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1、基因表达谱芯片技术筛选 干扰素基因转染细胞的反式调节基因 钟彦伟1， 成 军2， 曲建慧1， 李晓东1， 郭 江2， 戴久增1 （1. 解放军 302 医院传染病研究所 病毒性肝炎研究室， 北京 100039； 2. 地坛医院传染病研究所， 北京100011） 摘要 目的： 筛选能被 干扰素反式调节的靶基因， 研究 干扰素的生物学功能及其机制。方法： 设计并 合成 干扰素 （IFN） 特异性引物， 应用聚合酶链反应 （PCR） 技术扩增 IFN 基因片段， 以常规的分子生物学技术 将获得的 IFN 编码基因片段克隆到 TA 载体中， 进行测序鉴定后构建真核表达载体 pcDNA3. 1 （-）
2、-IFN-。以空载 体 pcDNA3. 1 （-） 为平行对照， 转染 HepG2 细胞， 制备转染后的细胞裂解液， 提取 mRNA。应用基因表达谱芯片技术 对差异表达的 mRNA 进行检测和分析。结果： HepG2 细胞经转染 IFN- 之后， 有 70 条差异基因表达， 其中 40 条基 因表达增强， 30 条基因表达降低。这些差异表达基因与细胞的增生、 分化和细胞的信号转导密切相关。结论： 应用 基因表达谱芯片技术筛选到 IFN- 的反式调节基因， 为进一步探索 IFN- 可能的调节机制及其生物学功能提供了 新的依据。 关键词 干扰素-；寡核苷酸序列分析；转染；基因调节 中图分类号 R
3、34-33文献标识码 A 文章编号 1005-1139 （2006） 02-0144-03 Screening and identification of genes trans-regulated by -interferon protein with mi- croarray assay ZHONG Yan-wei1， CHENG Jun2， QU Jian-hui1， LI Xiao-dong1， GUO Jiang2， DAI Jiu-zeng1（1. Center for Viral Hepatitis Research，Institute of Infectious Disease
4、s，Chinese PLA 302 Hospital，Beijing 100039，China； 2. Insti- tute of Infectious Diseases，Beijing Ditan Hospital，Beijing 100011，China） ABSTRACT Objective： To screen genes regulated by IFN-using cDNA microarray technique. Methods： The IFN-coding DNA fragment was amplified with polymerase chain reaction（
5、PCR）technique. The expressive vector of pcDNA3. 1-IFN-was constructed by routine molecular biological methods. The HepG2 cells were transfected by pcDNA3. 1 （-）and pcDNA3. 1-IFN- respectively， using FuGENE6 transfection Reagent. The total RNA was isolated and reverse transcribed. The cDNAs were subj
6、ec- ted for microarray screening with 1， 152 cDNA probes. Results： The expressive vector has been constructed and confirmed by re- striction enzyme digestion and DNA sequencing analysis. High quality mRNA and cDNA had been prepared and successful mi- croarray screening had been conducted. From the s
7、canning results，it was found 40 genes were up-regulated and 30 genes were down-regulated by IFN- gene. Conclusion： IFN-gene is a trans-regulator. KEY WORDS interferon-beta；oligonucleotide array sequence analysis；transfection；genes regulator 为探索 干扰素与肝细胞蛋白相互作用的分 子生物学机制， 我们利用基因表达谱芯片技术， 对于 IFN- 反式调节的靶基因
8、进行筛选鉴定， 探索 IFN- 表达对于肝细胞基因表达谱的影响。 1 材料和方法 1. 1 材料和试剂 HepG2 细胞及感受态大肠杆菌 DH5 （本室保存） ， pcDNA3. 1 （-） 真核表达载体 （Invitrogen） ； FuGENE6转染试剂 （ Roche） ； mRNA Purification 试剂盒（Amersham Pharmacia Biotech） ； 收稿日期 2005-06-14修回日期 2005-07-22 作者简介 钟彦伟 （1965-） ， 女， 吉林人， 副研究员， 军医进修学院 03 级博士研究生，发表论文 30 余篇。电话：（010） 669333
9、92 PCR-Select cDNA Subtraction 试剂盒， 50 PCR En- zyme Mix， Advantage PCR Cloning 试 剂 盒 （ Clon- tech） ； High Pure PCR Product Purification 试剂盒 （ Boehringer Mannheim） ；T7，SP6 通 用 引 物 及 pGEM-Teasy 载体 （Promega） 。表达谱芯片由上海联 合基因有限公司提供。 1. 2方法 1. 2. 1细胞培养35 mm 培养皿中培养 HepG2 细 胞， 生长至对数生长期时， 以脂质体转染试剂 Fu- GENE 分别
10、将 2 g pcDNA3. 1 （-） -IFN 和空载体 pcDNA3.1 （-） 转染 HepG2 细0 胞， 48 h 后收获细胞， 每 5 106个细胞加入 1 ml Trizol 试剂， 立即于液氮中 保存。 1. 2. 2总 RNA 及 mRNA 的提取和纯化使用 Tr- 441 军 医 进 修 学 院 学 报 Acad J PLA Postgrad Med Sch 2006 Apr， 27 （2） izol 试剂一步法提取 pcDNA3. 1 （-） -IFN 和空载体 pcDNA3. 1 （-） 转染的 HepG2 细胞总 RNA （分别标记 为实验组和对照） ， 样品经分光光
11、度计检测吸光度 A 值， 并进行热稳定实验， 于 - 20 和 70 保温 1 h 后， 经琼脂糖凝胶电泳检测 28S， 18S 条带变化。 1. 2. 3探针标记参照 Schena et al 方法逆转录标 记 cDNA 探针并纯化。Cy3-dUTP 标记对照组细胞 mRNA （5 g） ， Cy5-dUTP 标记实验组细胞 mRNA （5 g） 。乙醇沉淀后溶解在 20 l 5 SSC +0. 2% SDS 杂交液中。 1. 2. 4芯片制备包含的1152 个 cDNA 由上海联 合基因有限公司提供， 包括原癌基因和抑癌基因， 免 疫调节相关基因、 细胞凋亡和应激反应蛋白相关基 因， 信号
12、转导相关基因等。以通用引物进行 PCR 扩 增， PCR 产物长度为 1000 3000bp。靶基因以 0. 5 g/ l 溶解于 3 SSC 溶液中， 用 Cartesian 公司 的 Cartesian7500 点样仪及 Telechem 公司的硅熔解 化玻片进 行 点 样。玻 片 水 合 （2 h） ， 室 温 干 燥 （30 min） ， 紫外线 （UV） 交联， 再分别用 0. 2% SDS 水及 0. 2%的硼氢化钠溶液处理 10 min， 晾干备用。 1.2. 5预杂交 将预杂交液放入 95 水浴锅内 变性 2 min， 将待预杂交的芯片放入 95 水浴锅内 变性 30 s， 芯
13、片取出后即放入无水乙醇中 30 s， 晾 干。将已变性的预杂交液加到芯片的点样区域内， 盖上盖玻片， 放入杂交箱内 42 预杂交 5 6 h。 1. 2. 6 杂交及洗涤 将探针置于 95 水浴中变 性 2 min，芯片置于 95 水浴中变性 30 s， 芯片取 出浸于无水乙醇 30 s， 探针取出后迅速置于冰上。 将探针置于芯片上， 用盖玻片覆盖， 置于杂交舱中， 用 parafilm 密封， 放入 42 杂交箱内杂交过夜 （15 17 h） 。依次以 2 SSC + 0. 2% SDS，0. 1 SSC +0. 2%SDS， 0. 1 SSC 洗涤 10 min， 室温晾干。 1. 2.
14、7检测与分析用 General Scanning 公司的 ScanArray 3000 扫描芯片。用预先选定的内参照基 因 （24 条管家基因， 每个基因点 2 个点， 共 48 个点） 对 Cy3 和 Cy5 的原始提取信号进行均衡和修正。用 ImaGene 3. 0 软件分析 Cy3， Cy5 两种荧光信号的强 度， 计算 Cy5/ Cy3 比值。阳性结果判断： Cy5/ Cy3 2. 0， 红色荧光， 显示表达增强； Cy5/ Cy3 1. 89， 热稳定实验 70 保 温 1 h 与 -20 1 h 电泳条带比较， 显示 28S 条带 无明显降解， 电泳结果证实已抽提高纯度的总 RNA
15、。mRNA 主要集中于 0. 9 4. 0 kb 的连续条 带。 2. 3芯片杂交体系验证及结果分析 在芯片上共 有 1152 个 cDNA。为了监控芯片杂交体系， 在芯片 上设置了阴性对照 （8 条水稻基因， 共 8 个点） ， 这些 点的杂交信号均很低， 证实了数据的可靠性。由于 实验组探针标记 Cy5 荧光素 （呈红色） ， 对照组荧光 素 （呈绿色） ， 红绿颜色的差异就显示该基因在实验 组和对照组中基因表达水平上的差异， 黄色代表表 达水平无差异。按阳性标准， 从 1 152 个基因中筛 选出差异表达基因共 70 条， 占 5. 1%， 其中 40 条基 因表达增强， 30 条基因表
16、达降低。 2. 4 差异表达基因分析 表达增强的基因有 40 条， 表达降低的基因有 30 条。 3 讨 论 本实验结果表明， 40 种基因的表达水平上调， 30 种基因的表达水平下调。这些基因包括细胞生 长、 细胞凋亡、 信号转导、 免疫调节， 肿瘤发生等基 因。其中在上调基因中， 有多条基因与免疫调节、 信 号转导、 细胞生长代谢相关， 其中窖蛋白作为膜运输 系统的重要成份参与了胆固醇与磷脂的运输、 分选 过程。组织蛋白酶 1 在真核染色体中与 DNA 复合 的结构蛋白质， 富含精氨酸 （arginine） 和赖氨酸 （lysine） 两种带正电的氨基酸， 可帮助稳定 DNA 结 构， 而
17、 DNA 缠绕核仁小体的构造可帮助其收缩为染 色体 1。G 蛋白偶联受体 4 跟信号转导有关。细胞 色素 P4502C9 与细胞生长代谢有关。1， 4-半乳糖 基转移酶 I （1， 4-galactosyltransferase， -1， 4-GalT- I） 为 II 型膜结合糖蛋白。其一个基因能转录两种 mRNA： 即 3. 9kb和 4. 1kb， 每种都含有各自的框内 541 军 医 进 修 学 院 学 报 Acad J PLA Postgrad Med Sch 2006 Apr， 27 （2） AUG 起始密码子。从第一个 AUG 翻译编码一个 399 个氨基酸的蛋白质称为长型 -1
18、，4-GalT-I； 从 第二个 AUG 翻译的一个 386 个氨基酸的蛋白质称 为短型 -1， 4-GalT-I。两型均能在高尔基体上合成 糖苷键， 进行蛋白质修饰调控； 长型除了在细胞表面 作为 Laminin 的受体参与细胞-细胞、 细胞-细胞间基 质的相互作用 （如精卵识别、 神经系统形成、 乳腺发 育等） 之外， 还参与细胞的增殖调节 2。细胞表面 的 -1， 4-GalT-I 可能通过调节表皮生长因子的磷 酸化而影响细胞增殖。钙激活蛋白酶 7 由钙离子通 过钙结合蛋白介导参与细胞调节机制 3， 4。 在下调基因中，2，6-果糖激酶 （PFKFB1） 具有 合成和降解果糖 2， 6-
19、二磷酸， 以同型二聚体的形式 存在， 属于磷酸甘油酸变位酶家族， 具有水解酶、 转 移酶、 激酶的功能 5， 6。DNA 解旋酶是一个腺苷三 酸酶， 可提供支链迁移的动力。型胶原是正常基 底膜的主要组成成分之一， 其分布变化与各种癌肿 转移潜能密切相关。分布在血管、 皮肤、 肉芽组织。 上述差异表达表明， IFN 与细胞信号转导、 细 胞生长调节有关。对这些研究结果的分析表明， IFN 对于肝细胞的基因表达谱有显著的影响， 基因 芯片技术是研究基因表达谱改变的有效分析技术。 参考文献 1 Hirasaki S，Koide N，Ujike K，et al. Expression of Nov，C
20、YR61 and CTGF genes in human hepatocellular carcinoma J . Hepatol Res， 2001， 19： 294-305. 2 成军， 李克， 陆荫英， 等. 丙型肝炎病毒调节基因区结合的研究 进展 J . 世界华人消化杂志， 2002， 10： 223-225. 3 Corsini E， Viviani B， Zancanella O， et al. Induction of adipose dif- ferentiation related protein and neutral lipid droplet accumulation
21、in keratinocytes by skin irritants J . J Invest Dermatol，2003， 121： 337-344. 4 Sock E，Rettig SD，Enderich J，et al. Gene targeting reveals a widespread role for the high-mobility-group transcription factor Sox11 in tissue remodeling J . Mol Cell Biol，2004，24： 6635- 6644. 5 Kitani T，Okuno S，Fujisawa H.
22、 Growth phase-dependent changes in the subcellular localization of pre-B-cell colony-enhancing factor J . FEBS Lett， 2003， 544： 74-78. 6 Gadjeva M，Tomczak MF，Zhang M，et al. A role for NF-kappaB subunits p50 and p65 in the inhibition of lipopolysaccharide-in- duced shock J . J Immunol， 2004， 173： 578
23、6-5793. ASCA 和 ANCA 在炎症性肠病诊断中的意义 王志刚 （廊坊市人民医院， 河北省065000） 关键词 结肠炎，溃疡性；抗体，抗中性白细胞胞质 中图分类号 R 574. 621文献标识 B 文章编号 1005-1139 （2006） 02-0146-01 1临床病例自 2000 年至 2004 年在我院住院患者中炎症 性肠病病例 35 例， 其中 15 例为 Crohn s 病 （克隆病， CD） ， 20 例为溃疡性结肠炎 （UC） 。 1.1 15 例 CD 病例基本情况 男性 10 例， 女性 5 例。AS- CA-IgG 阳性 9 例 （占 60%） ， 其中男性
24、5 例， 女性 4 例。AS- CA-IgA 阳性 10 例 （占 66. 7%） ， 其中男性 7 例， 女性 3 例。 P-ANCA和 C-ANCA 均阴性。 1. 2 20 例 UC 基本情况 男性 11 例， 女性 9 例。ASCA-IgG 均阴性。ASCA -IgA 阳性2 例 （占10%） ， 其中男性1 例， 女性 1 例。P-ANCA 阳性 16 例 （占 80%） ， 其中男性 8 例， 女性 8 例。C-ANCA 阳性 1 例 （占 5%） ， 为男性病人， 女性阴性。 2讨论 ASCA 是抗酵母属 Cerevisiae 抗体 （anti-Saccharo- myces c
25、erevisiae antibody，ASCA） ， 为可直接作用于酵母属 Cerevisiae 的细胞壁磷肽甘露聚糖部分， 包括 IgG、 IgA。ANCA 收稿日期 2005-06-13 修回日期 2005-07-20 作者简介 王志刚 （1968-） ， 男， 河北省固安县人， 1993 年河北医科 大学本科毕业， 主治医师 是抗中性粒细胞胞浆抗体 （antineutrophil cytoplasmic antibod- ies， ANCA） 是一组针对中性白细胞许多胞浆成分所产生的自 身抗体， 可分为胞浆型 （c-ANCA） ， 核周型 （p-ANCA） 以及非 典型型 （x-ANCA
26、） 。 文献报道， ASCA-IgG 和 （或） IgA 滴度增高见于 50% 80%的 CD 患者， 少于 10%的 UC 患者及少于 5% 的正常人， 故 ASCA 对 CD 具有高度特异性， 但其灵敏度一般； 而 ANCA 阳性率在 CD 患者中为 10% 20%， 在 UC 患者中为 50% 85%， P-ANCA 阳性见于 50% 70% 的 UC 患者， 5% 10% 的 CD 患者及 3% 4% 的正常人。本组病例显示： 在 CD 患 者中 ASCA-IgG 阳性占 60%， ASCA-IgA 阳性占 66. 7%， 与文 献报道相符； 在 CD 患者中 ANCA 阳性率为 0%，UC 患者中 P-ANCA 阳性占 80%， C-ANCA 阳性占 5%， 与文献报道基本 相符。可见 ASCA 与 ANCA 的联合检测对炎症性肠病的诊 断有十分重要的意义， 可以协助 CD 与 UC 的诊断与鉴别， 尤 其对临床表现不典型的病例意义更显重要， 对炎症性肠病中 不确定型结肠炎 （indeterminate colitis） 的分型亦有优势。 641 军 医 进 修 学 院 学 报 Acad J PLA Postgrad Med Sch 2006 Apr， 27 （2）