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1、3 2 2 些亘医型太堂堂亟f 曼! 塑兰i 丛垡型望堡) 呈Q ! Q 堡垒旦：堡! ( 堡2 大肠杆菌甲基化缺陷D M l 菌株与普通D H S a 菌株的感受态转化率的比较 薛亮亮，司苏晋，雷小春， 刘田福 ( 山西医科大学实验动物中心，太原0 3 0 0 0 1 ； 通讯作者，E - m a i l ：y k d l t f y a h o o c o r n c n ) 摘要：目的观察甲基化缺陷的大肠杆菌D M I 菌株与普通D I - 1 5 a 菌株感受态转化效率的差别。 方法用常规氯化钙法 制备二者的感受态细胞，质粒转化后计算转化率。结果D M l 菌株感受态细胞转化率为( 2
2、 2 0 3 ) 1 0 6C F U I 咀g ，D H S a 菌株感受态细胞转化率为( 6 3 0 5 ) 1 0 6C F U t t g 。结论成功建立一种高效制备甲基化缺陷菌株D M I 感受态细胞的方 法，虽然该法制备D M I 感受态细胞转化效率比D H S a 低2 3 倍，但其能够高效满足质粒克隆实验中D a m 或D c m 甲基化的限 制性位点的使用要求。 关键词：感受态细胞；甲基化；D M I ；D I - 1 5 c t ；转化率 中图分类号：R 一3 3 2文献标志码：A文章编号：1 0 0 7 6 6 1 1 ( 2 0 1 0 ) 0 4 0 3 2 2 一0
3、 3 C o m p a r a t i v es t u d yo nt r a n s f o r m a t i o no fd e m e t h y l a t i o nE s c h e r i c h i ac o l iD M la n dD H 5 仅c o m p e t e n tc e l l s X U EL i a n g - h a n g ，S IS u - j i n ，L E IX i a o - c h u n ，U UT i a n f u + ( L a b o r a t o r yA n i m a lC e n t e r ，S h a n x
4、 iM e d i c a lU n h , e r s 渺，T a i y u a n0 3 0 0 0 1 ， C h i n a ；C o r r e s p o n d i n ga u t h o r ，E m a i l ：y k d l t f y a h o o c o m c n ) A b s t r a c t ： O b j e c t i v e T oc o m p a r et h ed i f f e r e n c eo ft r a n s f o r m a t i o nb e t w e e nd e m e t h y l a t i o nEc o
5、 l iD M la n dD I - 1 5 ac o m p e t e n tc e l l s M e t h o d s D e m e t h y l a t i o nE c o l iD M1a n dD H 5 仪c o m p e t e n tc e l l sw e r ep r e p a r e db yt h er o u t i n eC a C l 2m e t h o d ，a n dt h e nt h et r a n s f o n n a - t i o no fc o m p e t e n tc e l l sw a sc a l c u l a
6、 t e d R e s a l t sT h et r a n s f o r m a t i o nw a s ( 2 2 0 3 ) 1 0 6C F U p 。g ，( 6 34 - 0 5 ) 1 0 0C F U P 4 9i n d e m e t h y l a t i o nEc o l iD M la n dD H 5 ac o m p e t e n tc e l l s r e s p e c t i v e l y C o n c l u s i o nA ne f f i c i e n ta n dr a p i dm e t h o df o rt h ep r
7、 e p a r a t i o no f d e m e t h y l a t i o nE c o l iD M lc o m p e t e n tc e l l si ss u c c e s s f u l l ye s t a b l i s h e d w h i c hc a nb ee f f i c i e n t l yu t i l i z e di nm o l e c u l a rc l o n i n gf o rD a m o r D c mr e s t r i c t i o ns i t e s K e yw o r d s ：c o m p e t
8、e n tc e l l ；m e t h y l a t i o n ； Ec o l iD M l ；Ec o l iD H 5 旺；t r a n s f o r m a t i o n 感受态细胞的制备和转化是分子生物学实验中 频繁使用的重要操作，最早的大肠杆菌感受态细胞 制备的方法是C o h e n 等于1 9 7 2 年建立的，该方法 的主要原理是细菌通过冰冷的C a C l ：低渗溶液处理 后，加入待转化质粒D N A ，经4 2 短时间热冲击， 1 6 1 7 1 8 1 9 J 细菌细胞可增加对该质粒D N A 的摄人，该法已成为 目前实验室制备感受态细胞的常规实验方法。对
9、细 菌而言，为达到高效转化，活细胞数务必少于1 0 8 细 膨I I l l 。对于大多数Ec o l i 来说，相当于O D 鲫为0 4 左右2 l 。大多数大肠杆菌都含有由d a m 因编码 T a k a h a s h iK 。S o n o d aS ，H i g a s h iK ，da P r e d o m i n a n tC D 4T - l y m p h o c y t et r o p i s mo fh u m a nh e r p e s v i r u s6 - r e l a t e dv i r u s J J V i m i ，1 9 8 9 ，6 3 ：
10、3 1 6 1 3 1 6 3 W a n gF ，Y a cK ，Y i nQ Z ，e ta H u m a nH e r p e s v i r u s - 6 S p e c i f i cI n t e r l e u k i n1 0 - P r o d u c i n ge l m ( + ) TC e l l sS u p p r e s st h eC D 4 ( + ) T - C e l lR e s p o n s ei nI n f e c t e dI n d i v i d u a l s J M i c r o b i o lI m m u n o l ， 2
11、0 0 6 ，5 0 ( 1 0 ) ：7 8 7 8 0 3 A b d e l H a qN M ，A s m a rB I H u m a nh e r p e s v i m s6 ( H H V 6 ) i n f e c t i o n J I n d i a nJP e d i a t r ，2 0 0 4 ，7 1 ( 1 ) ：8 9 9 6 P e n gS ，T o m s o nT ，T r i m b l eC ，封甜Ac o m b i n a t i o no fD N A 啪 c i n e st a r g e t i n gh u m a np a p i
12、l l o m a v i r u st y p e1 6E 6a n dE 7g e n e r - a r e s p o t e n ta n t i t u m o re f f e c t s J G e n eT h e r a p y ，2 0 0 6 ，1 3 ( 3 ) ： 基金项目：山西省实验动物科研专项基金资助项目 2 0 0 8 k 0 2 2 5 7 2 6 5 2 0 K a l p a n aD M ，G i l l i s o nT C D e v e l o p m e n to fH P V 愀i f o rH P V - a s s o c i a t e
13、 dH e a da n dn e c ks q u a m o u sc e l lc a r c i n o m a J C r i tR e v O r a lB i o lM e d ，2 0 0 3 ，1 4 ( 5 ) ：3 4 5 3 6 2 2 1 D eC a r v a l h oN S C e r v i c a lc a n c e rv a c c i n a t i o n ：T h er e a lm e a n i n go f c r 0 8 8 一p r o t e c t i o na n di t si m p a c to nt h ep r e v
14、e n t i o n J V a c c i n e ， 2 0 0 8 ，2 6 ( 5 0 ) ：6 2 9 3 6 2 9 4 作者简介：姚姣利，女，1 9 7 9 0 9 生，硕士，主治医师，E - m a i l ：y a o j i a o l i t y 1 6 3 c o r n 收稿日期：2 0 0 9 一儿一1 3 万方数据 出酉匡型太堂堂握f 璺堕璺幽丛鲤堕坐2 垫! Q 生兰旦：垒! l 垒2 的D a m 甲基化酶和由d c m 基因编码的D c m 甲基化 酶，使得提取的D N A 都被D a m 和D c m 甲基化酶修 饰【3 4 】，这使某些限制性内切酶(
15、如E c o R ，M b oI 和西H 等) 不能切割目标D N A ，而甲基化缺陷菌株 可以解决该问题，本实验用平行对照的方式初步探 讨甲基化缺陷菌株D M l 感受态细胞的制备。 1 材料与方法 1 1 试剂菌株与质粒：D M l 菌株，D H 5 0 t 菌株和 P s p 7 3 载体质粒( 浓度为5 0 0n g 斗1 ) 均购自美国 P R O M E G A 公司。其余试剂均为国产分析纯，L B ( L u r i a B e r t a n i ) 培养基，2 Y T 培养基，氨苄青霉素 溶液，0 1m o l LC a C l 2 溶液，2 0m m o l LM g C
16、l 2 + 8 0 m m o l LC a C l ：溶液，均按S a m b r o o k 等拉。著的分子 克隆实验指南的要求配制。质粒提取试剂盒购自 美国O M E G A 公司。 1 2 仪器培养皿、量杯、细菌接种环、酒精灯、1 0 m l 试管、微量加样器、冰盒，恒温振荡器T H D Z ，细 菌培养箱，无菌超净台，高速冷冻离心机3 1 8 K ，紫 外可见光分光光度计。 1 3 方法 1 3 1 细菌培养用接种环从冻存的D M l 菌株与 D H S c t 菌株保存液中各沾取少量菌液。从培养皿的 固体培养基( D M l 菌株使用固体2 Y T 培养基， D H 5 仅菌株使用
17、固体L B 培养基) 的边缘划一连续的 波浪线，在另一方向划出第二道波浪线，如此重复划 板，将大肠杆菌接种在固体培养基上，在划板时，动 作要迅速，以免过夜培养后菌落过于密集，不易挑取 单克隆。将培养皿倒置在恒温培养箱中，3 7 培养 1 2 1 6h ，培养时间不宜过长，菌落大小不宜超过5 m m 。取出培养皿，用细菌接种环挑取D H S o t 单个菌 落一个，放入含有5m lL B 液体培养基的试管中；另 挑取D M l 单个菌落一个，放人含有5m l2 Y T 液 体培养基的试管中封好管口( 注意：不能旋紧) 。3 7 恒温振荡器2 2 5r r a i n 振荡培养过夜( 1 2 1
18、6h ) 。 1 3 2 感受态细胞的制备次日，取出试管，取 1 0 0 斗lD H S o t 菌株培养液加人1 0 0m l 液体L B 培养 基中，取1 0 0 斗lD M l 菌株培养液加人1 0 0m l 液体2 Y T 培养基中，3 7 恒温振荡器2 2 0r m i n 振荡培 养，每隔3 0m i n 用紫外分光光度计测定O D 锄值，当 O D 鲫值达到O 3 5 0 4 5 时，收获菌液。此时迅速 移至冰上，静置2 0m i n ，40 0 0r m i n 离心1 0m i n ，倾 去上清液；将沉淀重悬于6 0 “2 0m m o l LM g C l 2 + 8 0m
19、 m o l LC a C l 2 溶液中，冰上静置1 0m i n ；离心， 3 2 3 40 0 0r m i n ，1 0m i n ，倾去上清液，用4I I l l0 1m o l L C a C l ：溶液将沉淀重悬；此时，试管中的溶液即为制 备好的新鲜的D 1 4 5 0 t 与D M l 感受态细胞，1 0 0 山分 装后加入2 0 甘油一7 0 冰箱长期保存，在整个制 备过程当中，盛装细菌的离心管要尽量保证浸没在 冰中。 1 3 3 标准质粒的制备与转化取1 肛lp S P 7 3 载 体质粒( 浓度为5 0 0n s “1 ) 稀释至5H d ，制成转化用 的标准浓度为0 1
20、n g m 质粒，保存于一2 0 。各 取6 管( 1 0 0 管) 在一8 0 保存1 2 1 4h 的 D H 5 a 与D M l 感受态细胞分别转化l 斗l 标准质粒， 转化结束后D M l 加入9 0 0 斗l 液体2 Y T 培养基， D I - I S a 加入9 0 0 一液体L B 培养基，3 7 恒温振荡 器2 2 5r m i n 振荡培养lh ，每管取2 0 0 山，每板1 0 0 出涂两个平板( D M l 菌株使用固体2 Y T 培养基， D H S c t 菌株使用固体L B 培养基) ，将培养皿倒置在 培养箱中，3 7 培养1 2 1 6h 。 1 3 4 转化
21、效率的计算与统计学分析转化效率 ( C F U 斗g ) = ( 每皿转化子平均数菌悬液稀释倍 数) 质粒微克数，每皿转化子平均数是指每管感受 态细胞所涂的两个平板菌落的平均数。采用两独立 样本t 检验对数据进行统计学分析。 2 结果 按照公式计算，D H S c t 菌株感受态细胞转化率 为( 6 3 0 5 ) 1 0 0C F U 斗g ，D M l 为( 2 2 0 3 ) 1 0 6C F U 肛g ，后者比前者低2 3 倍，差异有统计学 意义( P 0 0 5 ) ，结果见表1 。 表1大肠杆菌D M l 与D I - 1 5 a 菌株的感受态细胞转化率 的比较( 1 0 6C F
22、 U t r g ) T a b1 C o m p a r i s o no ft r a n s f o r m a t i o nb e t w e e nEc o l i D M Ia n dD H 5 ac o m p e t e n tc e l l s ( 1 0 6C F U p g ) 与D M I 菌株间比较，P 0 0 5 3 讨论 感受态细胞制备后是否具有高的转化效率，可 以用其转化任意质粒D N A 来检验。在C a C l ：法 制备感受态细胞中，影响因素有：C a C l ：与M g C l ： 溶液的浓度，本实验中参照王世伟等吲的研究使用 万方数据 3 2 4 2
23、 0m m o l LM g C l 2 + 8 0m m o l L C a C l 2 溶液得到了很 高的转化效率；细菌的生长状态，根据笔者的观察 D M l 菌株生长速度较D H 5 0 t 略慢，其O D 鲫值达到 0 3 5 0 4 5 的时间比D H 5 c t 晚约0 3h ；玻璃和 塑料容器的清洁，微量的洗洁剂或其他化学物质会 大大降低细胞的转化效率，因此，所有的器皿都应高 压灭菌，整个过程都应在无菌条件下操作；保存条 件和热激时间，本次实验参照王世伟等 6 1 的研究条 件，一8 0 保存1 2 1 4h 后转化，4 2 热激9 0s 实 现了高效转化，虽然两种菌株转化效率相
24、差2 3 倍，但还在同一数量级，说明常规氯化钙法制作感受 态对该菌株有效，两种菌株的活力与生长情况相似， 可以将制作D H 5 0 t 菌株感受态的条件直接应用于 D M l 菌株。 现在，常用的制备感受态细胞的方法除用 C a C l ：制备感受态细胞法外，还有制备超级感受态 细胞的I n o u e 法“ J 、H a n a h a n 法【8o 外法以及制备电 穿孔感受态细胞法【9 l 训等。氯化钙制备感受态细胞 法因其操作简便，经济有效深受广大研究者关注。 大多数大肠杆菌都含有由d a m 基因编码的D a m 甲 基化酶和由d c m 基因编码的D c m 甲基化酶，前者编 码的D
25、 a m 甲基化酶能将甲基转移到G A T C 序列中 的腺嘌呤N 6 位点上【1 1 | ，后者编码的D c m 甲基化酶 能在C C A G G 和C C T G G 序列内部的胞嘧啶C 5 位置 上甲基化2 | ，如果限制性内切酶的识别位点是从表 达D a m 或D c m 甲基化酶的菌株中分离而得，并且 其甲基化识别位点与内切酶识别位点有重叠，那么 该限制性内切酶的部分或全部酶切位点有可能不被 切割，被D a m 或D c m 甲基化的限制性位点可以通 过克隆D N A 至甲基化缺陷菌株进行去甲基化。本 次实验表明，常规氯化钙法可以有效地制备甲基化 缺陷的D M l 菌株高效感受态细胞
26、，这对D a m 或 D c m 甲基化的限制性位点在分子克隆中的应用具 有重要意义，对于其他方法能否得到更高的转化效 率以及现有方法是否可以进一步改善有待进一步研 究。 参考文献： 1 C o h e nS N ，C h a n gA C ，H s uL N o n e h r o m o s o m a la n t i b i o t i cr e s i s t n c ei nb a c t e d a ：g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o no fE s c h e r i e h i ac o l ib yR f a c t o rD N
27、 A J P r o cN a t lA c a dS c iUSA ，1 9 7 2 ，6 9 ( 8 ) ：2 1 1 0 2 1 1 4 2 S a m b r o o kJ ，R u s s e l lD W 分子克隆实验指南 M 黄培堂，译 3 版北京：科学出版社，2 0 0 2 ：9 6 9 9 3 P r a t tK ，H a t t m a nS D e o x y r i b o n u c l e i ca c i dm e t h y l a t i o na n dc h r o - m a t i no r g a n i z a t i o ni nt e t r
28、 a h y m e n at h e r m o p h i l a J M o lC e l lB i o l ， 1 9 8 1 ，1 ( 7 ) ：6 0 0 6 0 8 4 D r e i s o i k e l m a n nB ，E i c h e n l a u bR ，W a e k e r n a g e lW T h ee f f e c to f d i f f e r e n t i a lm e t h y l a t i o nb yE s c h e r i e h i ac o l io fp l a s m i dD N Aa n d p h a g eT
29、7a n dl a m b d aD N Ao nt h ec l e a v a g eb yr e s t r i c t i o ne n d o n u - c l e a s oM b o lf r o mM o r a x e l l ab o v i s J B i o c h i mB i o p h y sA c r e 。 1 9 7 9 ，5 6 2 ( 3 ) ：4 1 8 4 2 8 5 M a n d e lM ，H i g aA C a l c i u m d e p e n d e n tb a c t e r i o p h a g eD N Ai n f e
30、 c t i o n J J M o lB i o l ，1 9 7 0 ，5 3 ( 1 ) ：1 5 9 1 6 2 6 王世伟，李旭业，张伟伟优化感受态细胞制备方法提高转化 效率的研究 J 齐齐哈尔大学学报，2 0 0 9 ，2 5 ( 3 ) ：8 6 - 9 0 7 I n o u eH ，N o j i m aH 。O k a y a m aH H i g he f f i c i e n c yt r a n s f o r m a t i o no f E s e h e r i c h i ac o b 试t l lp l a s m i d s J G e n e ，1 9
31、 9 0 ，9 6 ( 1 ) ：2 3 2 8 8 】H a n a h a nD S t u d i e so nt r a n s f o r m a t i o no fE s c h e f i c h mc o l iw i t h p l a s m i d s J JM o lB i o l ，1 9 8 3 ，1 6 6 ( 4 ) ：5 5 7 5 8 0 9 D o w e rW J ，M i H e rJ F ，R a g s d a l eC W H J 曲e f f i c i e n c yt r a l 僦o r m a t i o no fE c o l ib
32、 yh i s hv o l t a g ee l e c t r o p o r a t i o n J N u c l e i cA c i d s R e a ，1 9 8 8 ，1 6 ( 1 3 ) ：6 1 2 7 6 1 4 5 1 0 3 T a k e t oA D N At r a n s f e c t i o no fE a c h e r i e h i ac o l ib ye l e e t r o p o r a t i o n J B i o c h i mB i o p h y sA c t a 。1 9 8 8 ，9 4 9 ( 3 ) ：3 1 8 3
33、2 4 1 1 R a l e i g hE A ，W i l s o nG E s c h e r i c h i ac o i lK - 1 2r e s t r i c t sD N Ac o n m i n i n g5 - m e t h y l e y t o s i n e J P r o cN a i lA c a dS c iU SA ，1 9 8 6 ，8 3 ( 2 3 ) ：9 0 7 0 9 0 7 4 1 2 R a l e i g hE A O r g a n i z a t i o na n df u n c t i o no ft h em e r B Cg e n e so f E s c h e r i c h i ae o l iK - 1 2 J M o lM i c r o b i o l ，1 9 9 2 ，6 ( 9 ) ：1 0 7 9 1 0 8 6 作者简介：薛亮亮，男，1 9 8 4 0 3 生，在读硕士，E m a i l ：x u e 1 i a n g l i a n 9 2 0 0 8 1 6 3 c o r n 收稿日期：2 0 1 0 0 2 0 2 万方数据