型特异性引物PCR技术在HBV基因分型中的应用.pdf

《型特异性引物PCR技术在HBV基因分型中的应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《型特异性引物PCR技术在HBV基因分型中的应用.pdf（4页珍藏版）》请在三一文库上搜索。

1、第 3 5 卷第 2 期第 1 9 1 页 2 0 0 6 年 4 月 华中科技大学学报( 医学版) A c t a Me d Un i v S c i T e c h n o l Hu a z h o n g Vo l . 3 5No . 2 P Ap r . 2 : ; 型特异性引物 P C R技术在 H B V基因分型中的应用 宋世会齐俊英邢铭友杨道锋张振纲肖非马科田德英 华中 科技大学同济医学院附属同济医院感染科， 武汉4 3 0 0 3 0 摘要目的应用乙型肝炎病毒( H B V ) 型特异性引物P C R的基因分型方法， 了解武汉地区 H B V基因型的分布及 其临床意义。方法选择

2、 2 9 8 例 H B V感染者， 分成表面抗原携带者( A S C ) 、 急性肝炎( A H) 、 慢性肝炎( C H) 、 重型肝炎 ( S H) 、 肝硬化( L C ) 和原发性肝癌( H C C ) 6 组， 用多对型特异性引物 P C R方法检测 H B V的基因型; 并对 4份血清 H B V D N A进行序列分析。结果多对型特异性引物P C R法可简便、 快速、 准确地鉴定H B V基因型; 2 9 8 份 H B V D N A阳性 的血清标本中， B 基因型 1 9 7 例( 6 6 . 1 Y o ) , B C混合型6 8 例( 2 2 . 8 %) , C基因型

3、 3 3 例( 1 1 . 1 %) ; B基因型在 A S C , A H , C H, S H和 H C C组患者中均占绝对优势， 分别为6 3 . 6 %, 7 1 . 9 0 0 , 6 8 . 7 %, 8 9 . 5 %和6 5 . 9 0 o , C基因型在各组患者中的分 布差异无显著性意义， B C混合基因型在各组患者中的分布存在差异. 更多见于肝硬化患者; 各基因型在 A L T水平、 H B e A g 阳性率及 H B V D N A水平上差异无显著性意义( 均 P 0 . 0 5 ) , 结论多对型特异性引物 P C R扩增法能快速准 确地进行 H B V基因分型检测，

4、 可用于大规模的流行病学调查; 武汉地区H B V感染者中， 优势基因型为 B型， 其次为 B C 混合型和C型， B C混合型更多见于肝硬化患者。 关健词肝炎病毒， 乙型; 基因型; 型特异性引物 中圈法分类号R 5 1 2 . 6 2 S t u d y o n G e n o t y p e s o f H B V b y P C R U s i n g T y p e - s p e c i f i c P r i m e r s S o n g S h i h u i ， Q i J u n y i n g 0 ， X i n g Mi n g y o u e t a l D e p

5、 a r t m e n t o f I n f e c t i o u s D i s e a s e s ， T o n g j i Ho s p i t a l ， T o n g j i Me d i c a l C o l l e g e ， Hu a z h o n g U n i v e r s i t y o f S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y， Wu h a n 4 3 0 0 3 0 A b s t r a c t O b j e c t i v e T o s t u d y t h e d i s t r i b u t

6、i o n o f h e p a t i t i s B v i r u s( H B V) g e n o t y p e s i n Wu h a n d e t e c t e d b y u s i n g t y p e - s p e c i f i c p r i m e r s P C R a n d i t s c l i n i c a l s i g n i f i c a n c e . Me t h o d s 2 9 8 p a t i e n t s w i t h HB V i n f e c t i o n i n c l u d i n g a s y m

7、p t o ma t i c HB V c a r - r i e r s ( A S C ) ， a c u t e h e p a t i t i s ( A H ) ， c h r o n i c h e p a t i t i s ( C H) ， s e v e r e h e p a t i t i s ( S H) ， l i v e r c i r r h o s i s( I _ C ) ， a n d h e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o m a ( H C C ) w e r e c o l l e c t e d a n d

8、 t e s t e d f o r H B V g e n o t y p e s b y t h e mu l t i p l e x t y p e - s p e c i f i c p r i m e r s P C R . D i r e c t s e q u e n c e w a s p e r f o r m e d t o d e t e c t H B V D N A o f 4 p a t i e n t s . R e s u l t s A s i m p l e a n d p r e c i s e g e n o t y p i n g m e t h o

9、d b a s e d o n P C R u s i n g t y p e - s p e c i f i c p r i m e r s w a s d e v e lo p e d f o r t h e d e t e r m i n a t io n o f g e n o t y p e s o f H B V . O f t h e 2 9 8 p a t i e n t s , 1 9 7 ( 6 6 . 1 %) w e r e g e n o t y p e B , 6 8 ( 2 2 . 8%) w e r e m i x e d g e n o t y p e B a

10、 n d C a n d 3 3 ( 1 1 . 1%) w e r e g e n o t y p e C . G e n o t y p e B w a s p r e v a l e n t i n A S C A H， C H, S H a n d H C C p a t i e n t s . B a n d C m i x e d g e n o t y p e i n L C p a t i e n t s w a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n o t h e r s . I n d i f f e r e n t

11、 g e n o t y p e s t h e A L T v a l u e , p o s i t i v e r a t e o f HB e A g a n d H B V D N A v a l u e h a d n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e . C o n c l u s i o n T y p e - s p e c i f i c p r i m e r s P C R a s s a y i s s i m p l e a n d p r e c i s e t o t e s t H B V g e n o

12、t y p e . G e n o t y p e B i s t h e d o m i n a n t g e n o t y p e o f H B V, a n d B a n d C m i x e d g e n - o t y p e a n d g e n o t y p e C e x i s t i n Wu h a n . B a n d C m i x e d g e n o t y p e i n L C p a t i e n t s i s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n o t h e r s . T

13、h e r e i s n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e i n t h e A L T v a l u e , p o s i t i v e r a t e o f H B e A g a n d H B V D N A v a l u e a m o n g d i f f e r e n t g e n o t y p e s . K e y w o r d s h e p a t i t i s B v i r u s ; g e n o t y p e s ; t y p e - s p e c i f i c p r i

14、m e r s 目前根据乙型肝炎病毒( h e p a t i t i s B v i r u s , H B V ) 全基因序列的异质性)8 %或 S 基因序列的 异质性)4 %， 将 H B V分为A, B , C , D , E , F , G和H 8 种基因型。人类感染 H B V的基因型别可能与感 染途径、 疾病进展以及抗病毒药物疗效有一定的相 关性。目前 H B V基因分型的方法主要有: 全基因 宋世会， 女， 1 9 7 9 年生， 硕士研究生 n 通讯 作者. C o r r e s p o n d i n g a u t h o r 或S 基因序列测定法; 聚合酶链反应一 限

15、制性片断 长度多态性( P C R - R F I . P ) 分析法;型特异性引物 P C R法;P C R微板核酸杂交一 E L I S A方法。由于 HB V基因型的分布存在着地区差异， 因此有必要建 立一种简单易行的基因分型方法， 以进行大规模的 流行病学调查。本实验采用型特异性引物P C R扩 增法对武汉地区 HB V感染者的血清 D N A进行了 检测和分析， 现报道如下。 1 .9 2 华中科技大学学报( 医学版)2 0 0 6 年 4 月第 3 5 卷第 2 期 1 对象与方法 1 . 1 病例 选择2 9 8 例 H B V D N A阳性的感染者， 男性 2 5 7 例，

16、女性 4 1 例， 平均年龄 3 5 . 8岁， 其中表面抗 原携带者( A S C ) 5 5例、 急性肝炎( AH) 3 2例、 慢性 肝炎( C H) 8 3 例、 重型肝炎( S H) 3 8 例、 肝硬化( 1 . C ) 4 9 例和原发性肝癌( HC C ) 4 1 例。血清于一7 0 C 保 存。所有患者均排除了甲、 丙和戊型肝炎病毒感染 和其它导致肝脏病变的疾病， 诊断符合 2 0 0 0 年西安 第十次全国病毒性肝炎学术会议制订的 病毒性肝 炎防治方案 ( 试行) 标准。 1 . 2 主要试剂 大肠埃希菌 J M1 0 9 , Q I A G E N凝胶回收试剂 盒、 T

17、a K a R a p MD - 1 8 T A克隆试剂盒、 L A T a q 酶和 限制性内切酶E c o R j由大连宝生物工程有限公司 提供。 1 . 3 H B V基因分型检测 1 . 3 . 1 H B V D N A提取 采用直接煮沸法， 5 0 川 血清煮沸1 0 m i n 后1 2 0 0 0 r / m i n 离心1 0 m i n ， 取上 清2 浏作P C R反应模板。 1 . 3 . 2 引物设计和 P C R扩增反应参考 N a i t o 等r , 的方法: 第1 次P C R用通用引物U l 和U 2 扩 增， 反应条件为9 5 C 预变性8 m i n ,

18、 9 4 C 3 0 s , 5 8 3 0 s , 7 2 C 6 0 s , 3 5 个循环， 7 2 C延伸 1 0 mi n ， 可扩 增到 1 1 0 0 b y 的片段。第 2 次P C R第 1 组用 A B C 分型引物扩增， 第 2 组用 D E F分型引物扩增， 模板 均为第 1 次 P C R扩增产物， 反应条件均为 9 4 0C预 变性 6 m i n , 9 4 0C 3 0 s , 5 9 0C 3 0 s , 7 2 0C 4 5 s , 3 0 个循 环， 7 2 0C延伸 1 0 mi n . 分别可扩增到 6 8 , 2 8 1 , 1 2 2 , 1 1

19、9 , 1 6 7 , 9 7 b y的片段， 分别为H B V基因型A, B , C , D , E和F型。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析 结果。 1 . 3 . 3 H B V S 基因序列测定 选取型特异性引物 分型为B和C基因型的样本各2 份， 分别用高保真 D N A聚合酶 P C R扩增 S基因片段， 用 1 . 5 %的琼 脂糖凝胶电泳分离， Q I A G E N凝胶回收试剂盒回 收纯化目的基因片断， 与 p MD - 1 8 T载体进行连接 后转化大肠埃希菌J M1 0 9 ， 经氨节青霉素和蓝白筛 选后， 挑取 白色菌落接种于 1 m l L u r i a - B e r

20、t a m ( L B )含5 0 m g / m l 氨节青霉素) 的培养液中， 3 7 0C 培养1 2 1 6 h ， 小量提取质粒进行E c o R I 酶切鉴定 的阳性克隆用 A B I 3 7 7 全 自动测序仪测序， 结果与 G e n B a n k 发表的H B V序列进行同源性分析。 1 . 3 . 4 HB V标志物的检M I HB s A g 、 抗一 HB s , HB e A g 、 抗一 H B e 和抗一 H B c 检测应用 E L I S A法， 按 试剂盒( 上海实业科华生物技术有限公司) 说明书操 作。 1 . 3 . 5 血清H B V D N A含量

21、的测定 采用荧光定 量P C R检测， 试剂盒和仪器由广州达安基因诊断 中心提供。 1 . 4 统计学方法 采用S P S S 1 1 . 5 统计软件对数据进行t 检验和 zX检验。 2 结果 2 . 1 型特异性引物进行 H B V基因分型 用通用引物 Ul 和 U 2 可扩增到 l . 1 k b 大小的 D N A片断， 与预期设计一致， 见图 I A。用型特异性 引物可分出B型和 C型， 其 D N A片断分别为 2 8 1 和1 2 2 b y ， 同时出现2 8 1 和1 2 2 b y 条带者为B C混 合型， 见图 1 B o A: M 为 D N A标记 D I . 2 0

22、 0 0 Ma r k e r , 1 , 2为通用引物扩增 的 1 . 1 k b的 D N A片段 。 B : M 为D N A标记D L 2 0 0 0 Ma r k e r , 1为B基因型， 2为C 基因型， 3为 B C混合型。 图 1 3 0 o 琼脂糖凝胶电泳基因分型结果 2 . 2 型特异性引物分型法与S 基因序列分析法的比较 为证实本研究所用 HB V基因分型方法的准确 ,胜， 将型特异性引物P C R分型法与 S 基因序列分析 法进行比较。对上述所测得的 HB V S基因序列分 别与G e n B a n k发表的3 0株 HB V B和 C基因型的 S 基因序列进行同源

23、性分析， 用 C L U S T A L W 多重 序列对齐排序软件进行分析， 结果显示 2 株 HB V S 基因序列( HB G 2 1 和HB G 1 6 5 ) 与3 0 株B和C基因 型的同源性分别在9 6 0 0- 9 8 %和9 0 %-9 1 0 a ; 2 株 HB V S基因序列( H B G 4 1和 HB G 1 1 3 ) 与 3 0株 B 和C基因型的同源性分别为 9 0 0 o - 9 2 % 和9 7 %一 9 8 %。根据 H B V S 基因序列的异质性妻4 %的基 因分型标准， 因此 HB G 2 1 和 HB G 1 6 5的基因型为 宋世会等. 型特异

24、性引物 P C R技术在 H B V基因分型中的应用 1 9 3 B型，HB G 4 1和 H B G 1 1 3的基 因 型 为 C 型。 H B G 2 1 和 H B G 1 6 5 用型特异性分型法为 B型， H B G 4 1 和 H B G 1 1 3 用型特异性分型法为C型。上 述结果表明型特异性引物分型法与S 基因直接序列 分析的结果完全一致。 2 . 3 2 9 8 例 H B V感染者的临床特征及基因型的分布 如表 1 所示， 2 9 8 例血清 H B V D N A阳性的标 本中， 检测到B 基因型1 9 7 例， 占6 6 . 1 %, C基因型 3 3 例， 占1

25、1 . 1 O o , B C混合型6 8 例， 占2 2 . 8 0 0 ， 未检 测到A, D, E和 F基因型。B基因型在 A S C , AH, C H, S H和 H C C患者中均占绝对优势， 分别为 6 3 . 6 0 0 , 7 1 . 9 肠, 6 8 . 7 0 o , 8 9 . 5 %和 6 5 . 9 0 o ; C基因 型在各组中的分布差异无显著性意义( P 0 . 0 5 ) ; B C混合型在各组中的分布差异有显著性意义( P G 0 . 0 5 ) ， 多见于肝硬化组， 在重型肝炎组中未检测到 B C混合型。 表 1 2 9 8 例 HB V感染者的临床特征及

26、基因型分布( x 士、 ) 组别例数 年龄 ( 岁) 性别 男/ 女 AL T( U/ ) H B e A g阳性 ( %) B ( %) 基因型 C ( %)B C ( %) AS C 5 5 AH 3 2 2 2 . 0 士1 7 . 44 7 / 82 8 . 9 士8 . 4 4 3 ( 8 2 . 7 )3 5 ( 6 3 . 6 )4 ( 7 . 3)1 6 ( 2 9 . 1 ) 8 3 38 3 0 . 3 士 1 2 . 3 1 . 7 士1 1 . 2 6 / 61 8 2 . 0 士2 1 0 . 6 27 ( 8 4 . 3 )2 3( 7 17 ( 2 1 . 7 3

27、 / 1 02 5 3 . 4 士3 6 7 . 35 7 ( 6 8 . 9 ) 7 )1 1 ( 1 3 3 ) 3)1 5 ( 1 8 . 9 ) 1 ) 口 八nC，月 1八Jli q曰， 3 3 . 4 士1 n . 1 4 1 . 7 士1 0 . 5 3 3 / 58 士3 9 1 . 2 3 3 ( 5 8 . 9 ) 1 4 ( 4 3 . 9 )3 4 ( 8 9 . 5 ) 4 ( 1 0 . 5 ) HH CS 4 1 / 82 1 ( 4 2 . 9 ) 6 ( 1 2 . 2 ) 2 2 ( 4 4 . 9 ) 4 4 . 1 士1 1 . 4 3 3 . 5 士1

28、 2 . 5 3 7 / 4 5 士2 6 9 . 8 9 土3 7 . 3 9 ( 4 0 . 9 ) 3 ( 1 2 . 0 )2 7 ( 6 5 . 9 ) 6 ( 1 4 . 6 ) 8 ( 1 9 . 5 ) 2 5 7 / 4 1 1 7 3 . 2 士2 9 1 . 71 0 ( 5 3 . 7 ) 1 9 7 ( 6 6 . 1 ) 3 3 ( 1 1 . 1 ) 6 8 ( 2 2 . 8 ) 4941珊 比毗时 2 . 4 不同墓因型的临床特征 2 9 8 例H B V感染患者中， 不同年龄和性别与 H B V基因型无明显相关性( P 0 . 0 5 ) ; B C混合型

29、患者血清 A L T水平高于 B和 C基因型患者， 但差 异无显著性意义( P 0 . 0 5 ) ; B基因型和 B C混合型 患者 H B e A g阳性率与C基因型相比， 差异无显著 性意义( 均 P0 . 0 5 ) ; 不同基因型患者的 H B V D NA含量无显著性差异( P 0 . 0 5 ) 。见表 2 e 表2 不同基因型 HB V感染者的临床特征( x 士、 ) 基因型例数 性别 男/ 女 年龄 ( 岁) AL T( U/ I )H B e A g 阳性率( %)I . o g H B V D N A 5 . 9 士1 . 2 5 . 7 士1 . 2 勺 J任OJg以口

30、曰 匕d5Od巴 1 7 2 / 2 5 5 9 / 9 3 6 . 1 士1 1 . 5 3 8 . 4 士1 0 . 4 3 1 8 . 9 士3 7 2 . 9 3 6 7 . 6 士4 6 8 . 5 l9768 B犯 2 6 / 73 7 . 2 士1 5 . 73 1 9 . 6 士4 2 0 . 2 1 7 3 . 2 士2 9 1 . 7 5 . 0 士1 . 0 合计2 5 7 / 4 13 3 . 5 士1 2 . 55 . 8 士 1 . 1 3 讨论 基因型是根据被研究基因序列与目前已发表的 序列同源性大小进行聚类分析的结果， 因此必须用 被研究序列与已发表的序列分别进

31、行同源性分析， 即用多重序列对齐软件进行分析来确定基因型。在 目 前的H B V基因分型方法中， 直接序列分析法最 为准确， 但测序时间长、 成本高、 技术复杂， 很难做到 大样本量的流行病学研究。P C R - R F L P分型法所 需时间较长， 步骤多， 混合感染或酶切不完全时出现 复杂条带， 结果难 以判断。P C R微板核酸杂交- E L I S A方法能快速简单进行基因分型， 但成本较 高。本研究采用多对型特异性引物P C R扩增法进 行基因分型， 在严格的P C R条件下根据产物片段的 大小判断基因型别， 方法较为简便快速， 特异性高， 检测费用较低。本研究中对 4 株 H B

32、V S基因序列 ( H B G 2 1 , H B G 1 6 5 , H B G 4 1和 HB G 1 1 3 ) 分别与目 前 G e n B a n k发表的 B , C基因型 S基因序列用 C L U S T A L W 多重序列对齐软件进行分析， 结果显 示 4株 S基因序列与 3 0 株 B和 C基因型 S基因序 1 9 4 华中科技大学学报( 医学版)2 0 0 6 年4 月第 3 5 卷第 2 期 列的同源性分别为 9 6 0 0 9 8 % 和 9 7 0 0 9 8 %， 表 明上述4 个 S 基因序列分别为 B基因型和 C基因 型， 与型特异性引物分型法的结果完全一致。

33、因此， 应用型特异性引物 P C R方法进行 H B V基因型检 测， 准确、 快速、 简便、 成本低， 可用于大规模的流行 病学调查。 已有研究表明 a , H B V基因型具有明显的地 理分布特征: A型和 D型都呈世界性分布， 但 A型 主要分布在北欧、 西欧、 北美及非洲， D型主要分布 在中东、 北非、 南欧及地中海地区， 美国、 中国及法国 也有报道; B型和 C型主要分布在亚洲东部及南 部; E型只分布于非洲; F型主要存在于南美的土著 居民以及波利尼西亚和美国等地; G型主要发现于 美国、 法国; H型则已在尼加拉瓜、 墨西哥、 美国的 加利弗尼亚等地发现。而在我国， HB V

34、毒株以 B 型和 C型两种基因型最为常见， 二者及二者的混合 感染可达9 8 %左右 3 -4 1 。本研究应用多对型特异性 引物 P C R扩增法调查了 2 9 8例 HB V感染者的基 因型分布， 发现武汉地区存在 B型、 C型和 BC混 合基因型， 其中 B基因型( 6 6 . 1 %) 为优势基因型， 其次为 B C混合基因型( 2 2 . 8 %) 和 C基因型( 1 1 . 1 %) ， 未发现其它基因型的存在， 与国内的报道基本 一致， 反映了本地区 HB V基因型的分布状况。 虽然近年来有不少研究探讨了 H B V基因型与 肝脏疾病和病毒复制的关系， 但由于样本例数较少 并未得

35、出一致的结论 5 -6 1 。国内曾有报道I “ , H B V D N A B和C基因型在A L T , H B e A g 表达和病毒复 制水平上差异均无显著性意义， C基因型与肝硬化 和肝癌关系密切。另有报道 8 1 ， 肝硬化患者以B和 C混合型为主， H B V D N A毒株的混合感染有可能 加重肝组织的损伤。本研究发现， 2 9 8 例患者中， B 基因型在除肝硬化外的患者中均占绝对优势， C基 因型在各组患者中的分布无差异， B C混合基因型在 各组中的分布存在差异， 更多见于肝硬化组， 在重型 肝炎组中未检测到B C混合型， 提示 B C混合基因型 可能与疾病的进展存在一定的

36、关系。本研究还发 现， 各基因型在A L T水平、 H B e A g 阳性率及H B V D N A水平上无显著性差异， 提示基因型与肝脏炎症 活动及病毒复制可能并无关系。 今考文献 1 N A I T O H, H A Y A S H I S , A B E K . R a p i d a n d s p e c i f i c g e n o t y - p i n g s y s t e m f o r h e p a t i t i s B v i r u s c o r r e s p o n d i n g t o s i x m a j o r g e n o t y p e

37、s b y P C R u s i n g t y p e - s p e c if i c p r i m e r s J . J C l in Mi - c r o b i o l , 2 0 0 1 ，3 9 ( 1 ) :3 6 2 - 3 6 4 . 2 MI Y A K A WA Y , MI Z O K A MI M. C l a s s i f y i n g h e p a t i t i s B v i - r u s g e n o t y p e s J . I n t e r v i r o l o g y , 2 0 0 3 , 4 6 ( 6 ) : 3 2 9

38、- 3 3 8 . 3 D I N G X , MI Z O K A MI M, Y A O G, e t a l . H e p a t i t i s B g e n o - t y p e v i r u s d i s t r i b u t i o n a m o n g c h r o n i c h e p a t i t i s B v i r u s c a r r i e r s i n S h a n g h a i , C h i n a J . I n t e r v i r o l o g y , 2 0 0 1 ， 4 4 ( 1 ) : 4 3 - 4 7 .

39、4 雷延昌， 郝友华， 田拥军， 等. 湖北地区乙型肝炎病毒基因型 分布与临床的相关性 J .中华肝脏病杂志. 2 0 0 5 , 1 3 ( 2 ) ; 1 0 9 - 1 1 2 . 5 O R I T O E , I C H I D A T, S A K U G A WA H, e t a l . G e o g r a p h i c d i s t r i b u t i o n o f h e p a t i t i s B v i r u s( HB V) g e n o t y p e i n p a t i e n t s w i t h c h r o n i c H B

40、V i n f e c t i o n i n J a p a n仁 J . H e p a t o l o g y , 2 0 0 1 ， 3 4 ( 3 ) :5 9 0 - 5 9 4 . 6 K A O J H , C H E N P J ， L A I M Y , e t a l. H e p a t it is B v i r u s g e n - o t y p e s c o r r e l a t e w i t h c l i n i c a l o u t c o m e s i n p a t i e n t s w i t h c h r o n i c h e p

41、 a t i t i s B J . G a s t r o e n t e r o l o g y , 2 0 0 0 , 1 8 ( 3 ) : 5 5 4 - 5 5 9 . 7 王永忠， 周国平， 李夏亭， 等.乙型肝炎病毒基因分型及临床 应用研究 J . 中华实验和临床病毒学杂志， 2 0 0 2 , 1 6 ( 4 ) ; 3 6 7 - 3 6 9 . 8 朱冰， 骆抗先， 胡族琼， 等.乙型肝炎病毒基因分型方法的 建立及应用 J .中华实验和临床病毒学杂志， 1 9 9 9 , 1 3 ( 4 ) ; 3 0 9 - 3 1 3 . ( 2 0 0 5 - 0 7 - 3 0收稿)