《大黄素对大鼠近端结肠平滑肌细胞电压依赖性钾通道的影响.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《大黄素对大鼠近端结肠平滑肌细胞电压依赖性钾通道的影响.pdf（6页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、大黄素对大鼠近端结肠平滑肌细胞电压依赖性钾通道的影响 李世英*，欧阳守 （厦门市医药研究所，福建 厦门 361003） 摘要：目的 研究大黄素对大鼠近端结肠电压依赖性钾离子通道的影响， 以探讨其增强结肠运动的机制。方法 采用全细胞膜片钳技术测定电压依赖性钾离子通道快速激活型钾电流及延迟整流型钾电流。结果 大黄素 （1 30 molL -1） 浓度依赖性地阻断延迟整流性钾通道， 加快电流失活， 其阻断作用不需要钾通道的开放。30 molL-1 大黄素可抑制快速激活型钾电流。5 molL -1大黄素对钾通道的激活动力学及失活动力学没有影响， 但30 mol L -1大黄素使其激活动力学曲线明显右移
2、， 斜率常数由 （13. 0 0. 6） 上升至 （19. 6 2. 5）mV， 同时也使失活动力学曲 线明显右移。结论 大黄素可阻断延迟整流型钾通道及快速激活型钾通道， 其阻断作用不是开放阻断。 关键词：大黄素；膜片钳；电压依赖性钾通道；开放阻断 中图分类号：R282. 71；R965 文献标识码：A 文章编号： 0513 -4870 （2005） 09 -0804 -06 收稿日期： 2004-12-09. *通讯作者 Tel / Fax： 86 -592 -2043066， E-mail：shiyingli21cn. com Emodin blocks voltage dependent
3、 potassium channels in rat proximal colon smooth muscle cells LI Shi-ying*，OU-YANG Shou （Xiamen Institute of Medicine，Xiamen 361003，China） Abstract：Aim To investigate the effect of emodin on the voltage dependent potassium（KV） currents in rat proximal colon smooth muscle cells. Methods Whole cell pa
4、tch clamp technique was used to record potassium currents including fast transient outward current（IKA）and delayed rectifier current （IKdr） . Contamination of calcium-dependent potassium currents was minimized with CdCl2in external solution and EGTA in pipette solution. Results Emodin（1-30 mol L -1
5、）reversibly and dose- dependently reduced the amplitude of IKdrwith an Kdvalue of（1. 9 0. 1）molL -1. I KA was also inhibited with 30 molL -1 emodin to a lesser extent. Although acceleration of the decay rate of the KV currents was observed，the block by emodin was not through open block mechanism bec
6、ause a steady state level of inhibition of IKdrwas achieved during the first pulse from holding potential -70 mV to +50 mV after the cells were holding at -70 mV for a three minutes interval in the presence of emodin. Emodin（5 molL -1）had no effect on the steady-state activation and inactivation kin
7、etics of K V currents，but 30 molL -1 of emodinproduced a positive shift of the voltage dependence of activation，and an increase in the steepness of activation gating as well as shifted the voltage dependence of inactivation to positive direction. Conclusion Emodin，not through open block mechanism，ma
8、rkedly reduced the amplitude of IKAand IKdrand modulated the gating properties of KVchannels in a reversible and dose-dependent manner. Key words：emodin；patch clamp；voltage dependent potassium channels；open state block 大黄素 （emodin） 为蒽醌衍生物， 是大黄的主要 有效成分之一， 除具有抑制胰酶、 抑菌、 抗炎、 免疫调 节作用、 抗氧化及清除氧自由基、 抑制酪氨酸蛋白
9、激 酶多种药理作用外 1， 2， 还可增强肠道蠕动， 促进豚 鼠结肠带平滑肌细胞膜电位去极化， 增强细胞的电 兴奋性和收缩活动 3。由于钾通道对于结肠电活 动调控有重要意义， 可调控静息膜电位、 动作电位阈 值及慢波的波形等 4。因此本研究利用全细胞膜 片钳技术研究大黄素对大鼠近端结肠电压依赖性钾 408药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2005， 40 （9） ： 804 -809 离子通道 （voltage dependent potassium， KV） 的影响， 以探讨其促结肠动力作用机制。 材料与方法 动物 成年 Sprague-Dawley（SD） 大鼠
10、， 体重 250 350 g， 雌雄兼用， 由上海斯莱克实验动物公司 提供 （No. 04557） 。 药品及试剂 木瓜蛋白酶、 四氨基吡啶 （4- aminopyridine， 4-AP） 和大黄素均购自美国 Sigma 公 司， 大 黄 素 用 DMSO 配 成 10 mmolL -1 母 液， -20 贮存。DTT （BBI） ， HEPES， DMSO， 牛血清白 蛋白， Na2ATP3H2O 和 Na3GTP （Amresco） 为上海 生工生物工程技术服务有限公司进口分装。其余试 剂为国产分析纯。 按标准配方配制孵育及酶解溶液、 低钙贮存溶 液和电极内液。 膜片钳 电 极 用 P-
11、97 程 控 水 平 电 极 拉 制 仪 （Sutter Co. ） 拉制， 经 CPM-2 （ALA Co. ） 抛光仪处理 后， 电极电阻为 2 4 M。 细胞分离 根据文献 5 改进。大鼠击昏后， 剖腹取出约距回盲口 2 3 cm 的近端结肠， 其黏膜 呈纵形， 与回盲口附近呈斜形的结肠黏膜有明显区 别。显微镜下分离平滑肌条， 剪成 1 2 mm2左右小 块， 孵育30 min。将组织放入三角烧瓶， 加入含木瓜 蛋白酶 （3 mgmL -1） 、 DTT （2 mgmL-1） 和牛血清 白蛋白 （2 mgmL -1） 的酶解溶液， 36 恒温振荡 消化15 min。漂洗吹打、 过滤离心后
12、， 将细胞重新悬 浮在低钙贮存溶液中， 4 贮存。 全细胞膜片钳记录 单个结肠平滑肌细胞在自 制浴槽贴壁后， 置于 Olympus IX-70 倒置生物显微镜 下观察。选取质膜清晰、 呈梭形的结肠平滑肌细胞 进行实验， 细胞电容 （62. 4 10. 0）pF（n =23） 。刺 激信号的发放、 记录信号的放大采集及处理用 Axopatch 200B 膜片钳放大器和软件 pClamp 8. 2 （Axon Co. ） 。其串联阻抗补偿设置为 75%， 采样频 率 2 Hz。药物灌流应用 BPS-4 灌流系统 （ ALA Co. ） ， 1. 5 mLmin -1， 30 s 内可完全置换浴液。
13、电 流强度用电流密度 （pA/ pF） 表示， 即以电流值除以 细胞电容。所有实验均在室温 （22 24 ） 进行。 统计分析 数据用 -x s 表示， 药物处理前后差 别用配对 t 检验， 两组间差别用成组 t 检验， 多组间 差别用 ANOVA 分析。统计分析及作图软件为 Microcal Origin 5. 0。 结果 1 单个结肠平滑肌细胞的钾电流记录 外向结肠平滑肌钾电流主要由电压依赖性钾电 流及钙依赖性钾电流组成， 其中前者又分为快速激 活型钾电流 （transient outward current， IKA） 及延迟整 流型钾电流 （delayed rectifier curr
14、ent， IKdr） 。实验在 低钙灌流液中加入 CdCl2阻断钙通道， 并于电极内 液中加入 EGTA 将胞内钙浓度钳制在 20 nmolL -1， 基本消除了钙依赖性钾电流成分的影响。 舒张的结肠平滑肌细胞一般长 100 350 m， 宽 3 10 m， 呈梭形。施加正压的电极尖端喷出的 高钾溶液可使细胞迅速收缩， 15 s 内可恢复至原长 度的 80%左右， 提示木瓜蛋白酶法分离的细胞胞膜 完整， 且收缩机制良好。 Figure 1 Two components of voltage gated potassium currents in rat colon smooth muscle
15、cells，recorded every 10 s between - 80 and + 50 mV with holding potential-80 mV.Outwardcurrentconsisting transient component，which activated early and fast inactivated（A） . Current remaining in the presence of 5 mmolL -1 4-aminopyridine developed slowly and showed little inactivation over 400 ms（B）
16、图 1 显示全细胞电压钳模式，钳制电位 - 80 mV （holding potential， HP） 下， 超过 - 40 mV 的去极 化阶跃脉冲可诱发外向电流的产生。实验中观察到 IKA及 IKdr两种不同形式的外向性电流。如图 1A 所 示电流幅度高， 激活快， 失活也快。加入5 mmolL -1 4-AP 后， 峰电流 （阶跃测试脉冲开始后 30 ms 内的 最大电流值， peak transient outward current， Ipeak） 成 分消失。剩余对4-AP 不敏感的电流 （图1B） 激活缓 慢， 失活也缓慢， 类稳态电流 （阶跃测试脉冲 350 400 ms 记录
17、的电流平均值， quasi steady-state outward 508李世英等： 大黄素对大鼠近端结肠平滑肌细胞电压依赖性钾通道的影响 current， Iss） 较给药前没有明显下降。因此峰电流由 IKA组成， Iss则基本反映 IKdr。Xiong 等 6发现大鼠结 肠环肌细胞的 IKA随年龄增大而减小， 本实验中也观 察到类似现象。实验中选取主要表现为 IKA幅度小 的细胞进行实验， 以减小 IKA电流对 Iss的影响。 2 大黄素对 KV的影响 将膜电位钳制在 - 70 mV， 单个阶跃去极化到 +50 mV， 时程 400 ms， 给药后每 10 s 刺激 1 次， 观 察钾电
18、流的变化。发现灌流药物 30 s 后， 钾电流失 活逐渐加快， 2 3 min 后达到稳定。大黄素 （1 30 molL -1） 可剂量依赖性地抑制 I ss， 较低浓度 （5 molL -1） 主要加快钾电流的失活， 高浓度 （30 molL -1） 则对 I peak有明显的抑制作用 （图 2） 。这 种作用是可逆的， 将细胞钳制在 - 70 mV， 2 min 内 可将 5 molL -1大黄素的药物作用完全洗脱， 30 molL -1大黄素对 I peak的抑制作用则只能部分恢 复， 且需要的时间要延长。 Figure 2 Concentration dependent inhibit
19、ion of voltage gated potassium currents of a rat colon smooth muscle cell. Currents were elicited by depolarization to +50 mV from holding potential of -70 mV. Washout was performed after the presence of 10 mol L -1 emodin 3 大黄素对 KV电流-电压 （I-V） 曲线的影响 将细胞钳制在电位 - 80 mV， 阶跃去极化测试 电压到 -80 + 50 或 + 60 mV，
20、阶跃 10 或 20 mV， 脉冲时间为 400 ms， 刺激间隔为 10 s 以使失活的钾 通道恢复。测量各测试电压下的电流值 Ipeak及 Iss， 将其转化为电流密度值， 与相对应的钳制膜电位作 图得出 I-V 曲线。图 3 为给予 5 及 30 molL -1大 黄素对 I-V 曲线的影响。 给大黄素前， 钾电流在 - 40 mV 测试电压时开 始出现， +20 mV 后， I-V 曲线基本呈直线， 表示大多 数钾通道已开放。 从图 3A 中可见， 5 molL -1大黄素对 I peak没 有太大影响， 对于钾通道激活的阈值也没有明显改 变， 在 0 +60 mV 测试电压范围内与给
21、药前相比 差异没有统计学意义 （P 0. 05） ； 但图 3B 中， 在 0 +60 mV 测试电压范围内对 Iss有明显的抑制作 用， 使 I-V 曲线有 1 个下弯， 与给药前相比差异有统 计学意义 （P 0. 05） ， k 值分别为 （12. 4 0. 6） 及 （13. 0 1. 5）mV （P 0. 05， n = 4） 。30 molL -1 大黄素给药前后 Vh值分别为 （ - 0. 2 0. 7） 及 （16. 3 2. 6）mV （P 0. 05） ， k 值分别为 （10. 9 1. 9） 及 （11. 0 2. 4）mV （P 0. 05， n = 4） ， 对失活动
22、力学明显改 变。图5B 中， 30 molL -1大黄素给药前失活曲线 的 Vh值为 （ -46. 9 1. 7）mV， k 为 （9. 7 1. 4）mV， 给药后曲线未拟合， 从图中可见当条件脉冲为 + 40 mV， 仍有大于 40%的钾通道未失活 （与给药前相比 P 0. 05，n = 4） . Inset：upper is stimulus waveform，middle and bottom is current traces without and with emodin respectively. B：Smooth line was fitted curve of availab
23、ility of control cells with Vh= （ -46. 9 1. 7）mV and k = （9. 7 1. 4）mV. Dashed-dot line represents inactivation curve in the presence of 30 molL -1 emodin with a right shift of voltage dependence 808药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2005， 40 （9） ： 804 -809 迟整流型钾电流可使动作电位时程缩短及动作电位 频率加快 7。延迟整流型钾通道在动作电位形成
24、后起作用， 而快速激活型钾通道在动作电位形成后 基本已失活 8。本文中快速激活型钾通道的半数 失活电压约 - 46 mV， 近于平滑肌细胞的静息膜电 位及慢波电位， 说明相当一部分此类通道可调控静 息膜电位及慢波的形成。Koh 等 4也证实了特异性 阻断 IKA的 4-AP 可取消节律性的慢波， 并引发持续 的动作电位。5 molL -1大黄素通过阻断 I Kdr， 可 延长动作电位的时程， 增加钙离子的内流 9， 较高 浓度的大黄素可通过阻断 IKA， 使细胞膜轻微去极 化 8， 从而引发动作电位及平滑肌的收缩3。 本研究发现大黄素可阻断延迟整流型钾通道， 使其失活加快， 其效应是浓度依赖性
25、的。这种作用 并不是通过对钾通道的开放阻断。因为大黄素对静 息时钾通道的结合远较其开放时要高， 其阻断作用 不需要钾通道的开放， 将细胞钳制在静息膜电位也 能在短时间内将药物作用洗脱； 大黄素的作用有电 压依赖性， 随着钳制电压的升高， 大黄素的阻断作用 随之下降， 提示其在去极化电压时与作用靶点的分 离。这种作用类似于 4-AP 对于钾通道的关闭阻断 作用 （closed state block） ， 在去极化及通道开放时对 钾通道阻断作用下降 10。 较高浓度 （30 molL -1） 大黄素还可抑制快 速激活型钾电流， 其作用在短时间内较难洗脱， 提示 这两种抑制作用可能通过不同的机制。
26、此外大黄素 对钙通道也有作用， 1 molL -1大黄素可明显增加 L 型钙通道电流， 促进由 KCl 诱导的内钙增多 9。 大黄素是一种酪氨酸激酶抑制剂， 很可能通过抑制 酪氨酸激酶， 调控通道蛋白磷酸化过程， 从而影响多 种离子通道及其亚型的门控机制。 为探讨大黄素抑制钾通道的机制， 作者研究了 其通道动力学特性。5 molL -1大黄素对钾通道 的激活动力学及失活动力学没有影响， 但较高浓度 （30 molL -1） 大黄素使其激活动力学及失活动 力学曲线明显右移， 伴随斜率因子的增加， 部分解释 了大黄素对 IKA的抑制作用。Perozo 等 11观察到枪 乌贼神经轴突的延迟整流型钾通
27、道的磷酸化可使激 活曲线的右移， 导致细胞膜胞浆内侧的负电荷增加， 从而推测是细胞膜表面局部的超极化引起了激活机 制的改变。大黄素的作用机制是否可用表面电荷理 论来解释， 尚需进一步研究。 总之， 大黄素可浓度依赖性地阻断延迟整流型 钾通道及抑制快速激活型钾电流。此种作用可能是 其增强结肠平滑肌细胞电兴奋性和收缩活动的机制 之一。具体作用机制有待深入研究。 References 1Zhu F，Liu XG，Liang NC.Effect of emodin and apigenin on invasion of human ovarian carcinoma HO- 8910PM cells
28、in vitroJ . Chin J Cancer（ 癌症） ， 2003， 22 （4） ： 358 -362. 2Zhang XP，Li ZF. General situation in pharmacological studies on emodinJ . Chin Pharmacol Bull（中国药理 学通报） ， 2003， 19 （8） ： 851 -854. 3Yang WX，Yu HY，Xu WS. The effects of emodin on electrical and contractive activities of the smooth muscle cell
29、s in guinea-pig taenia coliJ . Acta Biophys Sin（生 物物理学报） ， 1994， 10 （1） ： 82 -86. 4Koh SD，Ward SM，Dick GM，et al. Contribution of delayed rectifier potassium currents to the electrical activity of murine colonic smooth muscleJ . J Physiol， 1999， 515 （Pt 2） ： 475 -487. 5Komori S，Bolton TB. Role of G-p
30、roteins in muscarinic receptor inward and outward currents in rabbit jejunal smooth muscleJ . J Physiol， 1990， 427： 396 -419. 6Xiong Z，Sperelakis N，Noffsinger A，et al. Potassium currents in rat colonic smooth muscle cells and changes during development and agingJ . Pflugers Arch， 1995， 430 （4） ： 563
31、 -572. 7Oliver D， LienCC， SoomM， etal.Functional conversion between A-type and delayed rectifier K + channels by membrane lipidsJ . Science，2004， 304 （9） ： 265 -270. 8Amberg GC，Baker SA，Koh SD，et al. Characterization of the A-type potassium current in murine gastric antrum J . J Physiol， 2002， 544 （
32、Pt 2） ： 417 -428. 9Liu Y，Shan HL，Sun HL，et al. Effects of emodin on the intracellular calcium concentration （ Ca2 + i）and L- type calcium current of the single ventricular myocytes from guinea pigJ . Acta Pharm Sin（药学学报） ， 2004， 39 （1） ： 5 -8. 10Tseng GN，Jiang M，Yao JA. Reverse use dependence of Kv 4. 2 blockade by 4-aminopyridineJ . J Pharmacol Exp Ther， 1996， 279 （2） ： 865 -876. 11Perozo E，Bezanilla F.Phosphorylation affects voltage gating of the delayed rectifier K + channel by electrostatic interactionsJ . Neuron， 1990， 5 （5） ： 685 -690. 908李世英等： 大黄素对大鼠近端结肠平滑肌细胞电压依赖性钾通道的影响