外源性RIL-10基因质粒静脉注射及其在大鼠体内表达.pdf

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1、8 3 4 中国药理学通报C h i n e s eP h a r m a c o l o g i c a lB u l l e t i n 2 0 0 8J u n ；2 4 ( 6 ) ：8 3 4 7 外源性r I L 1 0 基因质粒静脉注射及其在大鼠体内表达 黄月红，陈运新，陈治新，王小众 ( 福建医科大学附属协和医院消化内科，福建福州3 5 0 0 0 1 ) 中国图书分类号：R - 3 2 2 ；R3 2 9 2 4 ；R3 9 2 1 l ；R3 9 4 2 ； R4 4 6 6 2 ；R4 4 6 8 ；R4 5 9 9 ；R5 7 5 0 5 文献标识码：A 文章编号：1

2、0 0 1 1 9 7 8 ( 2 0 0 8 ) 0 6 0 8 3 4 0 4 摘要：目的建立大鼠体内质粒D N A 尾静脉快速大容量注 射法，使外源性r I L - 1 0 在肝组织中高表达，为探索肝脏疾病 的基因治疗提供动物试验手段。方法以r l L 1 0 为报告基 因，将含不同体积及不同质粒浓度的质粒D N A 溶液经大鼠 尾静脉快速注射，在注射后的不同时间内分别收集血浆及 肝、肾、肺、脾和心组织，使用R T P C R 、E L I S A 和免疫组化法 检测r I L - 1 0 在体内的表达情况。结果尾静脉快速大容量 注射r I L - 1 0D N A 溶液可使r I L

3、一1 0 基因在大鼠肝脏有较明显 转录及表达。血浆中r I L 一1 0 浓度可通过质粒的重复注射使 其保持在一个稳态。结论尾静脉快速大容量注射法是一 种简单、方便和有效的大鼠体内基因转移及基因表达的方 法，为进一步探讨r I L 一1 0 基因在肝脏疾病的基因治疗打下基 础。 关键词：白介素1 0 ；大鼠；质粒D N A ；基因转移；基因表达；尾 静脉注射 寻求一种安全、有效的方法将外源基因转移至肝脏是肝 脏疾病基因治疗的关键之一。目前基因转移系统主要有病 毒载体系统和非病毒载体系统。鉴于病毒载体有着自身无 法克服的缺点，非病毒载体具有低毒，低免疫反应、外源基因 整合低、无基因插入片段大小的

4、限制，以及制作方便等优点 备受研究者的偏爱。有研究发现从小鼠尾静脉快速大容量 注射D N A 溶液，能够介导外源基因主要在肝脏表达，并且表 达水平较电穿孔法高1 万倍。但此方法在大鼠体内研究 报道甚少，本实验拟通过尾静脉注射r I L - 1 0 重组质粒探讨此 方法在大鼠体内应用安全性及可行性。 1 材料与方法 1 1 材料p c D N A 3 r I L - l O 真核表达质粒为本实验室构建， 可表达分泌型r l L - 1 0 。清洁级6S D 大鼠购自中国科学院上 海实验动物中心( 许可证号S C X K ( 沪) 2 0 0 3 - 0 0 0 3 ) ，清洁级 条件喂养，自由进

5、食进水。r I L 1 0 和1 3 a e t i n 引物由上海英骏 生物有限公司合成。r I L - 1 0 单克隆抗体及E L I S A 试剂盒均 收稿日期：2 0 0 8 0 2 1 6 ，修回E l 期：2 0 0 8 0 4 1 5 基金项目：福建省科技开发计划资助项目( N o2 0 0 5 0 0 9 4 ) 作者简介：黄月红( 1 9 7 6 一) 。女，博士生，检验师，肝脏疾病的基础与 临床，E m a i l ：2 0 0 3 h u a n g y h s i n a t o n i ； 王小众( 1 9 6 2 一) ，男，博士生导师，主任医师，肝脏疾病的 基础与

6、临床，通迅作者，E m a i l ：d r w a n g x z p u b 6 f z 巧1 3 1 1 购自美国B i o s o u r s e 公司。Q i a g e n1 V l a x i P r e pK i t 试剂盒购自 美国Q i a g e n 公司。 1 2 方法 1 2 1 质粒制备p e D N A 3 一r I L - 1 0 真核表达质粒的大量制 备严格按照试剂盒说明书进行并纯化。 1 2 2 质粒D N A 的尾静脉注射裸质粒D N A 尾静脉注射 法参照K u 等方法忙J 。具体操作如下，S D 大鼠在无麻醉或 1 0 水合氯醛( 剂量为3I I l

7、l k g q ) 麻醉下，用2 4G 的静脉 套管针尾静脉注射不同容积的林格液( 内含不同浓度的编 码r I L 一1 0 基因的质粒) ，在1 0s 以内完成注射。 1 2 2 1 注射容积的选择2 4 只清洁级i 5S D 大鼠，体重 2 0 0g ，按随机数字表分为4 组，每组6 只，各组分别注射剂量 为7 0 、8 0 、9 0 和1 0 0m l k g “的林格液，在1 0s 内注射完，观 察大鼠的存活率。 1 2 2 2 质粒浓度的选择9 只清洁级6S D 大鼠，体重 2 0 0g ，随机分为3 组，每组3 只，注射容积为8 0I I l l k g ，尾 静脉注射1 0 0

8、、2 0 0 、4 0 0I L gp c D N A 3 r I L 一1 0 真核表达质粒，在 1 0s 内注射完，注射后d1 处死大鼠，E L I S A 观察大鼠血浆中 r l L 一1 0 的表达。 1 2 2 3 质粒浓度与注射容积的关系清洁级S D 大鼠9 只，6 ，体重2 0 0g ，随机分为3 组，每组3 只，尾静脉注射2 0 0 l a gp c D N A 3 一r I L - 1 0 真核表达质粒( 质粒分别溶解于注射容积 为6 0 、7 0 、8 0m l k g 。的林格液中) ，在1 0s 内注射完，注射 后d1 处死大鼠，E L I S A 法观察大鼠血浆中r

9、I L 一1 0 的表达。 1 2 3 R T P C R 法检测d L I O m R N A 在大鼠不同组织中的 表达情况在大容量p e D N A 3 r I L 1 0 质粒溶液尾静脉注射 后，分别于d1 、d7 、d1 4 提取大鼠肝、肾、脾、肺和心组织各 1 0 0m g ，提取总R N A ，逆转录e D N A ，用r I L 一1 0 和1 3 一a e t i n 上下 游引物进行P C R 双扩增，产物片段分别为5 5 9 b p 和6 6 0 b p ， P C R 条件为9 4 预变性5m i n ，9 4 变性3 08 ，印退火4 5 s ，7 2 延长1r a i

10、 n ，共3 0 个循环。将8 斗lP C R 产物与标准 D N A 分子量M a r k e r 一同在1 5 琼脂糖凝胶上电泳，在紫 外灯下观察证实产物中有无目的基因并照像。 1 2 4 免疫组织化学检测r l L 1 0 蛋白在不同组织的表达 在p e D N A 3 - r I L 1 0 质粒注射后d1 取大鼠肝、肾、脾、肺和心 组织固定，进行免疫组化染色检测r I L - 1 0 蛋白的表达。 1 2 5 E U S A 法检测质粒重复注射后大鼠血浆中d L 一1 0 的 含量分别于p e D N A 3 - r l L - l O 质粒尾静脉注射0h , 8h 、d1 、 d3

11、 、d6 心脏取血，肝素抗凝收集大鼠血浆，E L I S A 法检测血 浆r I L 1 0 含量。 1 2 6 肝组织损伤检测分别于p e D N A 3 - r I L 一1 0 质粒尾静 脉注射后d1 、3d 、d7 、心脏取血，全自动生化分析仪检测血 浆中A S T 、A L T 的浓度，肝组织行H E 染色。 万方数据 中国药理学通报C h i n e s eP h a r m a c o l o g i c a lB u l l e t i n 2 0 0 8J u n ；2 4 ( 6 )8 3 5 1 2 7 统计学处理组间差异以方差分析进行统计检验， 数据经S P S S l

12、 0 0 版软件处理。 2 结果 2 1 尾静脉注射容积的选择参照小鼠质粒尾静脉注射的 方法。将不同容积的林格液( 按大鼠体重的百分比计算注射 容积) 在1 0s 内注射入大鼠的尾静脉，观察大容量的林格液 尾静脉注射后对大鼠的存活率的影响。观察发现当注射容 积为1 0 0m l k g 1 林格液后1 3r a i n ，大鼠呼吸、心跳加速， 随后口吐大量泡沫痰而死，存活率几乎为零；当注射容积为 9 0m l k g 。林格液时，大鼠存活率约为5 0 ；当注射容积为 7 0n l l k g 。和8 0I n l k g “林格液时大鼠存活率均为8 3 。 2 2 质粒D N A 的注射浓度给

13、大鼠尾静脉注射1 0 0 、2 0 0 、 4 0 0l a gp e D N A 3 - r l L - l O 质粒( 溶于舳I n l l 【g 。林格液中) ， 结果发现质粒浓度为1 0 0I J g 时血浆中r I L 一1 0 含量为( 0 6 2 0 1 ) 峭L 一，质粒浓度为2 0 0l a g 时血浆中r I L - l O 表达 含量最高达( 5 3 4 8 2 8 ) 雌L ，当进一步提高注射质粒 的浓度至4 0 0l a g 后，r I L 一1 0 表达含量并末出现增高反而降至 ( 3 5 8 5 3 1 ) 峭L 。如F i g1 所示。 l o o2 0 04

14、0 0 p e D N A 3 - r I L - 1 0i a j o c t e d I Ig F i g1 E t T e e l so fd i l E l e r e n tl l l a s m i dd o s 鳃0 1 1 1 1 r l L - l Og e n ee X p 硎O l D I P 0 0 5 ) ；肝组织H E 染色也显示注射后 d1 时，肝组织主要表现为少数细胞肿胀坏死，肝窦间隙增 宽，大部分肝细胞结构正常。以上结果说明肝功能的变化与 注射的质粒无关，主要与注射体积有关。 3 讨论 I L 1 0 是一种具有多种生物学功能的细胞因子口】，本实 验室前期研究

15、表明外源性I L 1 0 腹腔注射能有效改善肝纤 维化过程M j l ，但同时也提出了新的问题，即由于I L 1 0 的半 衰期很短，为达到治疗剂量需重复注射，给其进一步的临床 应用带来困难。近年来随着分子生物学技术的不断发展，基 因治疗已日益成为治疗各种肝脏疾病的重要手段。使外源 基因能安全有效到达肝脏是肝脏基因治疗的前提，目前，外 源基因有效转移到达肝脏的方法主要有两种，一种是以病毒 为载体的转移系统，以腺病毒载体最为常用陋1 。另一种为非 病毒转移系统，主要有裸D N A 注射、脂质体介导基因转移及 受体介导的基因转移系统。当W o l f f 等。刊首次证实肌肉内 直接注射质粒D N

16、A 后可在肌细胞中检测到外源基因的表 达。随后许多研究证实裸质粒D N A 局部注射可使外源基因 成功表达“0 1 。“u 等口1 经小鼠尾静脉快速大容量注射表 达1 3 - 半乳糖苷酶质粒D N A 溶液，结果发现此法可使B 一半乳 糖基因有效到达肝组织并在肝组织中高表达。进一步研究 B 一半乳糖苷酶基因表达与注射的时间、注射容积以及质粒浓 度之间的相关性，结果提示当注射容积为小鼠体重的8 1 2 时，注射时间控制在5s 内，5t t gB 一半乳糖基因经尾静 脉注射时可以获得外源基因在肝脏的最高表达。由于该方 法简单，易于操作且毒性小故为I L 1 0 肝脏疾病的基因治疗 提供了一新思路。

17、尽管目前尾静脉大容量注射法能使外源 基因在小鼠体内高表达得到了广泛的认识! “，但此法在 大鼠体内的应用研究报道甚少。本实验目的是探讨尾静脉 大容量快速注射法在大鼠体内是否适用，以r I L - 1 0 基因为报 告基因探讨r l L 1 0 基因经尾静脉大容量快速注射后在体内 的表达水平与质粒注射浓度和质粒注射容积的关系及在体 内表达的分布情况，为下一步用r I L 一1 0 基因进行肝纤维的基 因治疗打下基础。 “u 等研究证实，外源基因在体内的高表达与质粒注射 容积和注射时间密切相关。本实验拟参照小鼠尾静脉注射 的方法在注射时间上均控制在1 0s 以内，但由于大小鼠之 间个体差异较大，故

18、本研究首先着重探讨该方法在大鼠体内 应用时的注射容积与质粒浓度的选择。初步研究发现当尾 静脉注射容积为大鼠体重的1 0 0m l k g 。时，几乎所有的大 鼠在不到3r a i n 时即出现呼吸、心跳加速，随后口吐大量泡 沫痰而死，这一点与小鼠体内的应用差别较大，小鼠一般推 荐的注射容积为小鼠体重的8 一1 2 。容积减少大鼠的 死亡率下降，当注射容积为大鼠体重的7 0I I l l k g 。1 和8 0I I l l k g “时，大部分的大鼠均能耐受。进一步观察外源基因表 达与注射容积的关系，E L I S A 检测发现当注射容积为8 0I I l l k g “时外源基因可在体内高表

19、达，当注射容积为7 0 “ k g 。时，外源基因表达含量明显下降。但当注射容积为6 0 m 卜k g 。1 时体内仍可检测到目的基因表达，但浓度较8 0m l k g 。1 时下降了8 0 倍。说明在大鼠体内外源基因的表达与 注射容积紧密相关且随着容积的下降目的基因表达亦明显 下降。在质粒浓度的注射选择上，按大鼠体重每1 0 0g 分别 注射浓度为5 0 、1 0 0 、2 0 0t r g 质粒D N A ，结果发现当注射浓度 为1 0 0t t g 1 0 0g 一体重时血浆中m 。一1 0 含量最高，为质粒 注射的最佳浓度。 尾静脉注射后尽管可在血浆中检测到高浓度的r l L 一1 0

20、 ， 但目的基因在大鼠的体内各个器官中是否同样具有较高水 平的表达呢? 通过R T P C R 法及组织免疫化学方法检测质 粒注射后不同时间不同组织部位r l L 一1 0 的表达，结果发现 r l L - 1 0 主要在肝脏组织有很高的表达，其次在肾脏组织也有 ，I咖T1，0_1一鼍铀。蜀。一苗暑ao口oU 万方数据 中国药理学通报C h i n e s eP h a r m a c o l o g i c a lB u l l e t i n2 0 0 8J u n ；2 4 ( 6 ) 8 3 7 极少量的表达，而心、肺、脾组织中末检测出r l L 一1 0 的表达。 这可能与肝和肾组织

21、与下腔静脉直接相连有关。在r l L 一 1 0 R N A 水平在肝组织中可持续到d1 4 时仍有较高表达，蛋 白水平下降的较快，但d7 时仍有部分肝细胞高表达r I L - 1 0 ， 结果进一步提示裸质粒尾静脉大容量快速注射法不仅在小 鼠体内可行，而且在大鼠体内也同样适用。外源基因不仅可 在体内高表达而且主要定位于肝组织。由于血浆中r l L - 1 0 浓度下降速度较快，是否可通过质粒重复注射来达到使血浆 中r t L 1 0 保持一个相对稳定的水平呢? 结果证实可通过每 周一次的质粒重复注射使血浆中保持一个较高水平的r I L 1 0 浓度，且再次注射后血浆r l L 一1 0 浓度

22、变化曲线与首次注 射时相似。 大容量快速注射法是否会引起肝功能的严重损伤呢? 肝组织H E 染色只见在注射后d1 肝细胞有少许肿胀坏死， 林格液注射组与裸质粒D N A 注射组血浆A S T 、A L T 在注射 后d1 有明显的升高，随后下降，并于d3 时降至正常水平。 且注射不同溶液动物的体重没有明显的改变，进一步说明尾 静脉大容量快速注射法对肝脏的损伤是暂时的，肝功能的变 化与注射的质粒关系不大，主要与体积和操作过程有关，可 在大鼠体内的应用。 综上所述，要使外源基因在体内表达，尾静脉快速大容 量注射法是一个简单，易于操作而且低毒性的基因转移系 统，且实验结果证实此方法在大鼠体内的应用是

23、可行的也是 安全的，为下一步研究r I L - 1 0 的肝纤维化基因治疗打下方法 学的基础。 参考文献： 1 J i a n gJJ ，Y a m a t oE i j i ，M i y a z a k iJ n n i e h i I n t r a v e n o u sd e l i v e r yo f n a k e dp l a s m i dD N Af o ri n 勘c y t o k i n ee x p r e s s i o n J B i o e h e m B i o p h y s 鼢C o m , m m ，2 0 0 1 ，2 8 9 ( 5 ) ：1 0

24、8 8 9 2 2 “uF ，S o n gYK ，L i uD H y d r o d y n a m i c s - b a s e dt r a m f e c t i o ni na n i r e a l sb ys y s t e m i ca d m i n i s t r a t i o no fp l a s m i dD N A J G e n e 死g e r a - P Y 。1 9 9 9 ，6 ( 7 ) ，1 2 5 8 6 6 3 郑绪阳，谢强敏，杜晓刚，等吡拉米司特在大鼠急性肺损伤模 型中降低P D F A 活性与T N F - a I L 1 0 平衡有关

25、J 中国药理 学通报，2 0 0 6 ，2 2 ( 1 2 ) ：1 4 9 9 5 0 4 3 Z h e n gxY ，X i eQM ，D uXG ，e ta 1 P i c l a m i l a s tr e d u c e dP D F A - t i v i t ya s s o c i a t e dw i t l It h eb a l a n c eb e t w e e nT N F - aa n dI L 一1 0d u r i n g a c u t el u n gi n j u r yi nr a t J C h i nP h a r m a c o lB u l

26、 l ，2 0 0 6 ，2 2 ( 1 2 ) ： 1 4 9 9 5 0 4 4 史美娜，王小众，郑伟达。等白介素一1 0 对肝纤维化大鼠星状 细胞E G F 及H G F 表达的影响 J ，中国药理学通报，2 0 0 5 ，2 1 ( 3 ) ：3 2 7 3 1 4 S h iMN ，W a n gXz ，Z h e n gWD ，e ta 1 E f f e c to fI L - 1 0o nt h ee x - p r e s s i o no fE G Fa n dH G F o fH S Co fh e p a t i cf i b r o s i sr a t J C h

27、i n P h a r m a c o lB u l l ，2 0 0 5 ，2 1 ( 3 ) ：3 2 7 3 1 5 H u n n g Y H ，S h i M N ，Z h e n g W D ，e la 1 T h e r a p e u t i ce f f e c to f i n t e r - l e u k i n 一1 0o nc c l 4 一i n d u c e dh e p a t i cf i b r o s i si nr a t s J W o r l d _ ， G a s t r o e u t e r o l 。2 0 0 6 ，1 2 ( 9 )

28、：1 3 8 6 9 1 6 S h e t t yK ，W uGY ，W ucH G e n et h e r a p yo f h e p a t i cd i s e s e s ：p r o s - p e c J ，1 ) t s J f o rt h ，e n e wm i l l e n n ，i u m G u ，t2 a 1 0 0 0 4 6 ( ：136-97W o l f fAM a l o n eRWW i H i a m sPe tD i r e c tg e n et r a n s f e ri n t o m o R s em u s c l e nv v o

29、 J S c e n c e ，1 9 9 0 ，2 4 7 ( 4 9 4 9 ) ：1 4 6 5 8 8 Z h a n gGE 。V a r g oD ，B u d k e rV ，e ta 1 E x p r e s s i o no f n a k e dp l a s m i d D N Ai n j e c t e di n t ot h ea f f e r e n ta n de f f e r e n tv e s s e l so fr o d e n ta n d d o gl i v e r s J H u mG e n eT h e r ，1 9 9 7 ，8 (

30、 1 5 ) ：1 7 6 3 7 2 9 B u d k e rV ，Z h a n gG ，K n e c h t l es ，e ta 1 N a k e dD N Ad e l i v e r e di n t r a - p o r t a l l ye x p r e s s e se f f i c i e n t l yi nh e p a t o c y t e s J C , e n e 刀b ，1 9 9 6 ，3 ( 7 ) ：5 9 3 8 1 0 JL iK ，W e l i k s o nRE ，V i k s t r o mKL ，L e i n w a n d

31、LA ，D i r e c tg e n e t r a n s f e r i n t o t h e m o u s eh e a r t J J M o l C e l C a r d w l ，1 9 9 7 ，2 9 ( 5 ) ： 1 4 9 9 5 0 4 11 W o l f fJA ，B u d k e rV T h em e c h a n i s mo fn a k e dD N Au p t a k ea n d e x p r e s s i o n J A d vG e n e t ，2 0 0 5 ，s 4 ( 8 ) ：3 2 0 1 2 S e b e s t

32、 y e nMG ，B u d k e rVG ，B u d k e rT ，e ta 1 M e c h a n i s mo fp l u s - m i dd e l i v e r yb yh y d r o d y n a m i ct a i lv e i ni n j e c t i o n I H e p a t o c y t e u p t a k eo fv a r i o u sm o l e c u l e s J JG e n eM e d ，2 0 0 6 ，8 ( 7 ) ：8 5 2 7 3 1 3 B u d k e rVG ，S u b b o t i n

33、VM ，B u d k e r T ，e ta 1 M e c h a n i s mo f p l a s m i d d e l i v e r yb yh y d r o d y n a m i ct a i lv e i ni n j e c t i o n I I M o r p h o l o g i c a l s t u d i e s J JG e n eM e d ，2 0 0 6 ，1 t ( 7 ) ：8 7 4 8 8 I n t r a v e n o u si n j e c t i o no fe x o g e n o u sr I L - 1 0p l a

34、s m i dD N Aa n di t se x p r e s s i o ni nr a t s H U A N GY u e h o n g 。C H E NY u n x i n C H E NZ h i x i n 。W A N GX i a o z h o n g ( U n i o nH o s p i t a lo f F u j i a nM e d i c a lU n i v e r s i t y ，F u z h o u3 5 0 0 0 1 ，C h i n a ) A b s t r a c t ：A i m T oe s t a b l i s ham e t

35、 h o do fh y d r o d y n a m i c b a s e da ne f f i c i e n tt r a n s f e ra n de x p r e s s i o no fr I L - 1 0i nr a tl i v e rc o u l db e t r a n s f e c t i o n ( H B T ) a n dp r o v i d eam e a n si n r a t so ft h eg e n ea c h i e v e db yar a p i di n j e c t i o no fal a r g ev o l u m

36、 eo fr l L 一1 0D N A t 1 1 e r a p yo fl i v e rd i s e a s e s w h i c ha l l o w e da ne f f i c i e n te x p r e s s i o no f s o l u t i o ni n t or a tv i at a i lv e i n M a i n t a i n i n gas t a b l ee x p r e s s i o no f r l L 一1 0g e n ei n r a tl i v e r M e t h o d s U s i n gd L - 1 0

37、g e n ea sa r e -r l L - 1 0i ns e n l mc o u l db ea a s e s s e db yr e p e a t e da d m i n i s t r a t i o n p o r t e rg e n e ，d i f f e r e n tv o l u m e sa n dd o s e so fp l a s m i dD N As o l u - t i o n sw e r er a p i d l yi n j e c t e di n t or a tt a i lv e i n ，t h e nt h e $ e r u

38、 l na n d t h et i s s u eo f l i v e r ，k i d n e y ，l u n g ，s p l e e na n dh e a r ti nd i f f e r e n tt i m e w e r ec o l l e c t e da n dt h ee x p r e s s i o no fr l L 一1 0w a sd e t e c t e db yt h e m e t h o d so fR T - P C R ，E L I S Aa n di m m u n o c h e m i s t r y R e s u l t sU s

39、 i n gr l L 一1 0g e n ea sur e p o r t e rg e n e ，t h er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a t C o n c l u s i o nT h eH B Tw a sas i m p l e ，c o n v e n i e n ta n de f f i c i e n t m e t h o do fg e n et r a n s f e ra n de x p r e s s i o ni nr a t s ，w h i c hc o u l db e u s e d 船a ne f f e c t i v e n e a n st os t u d yf u r t h e rg e n et h e r a p yo fr I L - 1 0i nf i v e rd i s e a s e s K e yw o r d s ：i n t e r l e u k i n 一1 0 ；r a t ；p l a s m i dD N A ；g e n et r a n s f e r ； g e n ee x p r e s s i o n ；t a i lv a i ni n j e c t i o n 万方数据