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1、大肠埃希菌 DNA 对小鼠抗 IFN-免疫应答的增强作用 李京培， 毕克菊， 王明丽 摘要 目的 探讨大肠埃希菌 （E. coli） DNA 对小鼠抗 IFN- 免疫增强的作用。方法 Balb/ c 纯系小鼠随机分成 8 组， 生 理盐水对照组 （A） ；E. coli DNA 50 g + IFN- 1. 0 g （B） ； 弗氏完全佐剂 + E. coli DNA + IFN- （25 g +25 g +1. 0 g）（C） ；弗氏完全佐剂 50 g + IFN- 1. 0 g （D） ； 不加任 何佐剂的 IFN- （E） ；E. coli DNA 12. 5 g + IFN- 1. 0
2、 g （F） ；E. coli DNA 50 g + IFN- 0. 25 g （G） ；E. coli DNA 12. 5 g + IFN- 0. 25 g （H） 。小鼠腹部皮下注射， 首次免 疫后加强免疫 2 次，用微量中和实验、 MTT 法和细胞流式技 术分别检测小鼠体液免疫和细胞免疫状态。结果 经组间 单因素相关性分析， E. coli DNA 和弗氏完全佐剂均能明显增 强小鼠特异的体液免疫和细胞免疫， 其中 E. coli DNA 刺激 IFN- 抗体剂量效应和脾淋巴细胞活性均与弗氏完全佐剂 相当 （P 0. 05） ， 而 E. coli DNA 免疫后 IFN- 抗体的时效性
3、较弗氏完全佐剂效果好。结论 E. coli DNA 具有强烈的免 疫刺激作用， 可成为一种新型免疫佐剂。 主题词 埃希氏菌属；DNA，细菌；干扰素 ；小鼠 自由词 免疫增强；佐剂 ；弗氏完全佐剂 中图分类号 R 342；R 378. 99；R 392 文献标识码 A 文章编号 1000 -1492 （2006） 04 -0379 -04 2005 -11 -14 接收 基金项目： 合肥市科研计划项目 （编号： 合科合同农字 2004.5） 作者单位： 安徽医科大学微生物学教研室， 合肥 230032 作者简介： 李京培， 男， 44 岁， 高级实验师； 王明丽， 女， 50 岁， 教授， 硕士
4、导师， 责任作者， E-mail： wangmlli mail. hf. ah. cn 近来研究发现， 细菌的 DNA 中 CpG 基元即以 未甲基化的 CpG 二核苷酸为核心的特定寡核苷酸 序列 （oligonucleotide， ODN） 在细菌基因组中普遍存 在， 它既是脊椎动物免疫细胞特异性识别细菌 DNA （CpGDNA） 的结构基础， 也是细菌 DNA 具有广泛免 疫刺激作用的结构基础 1 -3。业已证明， 含有非甲 基化 CpG 基元的细菌 DNA 能刺激多种免疫细胞的 分化增殖 （如树突状细胞、NK 细胞和 B 细胞等） 并 激活 T 细胞的免疫功能， 诱生大量的细胞因子， 协
5、 同调节机体的先天性防御反应和获得性免疫反 应 4 -5。当前， 人们对病毒感染性疾病高度重视， 但 对病毒性防治方法和技术仍比较薄弱， 除常见的病 毒疫苗外， 大多数病毒感染宿主还没有有效的预防 措施， 如感染人类的 HIV 和人禽感染的流感病毒 等。临床常用一种高效纯化的生物制剂， 血源或重 组 interferon-aphe （IFN-） 是治疗病毒感染的一种有 效细胞因子， 而抗 IFN- 血清 （抗体） 是鉴别不同类 型干扰素的重要标志。本实验以纯化的 IFN- 为抗 原， 以大肠埃希菌 （E. coli）DNA 和 （或） 弗氏完全佐 剂为不同佐剂， 以比较不同佐剂对 IFN- 的
6、免疫增 强效果。 1 材料与方法 1. 1 材料 1. 1. 1 菌种 E. coli （ATCC25922） 由本教研室保藏 菌种， 37培养于普通营养琼脂固体培养基上 20 24 h。 1. 1. 2 动物 Balb/ c 纯系小鼠 6 8 周龄， 体重 18 20 g， ， 共 125 只， 由安徽医科大学实验动物中 心提供 （普通级） 。 1. 1. 3 主要试剂与仪器 溶菌酶、 饱和重蒸酚、 MTT 和 ConA 购于北京天象人生 物 医 学 公 司， DMEM 细胞培养基、 胰酶均为美国 GIBCO 公司产 品， 完全 DMEM 培养液 （DMEM 培养液加入 100 万 IU/
7、L 青霉素、 100 mg/ L 链霉素和 10% 小牛血清） ， HCl 和异丙醇为北京化学试剂厂产品 （AR 级） ， 碘 化丙啶、 RNaseA 由安徽省立医院朱明主任提供， 754 紫外分光光度计为上海第二分析仪器厂产品， 自动 酶标读数仪为美国 Bio-Tek 公司产品。 1.1. 4 免疫用 IFN- 的抗原 购自市售人 IFN 注 射剂 （a1b 和 a2b） 500 万 IU/ 支 （5 mg/ 支） ， 批号 040901 （深圳科兴） 和批号 20040618 （安徽安科） 。 1. 2 方法 1.2. 1 佐剂的制备 弗氏完全佐剂按本教研室常 规方法配制， E. coli
8、 DNA 的制备与鉴定参照文献 6 收集培养菌体， 用溶菌酶和 SDS 裂解菌体， 饱和 酚氯仿抽提法去除菌体蛋白乙醇洗涤， 将纯化的 DNA 溶于无菌去离子水中， 用紫外分光光度计测 260 nm A 值作 DNA 定量， 280 nm 波长测定 A 值。 A260/ A280(1. 9。给 5 只小鼠分别腹腔注射 E. coli DNA， 500 g/ 只， 连续观察 7 d （应无不良反应） ， 将 E. coli DNA 溶解于 pH 8. 0 的 TE 缓冲液中，-20 保存备用。 973安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 20
9、06 Aug； 41 （4） 1.2. 2 实验动物和不同佐剂分组 实验动物随机 分成 8 组， 各组佐剂用量。见表 1。 表 1 实验小鼠分组情况 组别n 组成成分剂量 A10生理盐水对照0.5 B25E. coli DNA 50 g + IFN- 1.0 g0.5 C10弗氏完全佐剂 25 g + E. coli DNA 25 g + IFN- 1.0 g0.5 D25弗氏完全佐剂 50 g + IFN- 1.0 g0.5 E25IFN- 1.0 g0.5 F10E. coli DNA 12.5 g + IFN- 1.0 g0.5 G10E. coli DNA 50 g + IFN- 0.
10、25 g0.5 H10E. coli DNA 12.5 g + IFN- 0.25 g0.5 用 E. coli DNA 和 （或） 弗氏完全佐剂与市售 IFN- 混合， 腹部皮下注射， 每只小鼠 0. 5 ml， 首次 免疫后 10 d 加强抗原免疫 1 次， 间隔 7 d 再加强抗 原免疫 1 次， 共 3 次。最后一次免疫 9 d 后采集每 只小鼠血样， 分离血清，-20冻存备用， 用来检测 IFN- 抗体， 同时取脾脏用 MTT 法和流式细胞计数 仪进行细胞分裂周期检测。在免疫接种结束后 3 d 开始采集小鼠血， 每隔 3 d 一次， 共 6 次， 每组每个 时段系统 3 只小鼠分离血
11、清， 待测抗体。 1. 2. 3 MTT 比色法检测 7 免疫小鼠采血后处 死， 无菌取出脾脏， 用组织匀浆器轻轻研磨， 离心 1 000 r/ min， 10 min， 弃去上清， 加 0. 83% NH4Cl 处 理红细胞， 室温 10 min， 离心1 000 r/ min， 10 min 弃 上清加 Hanks 液离心洗涤 2 次， 然后用 200 目网过 滤， 去除细胞碎片， 用含 10% 新生小牛血清的 DMEM 稀释细胞至浓度为 5 109/ L 的单细胞悬液。 加入 ConA 至每孔终浓度为 0. 005 mg/ L， 至 96 孔微 量细胞培养板内， 每个样本设 3 个复孔，
12、 5% CO2 37培养 48 h， 每孔加入浓度为 5 g/ L 的 MTT 液 10 l 继续培养 4 h， 每孔加入 0. 04 mol/ L HCl 的异丙 醇 150 l， 室温作用 10 min， 以酶联仪测定 A570值。 1.2. 4 脾淋巴细胞分裂周期检测 上述各组小鼠 脾细胞悬液用 70% 冷乙醇固定， 4 保存。具体染 色方法见文献 8 ， 染色前 PBS 洗去固定液， 加 200 l RNaseA （1 g/ L） 37 水浴 30 min， 再加入 800l 碘化丙啶 （PI） 染色液混匀， 4 避光 30 min 上流式 细胞仪 （FACS-420 型） 进行淋巴细
13、胞周期检测。 1. 2. 5 微量中和试验检测 IFN- 抗体效价 参照 文献 8 -9 。 1. 2. 6 微量细胞病变抑制法检测 IFN- 抗原最小 保护剂量 （MID） 按常规滴定 IFN- 效价方法， 将 长满单层的 wish 细胞上清倒去， 稀释免疫用的 IFN- 抗原， 至 1 : 256， 然后在倍倍稀释至第 10 孔 1 : 0. 5 （IFN-） ， 每个滴度 8 个复孔， 第 11 细胞对照， 第 12 孔病毒对照， 除细胞对照孔外， 每孔加入 200 个 TCID50VSV 0. 1 ml， 37 培养 24 48 h， 当病毒 对照孔镜下出现 75% 100% 细胞病变
14、时， 停止培 养倒去每孔液体， 每孔加结晶紫染色， 观察 100% 保 护细胞完整无损的最高稀释倍数， 即为 IFN- 的 MID。 1. 2. 7 微量 IFN- 中和抗体的检测 选用对数生 长期 wish 细胞， 经过消化吹打计数调整细胞为 109 个/ L， 每孔 0. 1ml， 再每孔加 0. 1 ml DMEM 的营养 液， 37 18 24 h， 镜下观察到细胞已形成单层细 胞， 将待检各组血清与阴性对照血清 56 灭活 30 min 后， 2 000 r/ min， 10 min 吸上清， 按 1 : 10 稀释 后， 再 2 倍稀释 （1 : 20 1 : 1 280） ， 然
15、后每个稀释 孔血清与最小保护剂量 IFN- 等量混合 37作用 1 h， 每孔加上述混合液0. 1 ml， 每个浓度重复3 孔， 再 每个孔加入 200 个 TCID50VSV 病毒液， 该实验设细 胞对照孔， 病毒对照孔和 IFN- MID 对照孔和阳性 血清对照孔， 37 培养 24 48 h， 当病毒对照发现 完全细胞病变， 而细胞对照孔细胞生长旺盛呈单层 时， 终止培养倾去培养液， 加结晶紫染色5 min， 观察 结果， IFN- 抗体效价以 50% 细胞培养孔出现细胞 病变的血清最高稀释度表示按 Reed-Muench 计算中 和抗体效价。 1. 3 统计学处理 数据用%x s 表示
16、， 各组间单因 素的比较用 SPSS 软件进行方差分析， q 检验。 2 结果 2. 1 E. coli DNA 制备 E. coli DNA 纯化后， 紫外 分光光度计测定 A260、 A280值， 经计算 A260/ A280值为 1. 91， 含量 4. 79 g/ L。 2. 2 动物毒性实验 各项生理指标未见异常， 如无 表现竖毛， 毛发稀疏， 活动减少， 精神萎靡等不良反 应。 2. 3 小鼠脾淋巴细胞分裂周期检测 用流式细胞 计数仪进行小鼠脾淋巴细胞细胞分裂周期检测， 所 有的佐剂均能刺激小鼠淋巴细胞向 S 期和 G2M 期 转化。见表 2。 由表 2 可知， 除弗氏完全佐剂组与
17、 E. coli DNA 组比较差异无显著性 （P 0. 05） ， 其余各组组间差 异均有显著性 （P 0. 05） ， 而两者联合使用， 分别与 E. coli DNA 和弗氏 完全佐剂组比较差异均有显著性 （P 12. 5 g/ 只时， 均能刺激小 鼠产生特异的体液免疫和细胞免疫， 而固定E. coli DNA 用量 （50 g/ 只） ， 使用 0. 25 g 的 IFN- 剂 量， 小鼠产生的体液免疫和细胞免疫指标变化较小， 说明使用细菌 DNA 有减少疫苗或免疫抗原的用量 的可行性。本实验结果与唐泰山 等 12研究结果相 似。 弗氏完全佐剂是经典的免疫增强剂， 其中卡介 苗是弗氏完
18、全佐剂免疫刺激活性的主要成分之一。 183安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2006 Aug； 41 （4） Sun et al 13报道， 牛型结核杆菌 （BCG） 的提取物 （My-1） 具有较强的免疫刺激作用， 其主要活性成分 是 DNA， 而非 RNA 或蛋白质。本实验发现 E. coli DNA 组与弗氏完全佐剂组刺激小鼠脾淋巴细胞转 化的均值与 IFN- 抗体的均值较小， 组间统计比较 差异不显著， 由此可以推测， 弗氏完全佐剂中死卡介 苗的主要活性成分可能就是非甲基化的 CpG-DNA。 小鼠腹腔注射 E. coli DN
19、A 后， 生理状态良好， 未发现不良反映； 而用弗氏完全佐剂注射后， 小鼠精 神沉郁， 饮食减少、 竖毛， 剖检见腹腔有大量纤维素 性渗出物， 小鼠生长缓慢， 注射部位有硬块。因此除 E. coli DNA 具有强烈的免疫增强作用外， 还易吸收， 注射部位无硬结等变化， 且其来源提取简便， 生产成 本低， 具有一定的生产实用潜力， 尤其是对家禽和肉 用牲畜接苗后， 该佐剂可能不会影响禽和畜产品的 质量。 参考文献 1 Britigan B E， Leats T S， Waldschmidt M，et al. Lactoferrin binds CpG-containning oligonuck
20、eotides and inhibits heir immunostimu- latory effect on human B cells J . J Immunol，2001， 167 （5） ： 2921 -8. 2 Hartmann G，Weeratna R D， BALLas Z K，et al. Delineation of a CpG oligodeoxunucleotide for actinating primate immune response in vitro and in vivo J . J Immunol， 2000， 164 （3） ： 1617 -24. 3 W
21、eighard H， Feteriwski C， Veit M，et al. Increased resistance a- gainst acute polymicrobio sepsis in mice challenged with immumos- timulatony CpG oligodeoxunucleotides is related to an enhanced in- nate effecter cell response J . J Immunol， 2000， 165 （8） ： 4537 - 43. 4 Kriege A M. CpG motif in bacteri
22、al DNA and Heir immune effects J . Annu Rev Immunol 2002， 20 （5） ： 709 -60. 5 Chen Y， Lenert P， Weeratna R， et al. Identification of methylated CpG motifs as inhibitors of the immune stimulatory CpG motifs J . Gene Ther， 2001， 8 （13） ： 1024 -32. 6 沈德新， 封志纯， 杜 江 . 细菌 DNA 提取方法比较 J . 中原 医刊， 2004， 31 （1
23、0） ： 20 -2. 7 李艳秋， 余 莉， 方草晖， 等. HCMV pp65 DNA 疫苗诱导小鼠 的细胞免疫 J . 安徽医科大学学报， 2003， 38 （2） ： 98 -101. 8 杨吉成， 宋礼华， 周建华， 等. 医用细胞工程 M . 2 版. 上海： 上海交通大学出版社， 2003： 12， 257， 306. 9 黄桢祥. 医学病毒学基础及实验技术 M . 北京： 科学技术出 版社， 1990： 142， 266. 10Bauer M， Heeg K， Wagner H，et al. DNA activate human immune cellsthroughaCpGs
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25、. 中国免疫学杂志， 2004， 20 （7） ： 477 -9. 13Sun S， Kishnoto H，Sprent J. DNA as an adjuvant capacity of in- sectDNA and synthetic oligodeoxynucleotide to augment T cell re- sponse to specific antigen J . J Exp Med， 1998， 187 （7） ： 2555 - 9. The research on immune enhancement of escherichia coli DNA on mice a
26、gainst IFN- antibody Li Jingpei， Bi Keju， Wang Mingli （Dept of Microbiology Anhui Medical University，Hefei 230032） Abstract Objective To study the immune enhancement of E. coli DNA as an adjuvant. Methods The mice were randomly separated into eight groups， E. coil as comparation （A） ； E. coil DNA 50
27、 g and IFN- 1. 0 g （B） ； Freunds complete adjuvant 25 g，E. coil DNA 25 g and IFN- 1. 0 g （C） ；Freunds complete adjuvant 50g and IFN-1. 0 g （D） ；only IFN- （E） without any adjuvant；E. coil DNA 12. 5 g and IFN- 1. 0 g（F） ；E. coil DNA 12. 5 g and IFN- 0. 25 g （G） ；E. coil DNA 50 g and IFN- 0. 25 g （H） .
28、 The mice were injected under the belly skin and revaccinated 2 times after the first immunization. The humoral immunity and the cellular immunity state of mice were measured with micro-neutralization test， MTT colormertric assay and flowcytometry re- spectively. Results Through the single factor co
29、rrelate analysis among groups，it was found that E. coli DNA and Fruends complete adjuvant could induce sufficient specific humoral immunity and cellular immunity. The specific humoral and cellular immunity activity of E. coli DNA was similar to that of Freunds adjuvant （P 0. 05） ， while the time eff
30、ect of INF- antibody immunized by E. coli DNA was better than that by Freunds adjuvant. Conclusion E. coli DNA has strong immune stimulation，and it can be used as ainnovative adjuvant. MeSH escherichia coli；DNA，bacterial；interferon-alpha；mice Free words immune enhancement；adjuvant ；Freund complete adjuvant 283安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2006 Aug； 41 （4）