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1、第1 8 卷第5 期 江苏大学学报( 医学版) V 0 1 1 8N o 5 2 0 0 8 年9 月 J o u r n a lo fJ i a n g s uU n i v e r s i t y ( M e d i c i n eE d i t i o n )S e p t 2 0 0 8 壳聚糖对肝癌和肺癌细胞株糖基化作用的影响 沈力，闫石，吴祁生，吴士良 ( 苏州大学医学部生物化学与分子生物学教研室，江苏苏州2 1 5 1 2 3 ) 摘要】目的：观察中药壳聚糖对肝癌和肺癌细胞株糖基转移酶表达的影响，探讨中药多糖在肿瘤预防和治疗的 应用。方法：以浓度为5 0 ，1 0 0 和2 0
2、0m g L 的壳聚糖分别作用于肝癌细胞株S M M C - 7 7 2 1 和肺癌细胞株A 5 4 9 ，采用 R T - P C R 方法检测多肽：N 一乙酰氨基半乳糖转移酶2 ( p p G a l N A e T 2 ) 和B 3 G A I T 的表达水平。结果：肝癌细胞株中p p - G a i N A c T 2 和 3 3 G A I T 仅微弱表达，加药后作用不明显；肺癌细胞株中p p G a i N A e T 2 和B 3 G A I T ? 均有所表达，加入不同 浓度的壳聚糖之后，p p G a l N A e r r 2 和郾G A I T ? 的表达均受到抑制，且随
3、着壳聚糖浓度的增加，抑制作用越明显。结论： 肝癌细胞株S M M C - 7 7 2 1 和肺癌细胞株A 5 4 9p p G a l N A e T 2 和8 3 G A I T ? 的表达不同，壳聚糖能够抑制肺癌细胞株A 5 4 9 中的糖基转移酶p p G A I N A c T 2 和B 3 G A I T ? 的表达，从而抑制了糖基化作用，对肺癌的预防和治疗具有一定的价值。 关键词 壳聚糖；肝癌；肺癌；糖基转移酶 中图分类号】R 3 4【文献标志码 A【文章编号】1 6 7 1 7 7 8 3 ( 2 0 0 8 1 0 5 一0 4 0 0 一0 3 E f f e c to fc
4、 h i t o s a nt ot h eg l y c o s y l a t i o ni nl i v e rc a n c e r c e l ll i n ea n dl u n gc a n c e rc e l ll i n e S H E NL i ，Y A NS h i ，删Q i s h e n g ，W US h i 一妇昭 ( D e p a r t m e n to fB i o c h e m i s t r ya n dM d o c u l s rB i o l o g y ，M e d i c a lC o l l e g eo fS o c e h o w
5、U n i v e r s i t y ，S u z h o u 脚u2 1 5 1 2 3 ，C h i n s ) A b s t r a c t O b j e c t i v e ：T oo b s e r v et h ee f f e c to f c h i t o s a nt ot h ee x p r e s s i o no fd i f f e r e n tg l y e o s y l t r a n s f e r a s e s i nl i v e rc a n c e rc e l ll i n ea n dl u n gc a n c e rc e l l
6、l i n ea n dt os t u d yt h ea p p l i c a t i o no fc h i t o s a ni np r e s e r v a t i o na n d t r e a t m e n to ft u m o r M e t h o d s ：D e t e c tt h ee x p r e s s i o no fp p G a l N A e T 2a n d 1 3 G A I T 7i nS M M C - 7 7 2 1c e l ll i n e a n d ”4 9c e l ll i n eb yR T - P C Ra f t
7、e re h i t o s a na d d e dt ot h ec u l t u r em e d i u m 1 h ec o n c e n t r a t i o no fc h i t o s a n w a s5 0 ，1 0 0 ，2 0 0m g L R e s u l t s ：- 1 1 l em R N Ae x p r e s s i o no fp p G a l N A e T 2a n dJ 3 3 G a l T 7W a Si nl o wl e v e ri n S M M C - 7 7 2 1c e l l l i n ea n dt h ea c
8、 t i o nw a sn o to b v i o u s T h em R N Ae x p r e s s i o no fp p G a l N A e T 2a n d 1 3 G a w i nA 5 4 9c e l ll i n eW a sd e c r e a s e da f t e re h i t o s a na d d e dt ot h ec u l t u r em e d i u m A st h ei n c r e a s e do fc o n c e n t r a - t i o n ，t h ei n h i b i t i o nW 8 8s
9、 t r o n g e r C o n c l u s i o n ：T h i ss t u d ys h o w e dt h a tt h ee x p r e s s i o no fp p G a l N A e T 2a n d t 3 G A I T 7i nS M M C - 7 7 2 1c e l ll i n ea n dA 5 4 9c e l ll i n eW a sd i f f e r e n t T h eg l y c o s y l a t i o n i n3 5 4 9c e l l sw a si n - h i b i t e db yt h e
10、e h i t o s a nt h m u s hi n h i b i t i n gt h ee x p r e s s i o no fp p G a l N A c T 2a n d 1 3 G a l T 7 I tW a sg o o df o rp r e s e r v a t i o na n dt r e a t m e n to fl u n gt u m o r K e yw o r d s e h i t o s a n ；l i v e rc a n c e r ；l u n gc a n c e r ；g l y c o s y l t r a n s f e
11、r a s e 中药多糖广泛存在于植物、微生物( 细菌和真 菌) 和海藻中，具有极大的医学应用价值。壳聚糖是 采用甲壳素作为原料，通过脱乙酰后制成的一种天 然生物高分子，是生物界大量存在的线性氨基多糖， 具有广泛的药理作用，譬如抑菌作用，调脂及调节血 糖作用，抗凝血作用等等。近年来有文献报道壳聚糖 具有极佳的抗肿瘤作用，并且无毒副作用。 肿瘤细胞糖蛋白糖链结构异常与肿瘤的生物学 行为，如恶性转化、转移与浸润等密切相关，而其基 础是糖基转移酶的变化。因此，研究肿瘤细胞的糖 基转移酶变化，有助于了解肿瘤的生物学行为机制， 利于肿瘤的治疗和预防。本文观察了不同浓度壳聚 糖对肝癌和肺癌细胞株糖基转移酶
12、表达差异，以探 讨糖基转移酶与肿瘤细胞浸润转移能力的关系，以 基金项目】国家自然科学基金资助项目( 3 0 6 7 0 4 6 2 ) 【作者简介】沈力( 1 9 8 4 一) 男，硕士研究生；吴士良( 通讯作者) 教授博士生导师E - m a i l ：s h i l i a n g w u h o m m i l 伽 万方数据 第5 期 沈力，等壳聚糖对肝癌和肺癌细胞株糖基化作用的影响 4 0 1 及壳聚糖在肿瘤治疗和预防中的作用。 l 材料和方法 I 1试剂 T r i z o l ，M - M L V 逆转录酶，d N T PM I X ，5 M - M L V 缓冲液，1 0xP C
13、 R 缓冲液，M g C l 2 等均购自I n - v i t r o g e n 公司，六碱基随机引物购自T a K a R a 公司， T a q D N A 酶购自上海捷瑞生物科技有限公司。 1 2 细胞培养及分组 肝癌细胞株S M M C - 7 7 2 1 和肺癌细胞株A 5 4 9 均 为本室保存。壳聚糖胶囊由中科院大连化学物理研 究所提供，溶于无血清的R P M I 1 6 4 0 培养基， 0 2 2m m 孔径的滤膜过滤除菌，4 放置备用。 S M M C - 7 7 2 l 和A 5 4 9 用含1 0 小牛血清的R P - M I 一1 6 4 0 培养基，置3 7 ，
14、5 C 0 2 培养箱内培养，生长 至对数生长期时进行细胞分组。细胞分成4 组，第l 组，即对照组，加入1m l 的培养基；第2 组，加入等体 积5 0m g L 的壳聚糖；第3 组，加入等体积的1 0 0r a g L 的壳聚糖；第4 组，加入等体积的2 0 0m g L 的壳聚 糖。然后加入相同体积的培养基继续培养2 4h 。 1 3R T P C R R T - P C R 法检测S M M C - 7 7 2 1 和A 5 4 9 细胞中 p p G a l N A c T 2 ，B 3 G a l T 7 的表达：将培养瓶中的细胞用 P B S 洗2 次，15 0 0r r a i
15、n 离心5r a i n 后弃上清，保留 细胞，z 0 1 法提取总R N A 。取总R N A2 峭进行逆 转录反应，再进行P C R 扩增。扩增产物以2 的琼 脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，图像分析仪摄像并分 析结果。P C R 反应体系( 5 0 一) ，反应条件：9 4 预 变性3m i n ；循环：9 4 变性4 5s ，5 6 复性1m i n ， 7 2 延伸1r a i n ，循环数3 0 ；7 2 延伸7m i n 。引物 设计采用G e n e t y x 软件，并经G e n B a n kB l a s t 进行同 源检索后合成。引物由上海I n v i t r o g
16、e n 公司合成： B a c t i n 弓I 物为：F ：5 一C T C G T G C T A C T C T C T C l r I T C 3 R ：5 C A T G T C ：T C G A T C C C A C ，I I A A C 37 ，预期扩 增产物长度为2 1 1b p 。 p p G a l N A c T 2 引物为：F ：57 一G 从A G 从1 t I A G G A A G G G T C A G A A C - 3 R ：5 - C T G T G T C A A 7 I 、G T A A A C A T A G C T C - 3 。预期扩增产物长度
17、为6 6 8b p 。 3 3 G A I T 7 引物为：F ：5 - T A T G T G C C C G A G T C C T - T C T T C G - 3 ，R ：5 一G C A a 阿G 1 r 1 1 C C A G A G C C G 丸A T G - 3 ，预期扩增产物长度为3 0 3b p 。 2 结果 2 1 不同浓度壳聚糖对肝癌细胞株S M M C 0 7 7 2 1 p p G a l N A c T 2 和1 3 3 G A I T 7 表达的影响 虽然肝癌细胞的B a c t i n 有所表达，但检测不到 p p G a l N A c T 2 和1 3
18、 3 G a l T 7 表达，在加入不同浓度的壳 聚糖之后，仍未见到p p G a l N A c T 2 和B 3 G A I T ? 的表达， 可见壳聚糖对两者的表达没有促进或者增强作用。 见图l 。 1 ：Om g L ；2 ：5 0r 唱L ；3 ：1 0 0m g L ；4 ：2 0 0m g L ；M ：标准参照物 图1S M M C - 7 7 2 1 细胞株p a c t i n 的m R N A 的表达 F 噜1 T h em R N Ae x p r e s s i o no f V a c t i ni n S M M C - 7 7 2 1c e l ll i n e
19、 2 2 不同浓度壳聚糖对肺癌细胞株A 5 4 9p p G a l N A c T 2 和B 3 G a l T 7 表达的影响 肺癌A 5 4 9 细胞株中p p G a l N A c T 2 和1 3 3 G a l T 7 均有表达，且随着壳聚糖浓度的增加，表达量均有所 降低。说明壳聚糖对p p G a l N A c T 2 和1 3 3 G A I T ? 的表 达有一定程度的抑制作用。见图2 ，图3 。 1 ：O m g L ；2 ：5 0m r L ；3 ：1 0 0r a g L ；4 ：2 0 0m e L ；M ：标准参照物 图2A 5 4 9 细胞株中争删n 。p p
20、 G a l N A c T 2 和 pG A I T 7 的m R N A 的表达 F i g2T h em R N Ae x p r e s s i o no f V a c t i n ，p p G a l N A c T 2 a n dp G a l T 7i nA 3 4 9c e l ll i n e 1 ：Or a g L ；2 ：5 0m e L ；3 ：1 0 0m s L ；4 ：2 0 0m C L 圈3 肺癌A 5 4 9 细胞株中p p G a l N A c T 2 和 p G A I T 7 的相对表达量 3C o r r e s p o n d e n c ee
21、 x p r e s s i o no fp p G a l N A c T 2a n d p G A I T i nA 5 4 9c e l ll i n e 疵L。静帅血。d 。 5 O 5 O 5 O 2 2 1 1 O 一艘群茛罂v16I譬 厶I鼍Dq冥譬。、芝HI。甚 万方数据 江苏大学学报( 医学版) 第1 8 卷 3 讨论 所有生物的细胞表面均覆盖着反映细胞种类和 状态的糖链。细胞癌变过程中总伴有糖链结构的改 变，导致构成癌细胞膜的糖脂质和糖蛋白改变，而糖 链的改变又使细胞间的识别和联系发生障碍。糖链 是按一定顺序由糖基转移酶合成的。肿瘤发生中许 多糖基转移酶的表达水平或活性都发
22、生改变，从而 影响细胞的周期调控和细胞的增殖能力，促进肿瘤 的发展。糖基化是真核细胞蛋白质转录后修饰方式 中的一种。这些糖蛋白与一系列的生物学功能有着 广泛的联系，如细胞间的黏附，自我与非自我的识 别，分子运输与清除，受体激活，细胞的内吞作用 等【2 J 。在肿瘤生物学中同样对疾病表型和糖基化 改变之间的相关性做了大量研究。在很多情况下， 在正常细胞转变为肿瘤细胞的过程中，一种或多种 糖基转移酶活性的改变与糖基化密切相关。实验显 示慢性淋巴细胞白血病( C L L ) B 细胞表面低水平的 B C R 表达，与斗和C D 7 9 a 链的糖基化和折叠损伤有 关3 1 。 多肽：N - 乙酰氨基
23、半乳糖转移酶催化O - 聚糖合 成的第一步是，将U D P G a l N A c 上的G M N A c 转移至 蛋白质多肽链上特定序列中的T h r 和S e r 的羟基上 而合成G a l N A c a O - S e r T h r 多肽。B 半乳糖基转移 酶家族是糖基转移酶的一个家族，其p 3 G a I T 活性 在动物广泛存在，用以形成半乳糖G a l 和氨基己糖 H e x ( N A c ) 之间的C t 或B 连接。p p G a l N A c T 2 和 B 3 G M T 7 作为O 糖基化的关键酶，参与蛋白质转录 后糖基化修饰，其表达异常可造成细胞表面某些糖 蛋白
24、出现缺陷，从而出现某些病理症状。 本研究中我们检测到肝癌细胞株S M M C - 7 7 2 1 中p p G M N A c T 2 和1 3 3 G a l T 7 表达较低或未表达，加 入壳聚糖后其表达变化并不明显。而在加入壳聚糖 之后，肺癌细胞株A 5 4 9 中p p G a l N A c T 2 和p 3 G a l T 7 的m R N A 的表达均降低，且壳聚糖的浓度越高，对 p p G a l N A c T 2 和1 3 3 G a i T 7 抑制作用越明显。说明壳 聚糖具有抑制糖基转移酶的作用，从而抑制细胞表 面糖基化，为肿瘤的预防和治疗提供新的方案。 我们的实验结果
25、还显示，肺癌细胞株A 5 4 9 较 高程度地表达p p G a I N A c T 2 和1 3 3 G a i T 7 ，推测这两种 糖基转移酶参与了肺癌细胞的分化，与细胞表面糖 链结构的改变密切相关。加入壳聚糖后，p p G a l N - A c T 2 和p 3 G M T 7 的m R N A 表达量降低，说明壳聚糖 通过某种途径抑制了p p G a l N A c T 2 和f 1 3 G M r l 7 的表 达。由于肿瘤发生中许多糖基转移酶的表达水平或 活性都发生改变，从而影响细胞的周期调控和细胞 的增殖能力，因此壳聚糖在肿瘤治疗上具有重要的 应用价值。同时，糖基转移酶只与极
26、少数的糖相互 作用，自然界的小分子是许多天然药物的基础，而许 多天然小分子活性会因附加其上的糖分子而改变。 经过基因工程的改造，糖基转移酶能够用更多种类 的糖基来修饰小分子H 】。基于这一技术，可以开发 利用壳聚糖类药物，从而有助于发现新的治疗方法 和多糖类药物。 参考文献】 B e r r a d aM ，s t 肌吲A ，D a b b a r hF ，e ta 1 An o v e ll i o n t o x i cc a m p t o t h e c i nf o r m u l a t i o nf o rc s n c e rc h e m o t h e r a p y J
27、B i o m a t e r i a h ，2 0 0 5 ，2 6 ( 1 4 ) ：2 1 1 5 - 2 1 2 0 O h t s u b oK ，M a r t hJ D G l y c o s y l a t i o ni nc e l l u l a rm e c h a n i s m so fh e a l t ha n dd i s e a s e J C e l l ，2 0 0 6 ，1 2 6 ( 5 ) ： 8 5 5 8 6 7 V u i l l i e rF ，D u m a sG ，M a g n a cC ，e ta 1 L o w e rl e v e
28、 l s0 f s u r f a c eB c e l l r e c e p t o re x p r e s s i o ni nc h r o n i cl y m p h o c y t i c l e u k e m i aa 聆a s s o c i a t e dw t hg l y c o s y l a t i o na n df o l d i n g d e f e c t so ft h em ua n dC D 7 9 ac h a i n s J B l o o d ，2 0 0 5 ， 1 0 5 ( 7 ) ：2 9 3 3 2 9 4 0 W i l l i
29、 a m sG J ，Z h a n gC 。1 1 I 删lJ S E x p a n d i n gt h ep r o m i s c u i t yo fan a t u r a l - p r o d u c tg l y c o s y l t r a n s f e r a s eb yd i r e c t - e de v o l u t i o n J N a tC h e mB i o l ，2 0 0 7 ，3 ( 1 0 ) ：6 0 4 6 Q 5 【收稿日期】2 0 0 8 0 3 2 8 【本文编辑 何承志 1 J 1 J 1 J 1 J l 2 3 4 r L r L r-rL 万方数据