E染色， 光学显微镜下观察耳蜗组 织毛细胞及血管纹等结构变化。另备切片用于耳 蜗组织细胞凋亡检测。 1 . 4 耳蜗组织细胞凋亡检测 石蜡包埋的切片常规脱蜡人水。用蛋白酶K 仁 2 0 r .k / m l
13、 溶于0 . 0 1 m o l / L T r i s / H C L ( p H 7 . 4 - 7 . 8 ) 中 室温孵育 1 5 m i n . 3 %双氧水孵育 1 0 m i n ， 高压修复 1 m i n 。正常血清封闭2 0 m i n , 甩干后加 5 0 川的T U N E L 反应混合溶液， 在湿盒 中3 7 0C 孵育6 0 m i n 。滴加转化剂P O D , 3 7 0C 孵育 3 0 m i n 。甩干后每张切片加 1 0 0川新鲜配制 ( 3 m i n 内) 的D A B 液， 显微镜下观察， 控制染色时 间， 显色约3 m i n ， 流水冲洗。阴性对
14、照用P B S 代 替T U N E L 反应混和溶液。 结果判定: 细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性 颗粒。每张切片于2 0 倍目 镜下随机取 3 个视野， 计算每个视野内单个 C o r t i 器和单个螺旋神经节 中凋亡细胞数， 取其平均值为该切片的凋亡细 胞数。 1 . 5 统计学分析 运用S P S S 统计软件进行统计学分析。多个 样本均数差异的显著性检验应用方差分析。 2 结果 2 . 1 耳蜗组织病理变化 正常组耳蜗 H - E染色见 C o r t i 器毛细胞无损 伤， 血管纹清晰。假手术组C o r t i 器毛细胞也无损 伤， 血管纹边缘清晰。地塞米松干预后的假手术 组与前
15、者无差别。模型组耳蜗 C o r t i 器毛细胞缺 失、 倒伏， 血管纹变薄。其中以缺血 6 h 组损伤最 严重。干预组豚鼠耳蜗毛细胞亦有缺失、 倒伏， 部 分血管纹变薄， 但程度较模型组为轻。 2 . 2 耳蜗组织细胞凋亡变化 正常组、 假手术组、 地塞米松干预后的假手术 组的螺旋神经节细胞及毛细胞基本无凋亡， 偶见 个别凋亡小体， 3 组间差别无显著性差别。 模型组 及干预组缺血及再灌注不同时间点均见螺旋神经 节与C o r t i 器毛细胞上有棕黄色颗粒的凋亡小体， 与正常组及假手术相比有非常显著性差别 ( P 0 . 0 1 ) 。 模型组螺旋神经节和C o r t i 器毛细胞 上
16、再灌注6 h 及2 4 h 组较缺血3 0 m i n 组凋亡小体 非常明显增多( P 0 . 0 1 ) 。干预组再灌注 6 h 组 及2 4 h 组较相应缺血3 0 m i n 组凋亡小体明显增多 ( P 0 . 0 1 ) 。 干预组较模型组在每个时间点上凋 亡小体都有减少， 差别有显著性差别( P 0 . 0 5 ) 0 统计结果见附表。 附表各组螺旋神经节和C o r t i 器单视野下凋亡细胞数( x 士s ) T a b T h e n u m b e r o f a p o p t o t i c ce l l s i n s i n g l e v i s u a l f i
17、 e l d in e v e r y g ro u p o f g u i n e a p i g ( x 士s ) Mo d e l g r o u pD r u g g r o u p G r o u p N o r m a l N C I S I / R 6 I / R 2 4 I / R 6 I / R 2 4 黝r a l g a n g l io n 0 . 2 士0 . 1 3 0 . 3 士0 . 1 5 4 . 6 士0 . 3 0 . . C o r t i 0 . 1 +0 . 1 0 0 . 2 士0 . 1 3 1 . 5 士0 . 2 6 二 6 . 4 士0 .
18、 3 0 * * 0 0 8 . 6 士0 . 3 4 * 4 . 5 士0 . 4 2 * 0 0 5 . 7 士0 . 3 0 0 . 2 十0 . 1 3 0 . 1 十0 . 1 0 2 . 4 士0 . 2 2 * * A 5 . 5 士0 . 2 2 * * A 5 . 6 士0 . 2 2 * 1 . 3 士0 . 2 1 - 2 . 9 士0 . 2 3 “ 0 “2 . 6 士0 . 1 6 - A L A P0 . 0 1 z s n o r m a l ; P0 . 0 1 V S I S ; A P0 . 0 5 v s m o d e l g r o u p 3 讨论
19、 细胞的死亡有两种形式: 一种是坏死， 另一种是 凋亡 2 1 。 坏死是病理性细胞死亡， 发生于细胞的过 度损伤。 凋亡是一种正常的生理性细胞死亡， 发生 于个体发育及祛除功能异常或有害的细胞 3 。 凋亡 细胞发生的生物化学改变使D N A在核小体之间被 切断， 并导致基因组D N A降解， 形成在琼脂电 泳上 的以大约1 8 0 -2 0 0 个碱基对为特性的“ 梯形” ( l a d - d e r ) 结构分布 4 。 另外， 组织性转谷氨酞氨激活， 在 脂质膜下形成蛋白网， 从而防止细胞内 容物外溢， 并 在形成凋亡小体的过程中 起重要作用 5 。 大量研究 资料表明， 细胞凋亡是
20、在基因控制下的细胞主动死 亡， 存在主动合成蛋白 质的过程， 可被由D N A合成 或蛋白 质合成的 抑制剂阻断过程困。 缺血再灌注损伤( I / R ) 是一种常见的临床病 理生理过程， 既往人们认为 I / R的最终结局均为 细胞死亡， 即坏死。但目 前的研究表明细胞凋亡 可能在 I / R损伤的病理过程中起重要作用。在 心、 脑、 肾 及肝等组织中均发现缺血再灌注损伤下 出现凋亡与坏死同时存在 7 - 9 ， 而且凋亡的程度与 I / R的生物化学与病理学参数平行， 呈正相关。 我 ， 们的实验结果也显示正常组及假手术组没有或仅 有个别部位出现细胞凋亡， 缺血及再灌注各组内、 外毛细胞及
21、螺旋神经节部位凋亡细胞明显增多， 与正常组及假手术组间有显著差异。 地塞米松与细胞凋亡间的关系较为复杂， 已 有研究证实， 地塞米松是胸腺细胞凋亡的诱导剂， 一2 3 9 一 能在体内、 体外诱导胸腺细胞凋亡p o ， 这种现象同 样见于肿瘤细胞。但近年来的研究证实， 地塞米 松也可抑制凋亡。 周伟等川考虑细胞凋亡受多种 基因的调控， 地塞米松对基因转录可能具有直接 或间接的作用。有研究发现， 新生动物脑 H I 后其 脑组织中即早基因c - f o s , c 一 u n m R N A的表达及 蛋白合成明显增加， 而经地塞米松预处理的新生 动物其表达则显著减弱口 ， 因而推测地塞米松的 神
22、经保护作用可能与这些基因表达的改变有关， 提示地塞米松的作用发生在凋亡过程的早期， 或 在于预防凋亡程序的激活。同时， 通过前期的实 验， 我们得出在I / R中地塞米松能够抑制 i N O S的 表达的结论， 而i N O S 及其产生的N O诱导细胞凋 亡已经有较明确的共识， 由此提示地塞米松通过 抑制i N O S 而抑制细胞凋亡。我们的实验结果也 显示螺旋神经节及 C o r t i 器上干预组较模型组在 每个时间点上凋亡小体都有减少， 差别有显著性 意义， 表明地塞米松对细胞凋亡确有抑制作用。 E l l i s R E, Y u a n J Y, Ho r v i t z o f
23、c e l l d e a t h . An n u Re v C e l l Me c h a n i s ms a n d f u n c t i o n s 1 9 9 1 P a y n e C M, B e r n s t e i n H, B e r n s t e i n C , e t a l 6 6 3 - 6 9 8 . .R o l e o f a p o p t o - 参 考 文 献 周伟， 吴圣媚， 陈惠金. 地塞米松对脑缺氧、 缺血迟发性神 经元死亡的保护作用. 上海医学， 2 0 0 0 , 2 3 ( 2 ) : 8 1 - 8 3 . R a f f MC
24、. S o c i a l c o n t r o l s o n c e l l s u r v i v a l a n d c e l l d e a t h . Na t u r e , 1 9 9 2 , 3 5 6 ( 6 3 6 8 ) : 3 9 7 - 4 0 0 . s i s i n b i o l o g y a n d p a t h o l o g y : r e s i s t a n c e t o a p o p t o s i s i n c o l o n c a r c i n o g e n e s i s . U l t r a s t r u c t
25、 P a t h o l , 1 9 9 5 : 1 9 ( 4 ) : 2 2 1 - 2 4 8 C a r s o n D A, R i b e i r o J M. A p o p t o s i s a n d d i s e a s e . L a n c e t , 1 9 9 3 , 3 4 1 ( 8 8 5 5 ) : 1 2 5 1 一 1 2 5 4 . P u s h k a r e v a M, O b e i d L M, H a n n u n Y A . C e r a m i d e : a n e n - d o g e n o u s r e g u l
26、 a t o r o f a p o p t o s i s a n d g r o w t h s u p p r e s s i o n . I m - m u n o l T o d a y , 1 9 9 5 : 1 6 ( 6 ) : 2 9 4 - 2 9 7 . G o t t l i e b R A , B u r l e s o n K O , K l o n e r R A, e t a l . R e p e r f u s io n i n j u r y i n d u c e s a p o p t o s i s i n r a b b i t c a r d i
27、 o my o c y t e s . J C l i n I n - v e s t , 1 9 9 4 , 9 4 ( 4 ) : 1 6 2 1 - 1 6 2 8 . T o m i n a g a T , K u r e S , N a r i s a w a K , e t a l . E n d o n u c l e a s e a c t i - v a t io n f o l l o w i n g f o c a l i s c h e m ic in j u r y i n t h e r a t b r a i n . B r a i n R e s , 1 9 9
28、 3 , 6 0 8 ( 1 ) : 2 1 - 2 6 . G o b e G C , A x e l s e n R A, S e a r l e J W. C e l l u l a r e v e n t s i n e x p e r i - m e n t a l u n i l a t e r a l i s c h e m ia r e n a l a t r o p h y a n d i n r e g e n e r a t io n a f t e r c o n t r a l a t e r a l n e p h r e c t o m y . L a b I n
29、 v e s t , 1 9 9 0 , 6 3 ( 6 ) : 7 7 0 - 7 7 9 . 潘景轩， 朱振宇， 李惠玲， 等.糖皮质激素诱导大鼠胸腺细胞 程序性死亡研究.中国免疫学杂志， 1 9 9 6- , 1 2 ( 4 ) : 2 2 8 - 2 3 0 . E k e r t P , Ma c L u s k y N , L u o X P , e t a l . D e x a m e t h a s o n e p r e - v e n t s a p o p t o s i s in a n e o n a t a l r a t m o d e l o f h y p
30、o x i c - i s c h e m i c e n c e p h a l o p a t h y ( H I E ) b y a r e a c t i v e o x y g e n s p e c ie s - i n d e p e n d - e n t me c h a n i s m B r a i n R e s , 1 9 9 7 , 7 4 7 ( 1 ) : 9 - 1 7 . ( 编辑: 许家军) ( 上接 2 3 5页) 后按标题顺序采用纲要式、 表格式、 图解式或口诀式等手 法准确概括、 归纳学习内容。根据内容特点在适当部位穿 插设计“ 临床导读” ， 为临
31、床搭桥服务。举例: 肩关节: ( 1 ) 构成: 由脓骨头与肩脚骨的关节孟构成。( 2 ) 特点: 肪骨头大， 关节盂小而浅， 边缘附有孟唇; 关节囊薄而 松弛; 关节前后部和上部有腔纤维和韧带加强， 下部薄 弱; 关节运动灵活。( 3 ) 运动形式: 可作屈、 伸、 内收、 外 展、 旋内、 旋外和环转运动。临床导读: 肩关节是人体易发 生脱位的关节之一， 由于其下部结构相对薄弱， 当上肢极 度外展时， 舷骨头易向下方脱位; 肩关节周围的肌、 膛、 关 节囊等软组织发生炎症时， 可引起肩关节疼痛、 活动受限 等临床表现， 临床上称肩周炎。 2 . 2 名词解释、 填空练习 对于概念、 基础知
32、识和较直观的形态学知识， 设计成 此类材料有利于学生课前预习和记忆， 为提高教学起点和 深人学习打下良好基础。 2 . 3 选择练习 可设计为单项选择练习和多项选择练习两种形式， 适 用于概念容易混淆、 形态结构复杂、 知识点较多， 需深人理 解、 仔细区分、 认真识记的内容。设计时要目的明确、 针对 性强、 启发性强， 避免直白、 无味， 难易度要循序渐进。举 例: ( 1 ) 单项选择练习: 心室舒张时， 防止血液逆流的装置 有: A . 二尖瓣和三尖瓣; B . 主动脉瓣和二尖瓣; C . 肺动脉 瓣和三尖瓣; D . 主动脉瓣和肺动脉瓣。( 2 ) 多项选择练习: 支配眼球外肌运动的脑
33、神经有: A . 动眼神经; B . 眼神经; C . 展神经; D . 滑车神经。 一2 4 0 一 2 . 4 问答练习 对教材中理论性较强、 相关知识内在联系密切、 临床 应用较多的内容， 可设计成此类材料。设计时要注重它的 启发性、 趣味性和实用性， 力求达到激发学生兴趣、 积极探 索、 巩固知识的目的。举例: ( 1 ) 臀部肌肉注射或手背静脉 注射抗生素治疗阑尾炎， 药物经哪些途径到达阑尾? ( 2 ) 针 刺手指后感到疼痛， 简述痛觉的传导通路。 3 指导材料的应用 3 . 1 课前预习 学生在学习纲要的指导下阅读教材， 并进行名词解 释、 填空练习等初步训练， 达到明确学习目 标、 了解内容概 要和初步掌握基本概念的目的， 为课堂教学顺利进行打下 良好基础。 3 . 2 课堂教学 要求学生根据指导材料和预习时已掌握的知识， 把握 听课的重点和难点， 结合选择练习和问答练习中提出的问 题有目的地听讲和思考。 3 . 3 课后复习 学生根据自身的认知层次， 对指导材料进行全面复习 或针对性复习， 并通过习题训练达到巩固知识的目的。 4 结论 笔者将指导材料应用于人体解剖学教学中， 效果显 著。 通过实践笔者深刻体会到， 指导材料的科学设计和合 理应用能有效发挥学生的主体作用， 增强师生的合作， 避 免学习的盲目 性， 从而提高教学效率。 ( 编辑: 黄会龙)