大肠杆菌TOP10NAH反向运输体A基因的克隆及生物信息学分析.pdf

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1、吉林农业科学2 0 0 8 ，3 3 ( 6 ) ：2 5 2 9J o u r n a lo fJ i l i nA g r i c u l t u r a lS c i e n c e s 文章编号：1 0 0 3 8 7 0 1 ( 2 0 0 8 ) 0 6 0 0 2 5 0 5 大肠杆菌T o p1 0 N a + H + 反向运输体 A 基因的克隆及生物信息学分析 麻鹏达，周磊，李毅丹，谭化，刘艳芝 ( 吉林省农业科学院生物技术中心，长春1 3 0 0 3 3 ) 摘要：根据细菌中存在的N a + I H + 反向运输体( N a + H + a n t i p o r t e

2、r A ，n h a A ) 的基因序列，采用P C R 扩增的方 法从大肠杆菌( E s e h e r i c h i ac o l i ) T o p l O 中克隆到了，I I I l 以基因( A c e s s i o nN u m e b e r ：E U 3 6 8 0 4 5 ) 。n h a A 开放阅读 框为11 6 7b p ，编码含有3 8 8 个氨基酸残基，分子量为4 1 3k D a 的蛋白，预测等电点为9 2 3 。n h a A 含有2 5 个 碱性氨基酸1 9 个酸性氨基酸，2 1 1 个疏水氨基酸及6 3 个极性氨基酸。二级结构预测表明，该蛋白含约5 0

3、的 a 一螺旋、1 8 的延伸链、7 的1 3 一转角和2 5 的不规则卷曲。亲疏水性分析显示，n h a A 是疏水性蛋白。跨膜结 构进行分析显示该蛋白含有1 1 个跨膜区域。序列分析表明，大肠杆菌T o p l 0n h a A 基因与大肠杆菌D H 5 c t 、大 肠杆菌H S 、大肠杆菌S E C E CS M S 一3 5 和大肠杆菌C F T 0 7 3 的n h a A 基因同源性分别为1 0 0 、9 8 、9 5 和 9 2 。大肠杆菌T o p l 0n h a A 基因的克隆及生物信息学分析为今后对n h a A 的进一步深入研究奠定了基础。 关键词：大肠杆菌T o p

4、 l 0 ；N a I H + 反向运输体基因；基因克隆；生物信息学分析 中图分类号：0 7 8 5 文献标识码：A M o l e c u l a rC l o n i n ga n dB i o i n f o r m a t i c sA n a l y s i so fN a + H + A n t i p o r t e rA G e n ei nE s c h e r i c h i ac o l iT o p l0 M AP e n g d a ，Z H O UL e i 。L IY i d a n 。T A NH u a 。L I UY a n z h i * ( B i o

5、t e c h n o l o g yC e n t e r ，A c a d e m yo f A g r i c u l t u r a lS c i e n c e so f J i l i nP r o v i n c e ，C h a n g c h u n1 3 0 0 3 3 ，C h i n a ) A b s t r a c t ：n h a A ( N a + H + a n t i p o r t e rA ) w a sc l o n e df r o mE s c h e r i c h i ac o l iT o p lOb yP C R ，w i t hp r i

6、 m e r s d e s i g n e da c c o r d i n gt op u b l i cn h a As e q u e n c e s T h eo p e nr e a d i n gf r a m eo fn h a Ag e n eh a s 1 16 7b pi n l e n g t ha n de n c o d e sap r o t e i no f3 8 8a m i n oa c i dr e s i d u e s T h ee s t i m a t e dm o l e c u l a rw e i g h ta n di s o e l e

7、c t r i c p o i n to ft h ep u t a t i v ep r o t e i nw e r e4 1 3k D aa n d9 2 3 r e s p e c t i v e l y C o m p o n e n t so fa m i n oa c i d se n c o d e d n h a Ac o n t a i n e d2 5b a s i ca m i n oa c i d s ，19a c i d i ca m i n oa c i d s 。2l lh y d r o p h o b i ca m i n oa c i d sa n d6

8、3p o l a r a m i n oa c i d s T h ep r e d i c t e ds e c o n d a r ys t r u c t u r eo ft h ep r o t e i nh a da b o u t5 0 a l p h ah e l i x e s 18 e x t e n d - e ds t r a n d 7 b e t at u r na n d2 5 r a n d o mc o i l H y d r o p h o b i ca n a l y s i si n d i c t e dt h a tn h a Aw a sah y d

9、 r o p h o b i cp r o t e i n n h a Ac o n t a i n e d1 1t r a n s m e m b r a n es e g m e n t s I ts h a r e d10 0 。9 8 ，9 5 a n d9 2 h o m o l o g i e si nD N As e q u e n c el e v e lw i t hE c o l iD H 5d ，E c o l iH S ，E c o l iS E C E CS M S 一3 - 5a n dE c o l i C F T 0 7 3 r e s p e c t i v

10、e l y M o l e c u l a rc l o n i n ga n db i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i so fn h a Ai nE s c h e r i c h i ac o l iT o p l0 w i l lb eh e l p f u lf o rt h ef u r t h e ra n a l y s i so fn h a A K e yw o r d s ：E s c h e r i c h i ac o l iT o p l 0 ；N a + H + a n t i p o r t e rAg e n e ；G

11、 e n ec l o n e ；B i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i s 收稿日期：2 0 0 8 0 5 0 6 基金项目：本研究由抗逆聚合表达载体的构建及在模式植物中 功能验k 正( 2 0 0 6 0 5 4 8 ) 项目资助 作者简介：麻鹏达( 1 9 7 9 一) ，博士，助理研究员，主要从事植物分 子生物学与基因工程研究。 通讯作者：刘艳芝副研究员，E m a i l ：l i u y z g y a h o o t o m c n 全球约2 0 的耕作土地和几乎半数的可灌溉 土地受到盐渍化的影响【l I ，我国约有盐碱化和次生 盐碱化

12、土地40 0 0 万h m 2 ，成为我国农业发展的 主要限制因素I ：1 。盐胁迫对植物主要表现为两方 面的伤害：渗透胁迫效应和离子胁迫效应。在盐胁 迫的逆境条件下，植物体的光合、呼吸、蒸腾、吸收 万方数据 吉林农业科学3 3 卷 和代谢等生命活动都会受到不同程度的干扰1 3 J 。 N a + H + 反向运输体广泛分布在细菌、动物和 植物的细胞膜中。N a + H + 反向运输体在植物抵抗 盐胁迫中起重要作用，细胞内过多的N a + 从质膜 向细胞外排放和N a + 在液泡中的区域化分别是由 位于质膜和液泡膜上的N a + H + 反向运输体完成 的1 4 1 。研究表明，大肠杆菌中有两

13、种基因编码了 N a + H + 反向运输体，分别为n h a A 和n h a B t 6 。7 1 ，这 两种基因的产物对大肠杆菌的耐盐性是非常重要 的。 本文运用P C R 技术从大肠杆菌T o p l 0 菌株 基因组中扩增出n h a A 基因片段，并对其进行了 生物信息学分析，对于了解n h a A 基因的结构与 功能，以及进一步了解该类基因在耐盐作用机理 具有重要意义。同时为利用细菌耐盐基因来改良 作物性状，培育耐盐作物新品种提供了基础。 1 材料与方法 1 1 材料和试剂 大肠杆菌( E s c h e r i c h i ac o l i ) D H 5O t 和T o p

14、l O 菌株为本实验室保存菌种。P C R 产物回收试剂盒 购自上海生工生物工程有限公司。p M D l 8 一T 载 体、D N Am a r k e r 和限制性内切酶、E x T a q 酶均购 自T a k a r a 公司。 1 2n h a A 基因的克隆 大肠杆菌D N A 的提取依据文献【8 】进行。根 据已报道的大肠杆菌n h a A 基因( A Y 4 4 9 7 1 9 ) ，设 计P C R 引物序列为： P I ：5 一G T G A A A C A T C T G C A T C G A T T C T T T A G C A G 一3 P 2 ：57 一T C A

15、 A A C T G A T G G A C G C A A A C G A A C G C G 一3 7 依照T a K a R aE xT a q 操作指南进行，扩增参 数：9 4 c C5m i n ，9 4 4 5s ，5 5o C4 5s ，7 2 1r a i n ， 3 0 个循环；7 2 0 C1 0r a i n ，反应产物进行琼脂糖凝 胶电泳检测。按照上海生工生物工程有限公司凝 胶回收试剂盒说明书进行P C R 产物的回收。回收 获得的n h a A 基因片段与p M D l 8 - T 载体在T 4 D N A 连接酶的作用下1 6 过夜，使n h a A 基因连 接到p

16、 M D l 8 - T 的载体上，转化大肠杆菌D H 5 a 感受态细胞。对构建的质粒p M D l 8 - T l n h o A 进行 小量提取，提取后的质粒用H i n dn i 、E c o R I 双酶 切进行鉴定，酶切反应结束后进行琼脂糖凝胶电 泳鉴定。对鉴定为阳性的克隆委托上海生工生物 工程有限公司进行测序。 1 3n h a A 基因的生物信息学分析 应用D N A S t a r 7 0 软件对n h a A 基因编码蛋 白质的理化性质进行分析；应用P r o t S c a l e 和 S O P M A 预测其编码蛋白的二级结构；应用M o t i f S c a n

17、和S c a n P r o s i t e 分析N a + H + 反向运输体蛋白 序列中的基序和结构域；应用P S O R T 、S O S U I 、 S i g n a l P 3 0 和S w i s s M o d e l 等程序对N a + H + 反向 运输体亚细胞定位、跨膜区、信号肽及三维结构等 进行预测；应用B l a s t 在线工具和D N A M A N 6 0 软 件进行核苷酸序列的同源性比对；应用C l u s t a lX 和T r e e v i e w 软件构建分子进化树。 2 结果与分析 2 1 大肠杆菌T o p l 0n h a A 基因的克隆 图1P

18、 C R 扩增产物电泳图谱 M ，M a r k e rD L 2 0 0 0 ；1 。P C R 产物 图2 重组质粒酶切分析结果 M ，M a r k e r D L 2 0 0 0 ；1 ，p M D l 8 一T l n h a AH i n d l l l 和E c o R I 酶切 以n h a A 基因序列设计的P C R 引物，对提取 的大肠杆菌基因组D N A 进行扩增，扩增产物经 l 琼脂糖凝胶电泳鉴定( 图1 ) ，可见一条约11 0 0 b p 的条带，与预计的n h a A 基因片段11 6 7b p 大 小一致。P C R 扩增的n h a A 基因片段，回收后与测

19、 序载体p M D l 8 - T 连接，构建形成重组质粒 p M D l 8 - T n h a A 。重组质粒用H i n d l l l 和E c o RI 酶 切，琼脂糖凝胶电泳显示出酶切获得的约11 0 0 b p 的D N A 片段( 图2 ) ，与连接的n h a A 基因片段 万方数据 6 期 麻鹏达等：大肠杆菌T o p l O N a H + 反向运输体A 基因的克隆及生物信息学分析2 7 大小相同，证明构建的正确性。对p M D l 8 - T n h a A 重组质粒送上海生工测序，测序结果已在国际基 因库( G e n B a n k ) l 争请，接受号为E U 3

20、 6 8 0 4 5 。 2 2 N a + H + 反向运输体蛋白理化性质分析 应用D N A S t a r 7 0 软件对n h a A 基因编码蛋 白质的理化性质进行分析，发现该基因包含全编 码区，编码3 8 8 个氨基酸序列。对所推测氨基酸 序列进行分析表明，该蛋白分子量为4 1 3 k D a ，等 电点为9 2 3 ，p H 7 0 时的电荷为7 1 6 ；碱性氨基酸 ( K 、R ) 2 5 个；酸性氨基酸( D 、E ) 1 9 个；疏水氨基酸 ( A 、I 、F 、W 、V ) 2 1 1 个；极性氨基酸( N 、C 、Q 、S 、T 、 Y ) 6 3 个。 2 3N a

21、 * H + 反向运输体蛋白二级结构预测 通过S O P M A 预测大肠杆菌N a * H + 反向运输 体蛋白的二级结构( 图3 ) ，表明该蛋白含约5 0 的 a 一螺旋、1 8 的延伸链、7 的B 一转角和2 5 的不 规则卷曲。根据A u s u b e P 9 l 的理论( 蛋白质或蛋白结 构域分为以下几类：全( I t 型蛋白，H 4 5 且E 4 5 ；0 t p 型蛋 白，H 3 0 且E 2 0 ；其他为混合型蛋白) ， N a + H + 反向运输体蛋白为混合型蛋白。 图3 大肠杆菌N a + H + 反向运输体蛋白二级结构的预测 4 一 II - J ：， fl 。川

22、疵V 娥 j 笏 l川“ 批1 m涮闭 r 俨 型 F r - 。f i 1 I V V ： 图4 大肠杆菌N a + H + 反向运输体蛋白疏水性亲水性 的预测 用P r o t S c a l e 预测大肠杆菌N a + H + 反向运输 体蛋白氨基酸序列的疏水性，亲水性的结果( 图 4 ) 表明，多肽链第2 4 6 位的丝氨酸( S e r ) 具有最低 的分值一2 3 3 3 ，第2 0 位的异亮氨酸( 1 i e ) 具有最高 的分值3 7 4 4 。依据氨基酸分值越低亲水性越强 和分值越高疏水性越强( 参考软件P r o t S c a l e ) 的规 律，可以看出，在第2 4

23、6 位的S e r 亲水性最强，第 2 0 位的I l e 疏水性最强，而就整体来看，疏水性氨 基酸均匀分布在整个肽链中，且多于亲水性氨基 酸。因此，整个多肽链表现为疏水性，没有明显的 亲水区域，可认为大肠杆菌N a + H + 反向运输体蛋 白是疏水性蛋白，说明该逆转运蛋白符合膜蛋白 的特征。 利用M o t i f S c a n 和S c a n P r o s i t e 分析发现， N a + H + 反向运输体蛋白中共有8 个N 一豆蔻酰化 位点，1 个亮氨酸拉链结构，1 个蛋白激酶C 磷酸 化位点( 表1 ) 。 表1利用M o t i f S e a n 和S c a n P

24、r o s i t e 对N a + H + 反向运 输体蛋白功能域的预测 丽蔻酰花砸雨r 一 亮氨酸拉链结构 蛋白激酶( ：磷酸化位点 3 2 - 3 7 ，8 6 - 9 1 ，2 0 1 2 0 6 2 2 3 2 2 8 ，2 3 0 - 2 3 5 。 2 9 1 - 2 9 6 ，3 3 2 3 3 7 ，3 6 4 3 6 9 5 3 - 7 4 9 0 - 9 2 2 4N a + H + 反向运输体蛋白跨膜区和信号肽的 预测 运用S O S U I 软件对大肠杆菌N a + H + 反向运 输体蛋白跨膜结构进行分析，结果显示该蛋白含 有1 1 个跨膜区域，其中8 个初级螺旋，

25、3 个二级 螺旋( 图5 ) 。 图5 用S O S U l 预测N a + H + 反向运输体蛋白的跨膜区域 通过S i g n a l P 3 0 分析结果显示，该蛋白和绝 大多数N a + H + 反向运输体一样，存在信号肽序 列，信号肽切割位点位于3 l 。3 2 ( N N ) 或3 3 3 4 ( 8 M M ) 。 2 5N a + H + 反向运输体蛋白亚细胞定位及三级 结构预测 P S O R T 预测结果显示。N a + H + 反向运输体蛋白 的亚细胞定位可能性如下：C y t o p l a s m i c0 、C y t o p l a s m i cM e m b

26、r a n e1 0 、P e r i p l a s m i c 0 、O u t e r M e m b r a n e 0 、 E x t r a c e l l u l a r0 。说明该蛋白定位于细胞质膜上。 万方数据 吉林农业科学 3 3 卷 利用S w i s s M o d e l 数据库预测该蛋白的三级 结构，结果如图6 所示。 图6N a V H + 反向运输体蛋白三级结构的预测结果 2 6 同源比对与系统树构建 图7N a + H + 反向运输体基因的同源性比较 图8n h a A 的进化树分析 C P 0 0 0 9 4 8 K c o l iD H 1O B ；U 0

27、 0 0 9 6 ，Ec o l ia f t K 一12 ；A Y 4 4 9 719 。E c o l iD H 5 a l p h a ；E U 3 6 8 0 4 5 ，Ec o l i T o p l O ；A E 0 0 5 1 7 4 ，Ec o l i 0 1 5 7 ：H 7 E D L 9 3 3 ；C P 0 0 0 8 0 2 ，Ee o l i H S ；C P 0 0 0 9 7 0 ，c o l i S E C E CS M S 一3 5 ； A L 6 2 7 2 6 5 ，S a l m o n e l l ae n t e r i e as e r o v

28、a rT y p h i ( S a l m o n e l l at y p h 日 C T l 8 ；C P 0 0 0 2 4 7 ，K c o l i 5 3 6 ；A E 0 1 4 0 7 5 。E c o l iC F T 0 7 3 ) 用D N A M A N 6 0 对E c o l iT o p l 0n h a A 基因 与E c o l iD H 5 0 t ，Ec o l iH S ，E c o l iS E C E CS M S 一3 5 和最c o l iC F T 0 7 3 的n h a A 基因进行同源性分析，结 果如图7 所示。其同源性分别为1 0 0

29、、9 8 、9 5 和9 2 ，表明所克隆的c D N A 为n h a A 基因，测定 序列包含了n 甜基因完整的读码框架。 利用T r e e V i e w 软件对来自n 4 基因进行分 子聚类分析，构建n h a A 基因的进化树( 图8 ) 。进化 树分析表明：E c o l iT o p l 0n h a A 基因与E c o l i H S 亲缘关系较近，而与E c o l iD H l O B 亲缘关系 较远。序列比对结果以及进化树分析都表明n h a A 应为编码大肠杆菌质膜上的N a V H + 反向运输体 蛋白一类的基因。 3讨论 耐盐性是一个复杂的性状，是多基因相互作用

30、 的结果。然而有研究表明，转单一的N a V H + 反向运 输体蛋白基因能够明显地提高作物的耐盐性肛1 1 J ， 其原因可能是N a + H + 反向运输体蛋白基因转化 进入植物细胞后激活了一系列与耐盐相关的基 因，从而明显地提高了植物耐盐性。因此，N a + H + 反向运输体蛋白对耐盐性的研究具有重要的意 义。本研究采用P C R 的方法从大肠杆菌T o p l 0 中 克隆了n h a A 基因。n h a A 开放阅读框为11 6 7b p ， 编码含有3 8 8 个氨基酸残基，分子量为4 1 3k D a 的蛋白，预测等电点为9 2 3 。n h a A 含有2 5 个碱性 氨基

31、酸、1 9 个酸性氨基酸、2 l1 个疏水氨基酸及 6 3 个极性氨基酸。二级结构预测表明，该蛋白含 约5 0 的仅一螺旋、18 的延伸链、7 的p 一转 角和2 5 的不规则卷曲。亲疏水性分析显示， n h a A 是疏水性蛋白。跨膜结构进行分析显示该蛋 白含有1 1 个跨膜区域。序列分析表明大肠杆菌 T o p l 0n h a A 基因与大肠杆菌D H 5q 、大肠杆菌 H S ，大肠杆菌S E C E CS M S 一3 5 和大肠杆菌 C F T 0 7 3 的n h a A 基因同源性分别为1 0 0 、9 8 、 9 5 和9 2 。该研究为进一步研究细菌的耐盐机 制，以及为利用

32、该基因改良农作物品种方面奠定 了理论基础。 参考文献： 【lJZ h uJK P l a n ts a l tt o l e r a n c e J T r e n d si nP l a n tS c i e n e e ，2 0 0 1 ，6 ( 2 ) ：6 6 - 7 1 【2 】赵可夫，李法曾中国盐生植物叫】北京：科学出版社，1 9 9 9 ： 1 ，3 1 1 【3 】M u n n sR 。T e r r n a a tA W h o l ep l a n tr e s p o n s et os a l i n i t y 【J 1 | l 二| | = | | 万方数据 6

33、期麻鹏达等：大肠杆菌T o p l O N a 佃+ 反向运输体A 基因的克隆及生物信息学分析 2 9 A u s t r a l i a nJ o u r n a lo fP l a n tP h y s i o l o g y ，19 8 6 ，( 13 ) ：14 3 - 16 0 【4 】B l u m w a l dE ，P o o l eRJ N a + H + a n t i p o r t e ri ni s o l a t e dt o n o p l a s tv e s i c l e sf r o ms t o r a g et i s s u eo fB e t aV

34、 u l g a r i u s 【J 1 P l a n t P h y s i o l ，1 9 8 5 ( 7 8 ) ：1 6 3 - 1 6 7 【5 】B a u s c hT ，K i r s c hM 。L r wR 。e ta 1 S a l ts t r e s sr e s p o n s e so f h i g h e rp l a n t s ：t h er o l eo fp r o t o np u m p sa n dN a + H + a n t i p o r t e r 【J 1 P l a n tP h y s i o l ，19 9 6 ( 1 4

35、8 ) ：4 2 5 4 3 3 【6 】B a r k l aBJ ，P a n t o j aO P h y s i o l o g yo fi o nt r a n s p o r ta c r o s sa n d t o n o p l a s to fh i g h e rp l a n t s 【J 】A n n uR e vP l a n tP h y s i o lP l a n t M o lB i o l ，1 9 9 6 ( 4 7 ) ：15 9 - 18 4 【7 】P i n n e rE 。P a d a nE ，S c h u l d i n e rS C l

36、 o n i n g 。s e q u e n c i n g ，a n d e x p r e s s i o no ft h en h a Bg e n e , e n c o d i n gaN a + H + a n t i p o r t e ri n E s e h e r i c h i a c o l i t J JB i o lC h e m , 1 9 9 2 ( 2 6 7 ) ：11 0 6 4 - 11 0 6 8 【8 1T a g l i c h tD P a d a nE S e h u l d i n e rS O v e r p r o d u c t i

37、o na n dp u r i f i e s t i o n o f a f u n c t i o n a l N a + H + a n t i p o r t e r c o d e d b y n h a A ( a n O f r o m E s c h e r i c h i a c o l i U l J B i o l C h e n x1 9 9 1 ( 2 6 11 2 8 9 一l1 2 9 4 【9 】A u s u b e lFM ，B r e n tR ，K i n g s t o nRE ，e ta 1 C u r r e n tp r o t o c o l

38、i nm o l e c u l a rb i o l o g y M ，G r e e n eP u b l i s h i n g W i l e yI n t e r - s e i - e n e e ，N e wY o r k ，N Y ：1 9 9 0 【l O B u r k h a r dR P r e d i c t i n go n e - d i m e n s i o n a lp r o t e i ns t r u c t u r eb y p r o f i l eb a s e dn e u r a ln e t w o r k s 【J 1 M e t h o

39、 d sE n z y m o l ，1 9 9 6 ( 2 6 6 ) ：5 2 5 5 3 9 【111 Z h a n gHX ，B l u m w a i dE T r a n s g e n i cs a l t t o l e r a n c et o m a t o p l a n t sa c c u m u l a t es a l t i nf o l i a g eb u tn o ti nf r u i t 【J 】N a t B i o t e c h n o l ，2 0 0 1 ( 1 9 ) ：7 6 5 - 7 6 8 【12 P o r a tR ，P o

40、v o n c e l l oD ，H a y y i mGB Ah e a tt r e a t m e n ti n d u c e dt h ee x p r e s s i o no faN a + I H + a n t i p o r tg e n e ( c N H X I ) i n c i t r u sf r u i t J P l a n tS c i e n c e ，2 0 0 2 ( 16 2 ) ：9 5 7 - 9 6 3 j k 舷 蕾 蕾 1 l k ：I k 蕾 ! 譬业譬 ，k k 坐j k k k 1 坐蕾 k P 坐 j - k 坐e ( 上接第1

41、9 页) 3 3 抗病性 2 0 0 5 2 0 0 6 年经白城市植保站田间鉴定结 果表明：洮葵l 号高抗褐斑病，抗菌核病。 4 栽培技术要点 4 1选地 洮葵l 号具有抗旱、耐瘠薄的特点，对茬口要 求不严格，一般地块均可种植，但避免重茬、迎茬， 低洼易涝地块也不宜种植，上茬施过杀双子叶杂 草除草剂的地块不能种植。 4 2 整地、施肥 洮葵1 号根系较发达，播种前深翻地2 0 一2 5 c m ，结合翻地每公顷施入农家肥3 00 0 0 4 00 0 0 k g 。播种时施种肥葵花专用肥2 0 0k g h m 2 ，条施、 穴施，提高肥料的利用率。害虫较多的地块，可结 合翻、耙地施入辛硫磷

42、乳油毒土防治地下害虫。 4 3 播种 大田最早播种必须在1 0c m 土层连续5d 稳 定通过I O 。C 后方可播种，但各地区要因地制宜调 整好播种期，使开花授粉期避开雨季。吉林省最适 播种期为6 月1 一1 5 日，辽宁最适的播种期在6 月1 0 2 5 日。 4 4 种植密度 肥沃地块每公顷保苗1 80 0 0 2 00 0 0 株，贫瘠 地块每公顷保苗2 2 0 0 0 2 4 0 0 0 株。采用垄七开沟 点播的方式播种，覆土4 6c m ，稍晾后镇压保墒。 4 5 中耕除草 在苗期应中耕2 3 次，一对真叶期间苗，二对 真叶期定苗，实行早铲早趟，最后一次中耕应深培 土，防止倒伏。

43、4 6 灌水 向日葵抗旱、耐盐碱，但关键时期缺水会造成 大幅度减产，特别是现蕾至开花期如天气干旱应 及时灌水，有条件的地块应在现蕾期、开花期、灌 浆期灌3 次水更好。 4 7 病虫害防治 主要通过秋耕深翻、轮作和调整播种期等农业 措施减轻病虫害。结合化学方法进行防治：播种时可 用霜霉灵、甲虫灵等拌种防治霜霉病、黄萎病。苗期 发现地老虎等地下害虫，可用敌敌畏乳油喷施或 9 0 晶体敌百虫拌谷糠制成毒饵撒施于田间。 4 8 授粉与收获 向日葵是虫媒异花授粉作物，主要以蜜蜂传 粉为主，开花授粉时为保证充分传粉结实，每公顷 生产田最好有l 一2 箱蜂源，或进行2 3 次人工 辅助授粉，以提高结实率。当

44、茎秆、花盘背部变 黄、叶片衰老、籽粒外壳变硬时，及时收获和晾晒， 防止霉变和鸟鼠害。 5适应地区 根据试验示范结果，洮葵1 号主要适应吉林 省各个产区及内蒙、黑龙江、辽宁等地区种植。 参考文献： 【1 1 粱- - S J l 向日葵优质高产栽培法【M 】北京：金盾出版社。 1 9 9 2 【2 】陈佳琴，黄建斌，覃兰英向日葵品种比较试验【J 1 耕作与 栽培，2 0 0 7 ( 2 ) ：3 4 【3 】雷中华，向理军。石必显向日葵9 个主要性状之间的相互 关系分析( J 】新疆农业科学，2 0 0 6 。4 3 ( S I ) ：3 1 3 3 【4 】郑洪源，王文浩，刘文俊，等大粒食用葵晋葵7 号新品种选 育及产业化【J 】陕西农业科学，2 0 0 7 ( 4 ) ：4 5 4 7 万方数据