大鼠孕期地塞米松给药次数对仔鼠脑星形胶质细胞发育的影响.pdf

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1、 8浙江预防医学2 0 0 6 年第 1 8 卷第9 期Z h e i i a n g P r e v M e d , S e p t e m b e r 2 0 0 6 , V o l 1 8 , N o . 9 大鼠孕期地塞米松给药次数对仔鼠 脑星形胶质细胞发育的影响 池美珠 陈超2 李建敏， 万丽 【 摘要】目的通过产前地塞米松治疗， 钱燕 探讨不同给药疗程对仔鼠脑星形胶质细胞发育的影响。方法 实验孕大鼠 随机分为3 种情况用药， 孕期1 剂组于孕1 7 d 肌注地塞米松0 . 8 m 盯 k g / d , 孕期4 剂组于孕1 7 , 1 8 , 1 9 , 2 0 d 各肌注地塞米松

2、0 . 8 m g / k g / d ， 对照组肌注等量生理盐水。对各组孕鼠所生的仔鼠，分别于生后第 1 , 7 , 1 4 d 称脑重，检测大脑白质与海马胶质纤维酸性蛋白 ( G F A P )的表达情况，并与对照组作比较。结果孕 期激素治疗各组仔鼠全脑重量较对照组下降， 尤以4 剂组最明显;孕期激素治疗4 剂组7日 龄、1 4日龄鼠脑 海马、白质 G F A P 的表达较对照组减少，1 剂组与对照组相比无明显差异。结论大鼠孕期重复激素治疗会影 响后代脑星形胶质细胞的成熟。 【 关健词】大鼠;地塞米松;发育; 脑; 胶质纤维酸性蛋白 中图分类号:R - 3 3 2文献标识码:A文章编号:1

3、 0 0 7 - 0 9 3 1 ( 2 0 0 6 ) 0 9 - 0 0 0 8 - 0 3 I n fl u e n c e s o f Di f f e r e n t P r e n a t a l o f A s t r o c y t e i n O ff s p r i n g R a t s P r o c e d u r e o f D e x a me t h a s o n e ( D E X) o n t h e C H I M e i - z h u , C H E N C h a o ， “J i a n - m i n , a l . ( T h e F i r

4、 s t .切 % l i a t e d H o sp it a l of W e n z h o u M e d i c a l C o l l e g e ，W e n z h o u 3 2 5 0 0 0 ，C h i n a . ) ( A b s t r a c t I O b j e c t s T o e x p lo re t h e i n fl u e n c e o f d iff e re n t p ro g r a m s o f a n t e n a t a l t r e a t m e n t w i t h d e x a m e th a s o n

5、 e ( D X M ) o n t h e d e v e l o p m e n t o f a s tro c y t e i n o ff s p r i n g r a t s a n d o b s e r v e t h e r e l a ti o n s h ip b e t w e e n d o s a g e a n d e ff e c t . M e t h o d s T h e p r e g n a n t S D r a t s w e re d i v i d e d i n t o 3 g ro u p s r a n d o m ly ( o n e

6、s in g l e - d o s e - tre a t m e n t , o n e f o u r - d o s e - tre a t m e n t a n d o n e c o n t r o l ) . R a t s in s i n g le - d o s e - t re a t m e n t g ro u p w e re i n j e c t e d I M w i t h D X M ( 0 . 8 m g / k g / d a y ) o n d a y 1 7 o f g e s t a t i o n , w h i l e r a t s i

7、n f o u r - d o s e - g ro u p w e re i n j e c t e d c o n s e c u t i v e l y o n d a y 1 7 , 1 8 , 1 9 , a n d 2 0 o f g e s t a t i o n . A n d r a ts i n c o n t r o l g r o u p r e c e iv e d e q u i v a l e n t v o l u m e s o f is o t o n i c s a l i n e o n s a m e t i m e p o i n t s w i t

8、 h f o u r - d o s e - g ro u p . T h e w h o l e b r a i n o f o ff s p r i n g r a t s f ro m d iff e r e n t g ro u p s w e re w e i g h t e d o n t h e 1 s t , 7 t h , a n d 1 4 t h d a y a f t e r d e l i v e ry r e s p e c t i v e l y . M e a n w h i l e th e e x p re s s i o n o f w h i t e m

9、 a t t e r a n d g l i a l f i b r i ll a ry a c i d ic p ro t e i n ( G F A P ) i n b r a i n s o f o ff s p r i n g r a t s w e r e m e a s u r e d . R e s u l t s T h e w h o le b r a i n w e i g h t s o f o ff s p r i n g r a t s f ro m g ro u p s t re a t e d w it h d e x a m e t h a s o n e ,

10、e s p e c i a l l y t h e f o u r - d o s e - g ro u p , w e r e l i g h t e r t h a n t h o s e f r o m t h e c o n tr o l g ro u p . A n d t h e e x p re s s i o n l e v e l s o f G F A P i n h i p p o c a m p u s a n d w h i te m a t t e r o f 7 - d a y - o l d a n d 1 4 - d a y - o l d o ff s p

11、r i n g r a t s f ro m f o u r - d o s e - g r o u p w e r e l o w e r t h a n t h e c o n t r o l g ro u p , w h e r e a s t h e e x p r e s s i o n l e v e l o f G F A P i n o n e - d o s e - g r o u p h a d n o s ig n i f i c a n t d iff e r e n c e w i t h th e c o n t ro l g r o u p . C o n c l

12、 u s i o n R e p e a t e d a n t e n a t a l tre a t m e n t o n g e s t a t i o n a l r a t s d e l a y s a s t ro c y t e m a t u r a t i o n o f t h e b r a i n o f o ff s p r i n g r a t s K e y w o r d s I R a t ; D e x a m e t h a s o n e ( D X M ) ; D e v e l o p m e n t ; B r a i n ; G F A P

13、 产前糖皮质激素 ( A C T )治疗作为预防早产儿呼吸窘迫 综合症 ( R D S )的常规手段，目 前在临床上有重复应用增加 的趋势。人 C T 是细胞分化和成熟重要的调节因子，影响胶 质细胞 的成熟 和髓鞘生物合成途径。星形胶质细胞 ( A a s t ro c y te A S ) 是中枢神经系统中数量最多的细胞类型， 在 中枢神经系统扮演重要角色，对维持神经元的生存、发育、 再生和分化均有重要作用。它的分子量为 5 0 K D ,属细胞质 内的I F s 的一种成分，在诸多复杂的细胞活动中具有十分广 泛的作用。本研究以孕鼠为模型，对孕鼠在妊娠第 1 7 d 起 ( 相当于临床上孕妇

14、妊娠 2 8 周起)肌注地塞米松 ( 分为孕 期 1 剂组、孕期 4剂组，相当于临床上单程和多程治疗) 后，观察仔鼠脑重及脑海马、白质 G F A P的表达情况，了解 不同给药疗程产前糖皮质激素治疗是否对胎仔脑星形胶质 细胞的发育有不良影响，探讨产前激素治疗影响仔鼠脑发 育的机制，指导临床用药。 材料与方法 基金 项 目 Y 2 0 0 3 A 1 1 4 ) 作者单位 3 2 5 ( 又 旧;2. :温州市科学技术局资助课题 ( 项 目编号 :1 .温州医学院附属第一 医院，浙江 温州 复旦大学附属儿科医院 1 材料清洁级孕 S D大鼠由温州医学院实验动物中心提 供， 兔抗大鼠G F A P

15、 抗体，美国Z Y M E D公司提供，S P 试剂 盒、D A B 显色试剂盒购于北京中杉生物试剂公司。地塞米 松磷酸钠针剂为仙居制药产品，批号 0 5 0 1 1 1 ，规格为每支 1 m l : 5 m g o 2 用药与分组( 1 )对照组 ( n =8 ) :于妊娠第 1 7 , 1 8 , 浙江预防医学2 0 0 6 年第 1 8 卷第9 期Z h e i i a n g P r e y M e d , S e p t e m b e r 2 0 0 6 , V o l 1 8 , N o . 9 9 1 9 , 2 0 d( 孕足月2 1 一 2 2 d )各肌注生理盐水0 .

16、5 m 1 . ( 2 )孕 期 1 剂组 ( n = 8 ) :于妊娠第 1 7 d 肌注地塞米松0 . 8 m g / k g / d ( 稀释至0 . 5 m l ) ，第 1 8 , 1 9 , 2 0 d 各肌注等体积的生理盐水。 ( 3 )孕期4 剂组 ( n = 1 0 ) :于妊娠第 1 7 , 1 8 , 1 9 , 2 0 d 各肌 注塞米松0 . 8 m 酬k g / d . 3 仔鼠脑重的观察3 组孕鼠分娩后，取新生 1 , 7 , 1 4 d 龄仔鼠断头取脑称重，脑组织置 1 0 %中性甲醛固定 4 h ，梯 度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，取冠状切面切片， 切片厚

17、度5 1 .m . 4 免疫组化检测S P 法进行免疫组化检测，每组随机选取 1 6 - 2 0 张不同仔鼠个体免疫反应切片，每张随机选取 5 个 视野，通过图像采集和计算机系统 ( 华东理工大学提供) ， 计算各组仔鼠C F A P 平均吸光度值，分析比较星形胶质细胞 的相对含量。 5 统计学方法实验数据以均数士 标准差表示 土 s ) , 采用方差分析进行统计。 结果 1 A C 下对仔鼠脑重的影响l d 龄仔鼠，A C T各组脑重均有 降低， 7 d 龄和 1 4 d 龄仔鼠，产前 4 剂组脑重均有下降，见 表 1 表 ， 各组仔鼠生后第 1 , 7 ,1 4 d 龄全脑重 ( x 士

18、s ) 7 d龄1 4 d龄 仔鼠数仔鼠数 对照组 1 剂组 4剂组 I d龄 全脑重 ( 9 ) 0. 3 6 3 t 0. 以 1 0 . 3 0 8 土0 . 0 3 5 . 0 . 2 9 2 t 0 . 0 2 9 . “ 1 6 1 8 1 8 全脑重 ( 8 ) 0. 8 6 2士0. 0 4 9 0. 8 2 2士0. 0 7 3 0 . 7 8 0土0 . 0 5 6 . 仔鼠数全脑重 ( 9 ) 1 6 1 8 1 8 1 . 2 9 5土0 . 1 . 2 7 2 t 0 . 1 . 1 8 7土0 . 0 1 9 0 9 6 0 7 4 . 1620加 与对照组比较 P

19、 0 . 0 5 ) ，见表 2 , 表 3 0 讨论 表2 7 d 龄大鼠脑 G F A P 表达 探士 s ) G F A P 吸光度 组别 海马白质 对照组 ( n 二1 6 ) 1 剂组 ( n 二1 8 ) 4 剂组 ( n 二1 8 ) 0 . 0 8 5 t 0 . 0 0 8 0 . 0 8 3 t 0 . 以沁 0 . 0 4 9土0 . 0 0 8 . * 0 . 1 1 5士0. 0 0 9 0. 1 1 6 t 0. 01 1 0 . 1 0 4 10 . 0 4 3 * 与对照组比较 P 0 . 0 5 , * 与对照组比较 P 0 . 0 1 表3 1 4 d 龄大

20、鼠脑 G F A P 表达 ( x 土s ) G F A P 吸光度 组别 海马白质 对照组 ( n = 1 6 ) 1 剂组 ( n = 1 8 ) 4 剂组 ( n 二1 8 ) 0 . 1 9 2土0. 0 2 4 0 . 1 9 4 10. 0 3 5 0 . 1 6 6 10 . 0 4 2* 0. 2 0 5 10 . 0 2 9 0. 2 0 8土0 . 0 2 4 0 . 1 5 5士0 . 0 3 2 . 与对照组比较P 0 . 0 5 ， 二 与对照组比较 P 0 . 0 1 产前糖皮质激素治疗是否对后代脑发育有不良影响已 成为一个社会普遍关注的热点。近年来，随着 A C

21、T 重复用 药的增多， 其不良 反应也呈增加趋势，重复应用 A C T 可影 响神经元和神经内分泌功能，尤其是对下丘脑一垂体一肾 上腺轴 ( H P A )有影响t o ， 对神经发育也有长期影响， 可引 起心理、 神 经调节紊乱， 行为改变等:。 糖皮质激素是亲脂性化合物，很易透过细胞膜，但据 报道，只有倍他米松和地塞米松能有效通过胎盘、血液中 糖皮质激素主要与其转运蛋白 ( tr a n s c o rt i n , G C s 结合球蛋 白)和白蛋白结合，运输到机体各部位后，才逐渐游离出 来发挥作用。游离型 G C s 分子易于穿过细胞膜至胞浆，在 胞浆内与特异的 G C s 受体 (

22、G R )结合，形成激素受体复合 物后穿过核膜进人核内，激素受体复合物即与位于靶基因 上游的糖皮质激素反应元件 ( G R E S )结合或与其他转录因 子相互作用， 从而影响与G C s 有关的多种特定蛋白的m R N A 转录和蛋白合成速度。G C 。 调节蛋白质的合成的过程需一 定时间。经典的用法和用量是地塞米松6 m g ， 肌内注射每天 2 次， 共2 d 。临床观察发现，用药2 4 h 至7 d 内，药物的效 果最佳，而7 d 后药效渐消失。所以多数医生主张若用药7 d 后未发生早产，而早产的因素仍存在，应在停药 1 周后重 复应用 1 个疗程，直至妊娠 3 4 周。因国外相关研究

23、产前用 D X M的剂量相差较大，并无定论，故本实验依据产科地塞 米松用于早产孕妇重复6 次的总剂量，按人鼠体表面积比 折算成大鼠的用量分4 次注射作为4 剂组，介于 1 剂组与4 剂组之间的剂量对脑发育的影响程度尚待进一步研究。 本研究发现，产前糖皮质激素治疗可引起仔鼠脑重下 降，特别是产前4 剂组，这种改变可持续生后 1 4 d ，这与国 1 0浙江预防医学2 0 0 6 年第 1 8 卷第9 期Z h e j i a n g P r e v M e d , S e p t e m b e r 2 0 0 6 , V o l 1 8 , N o . 9 外报道基本一致5 1 。另外，正常大

24、鼠鼠仔中枢神经系统 G F A P 阳性星形胶质细胞发育的时间、出现的部位均不同， I d 龄仔鼠仅在软脑脊膜见少量阳性细胞，胞体小，突起稀 疏; 7 d 龄仔鼠海马、白质区 G F A P阳性细胞开始增多，突 起变长;1 4 d 龄仔鼠海马、白质区 G F A P阳性细胞数量明显 增加，染色强度增强，胞体增大，密度增加。产前 4剂组 生后 7 , 1 4 d 仔鼠脑白质和海马区 G F A P阳性细胞较对照组 免疫染色浅，突起短、疏，相对含量减少，提示星形胶质 细胞发育不良， 这与H u a n g 等4 1 报道结果相 符。 产 前1 剂组 与对照组相比无明显差别。妊娠晚期是胎鼠发育的重要

25、时 期，在此期间使用糖皮质激素将影响胎鼠神经系统的发育， 并且，这种作用在停药后未能在短时间内得到完全的代偿， 因为直至出生后，用药组仔鼠星形胶质细胞的发育仍落后 对照组 。 实验结果表明， 重复应用 A C T可影响仔鼠脑星形胶质 细胞发育，且与用药疗程有关，用药次数越多 ( 相当于多 疗程激素治疗) ，影响越明显。而目前大多数研究认为每周 重复多疗程激素治疗与单疗程相比只会增加母儿的危险性， 而新生儿R D S 发生率并无显著性差异 5 1 ， 从正面作用角度 亦不推荐常规重复使用 G C促胎肺成熟。鉴于重复 A C T治 疗对母儿的潜在危险性，我们建议这一治疗措施不常规用 于有持续早产危

26、险的孕妇。 参考文献 1 O w e n D , A n d r e w s M H , M a t t h e w s S G . M a t e r n a l a d v e rs it y , g l u c o c o r t i c o i d s a n d p ro g r a m m i n g o f n e u r o e n d o c r i n e f u n c t i o n a n d b e h a v i o u r J . N e u r o s e i B i o b e h a v R e v , 2 0 0 5 , 2 9 : 2 0 9 一 2

27、2 6 . 2 S l o b o d a D M, C h a l l i s J R , M o s s T J , e t a l . S y n th e t ic g l u c o c o rt ic o i d s : a n te n a t a l a d m i n i s t r a t i o n a n d l o n g - t e r m i m p l i c a t i o n s J . C u r r P h a r m D e s , 2 0 0 5 ，1 1 :1 4 5 9一1 4 7 2 3 C o e C L , L u b a c h G R

28、. D e v e l o p m e n t a l c o n s e q u e n c e s o f a n t e n a t a l d e x a m e t h a s o n e t re a t m e n t i n n o n h u m a n p r im a t e s J .N e u ro s c i B i o b e h a v R e v , 2 0 0 5 ，2 9 ( 2 ) :2 2 7 一 2 3 5 . 4 H u a n g W L , H a r p e r C G , E v a n s S F , e t a l . R e p e

29、a t e d p r e n a ta l c o r t i c o s t e r i o d a d m i n i s t r a t i o n d e l a y s a s t r o c y t e a n d c a p i ll a ry ti g h t j u n c t i o n m a t u r a t i o n m f e ta l s h e e p【 J .I n t I . D e v N e u r o s c i e n c e , 2 0 0 1 ，1 9 ( 4 ) : 5 1 L e e M J , D 4 8 7一4 9 3. G u i

30、 n n D , e t a l . S i n g l e v e r s u s w e e k l y a n t e n a t a l cvieo rt i c o s t e ro i d s i n p r e t e m p r e m a t u r e r u p t u r e o f c o u r s e s o f me mb r a n e s J . O b s t e t G y n e c o l , 2 0 0 4 , 1 0 3 ( 2 ) : 2 7 4 一 2 8 1 . ( 收稿 日期:2 0 0 5 - 0 7 - 2 6 ) ( 上接第7 页)

31、卵巢纤维卵泡膜细胞瘤患者血清 C A , : 的来 源: T i m m e r m a n 5 1 对麦格氏综合征的研究显示在肿瘤组织切 片中C A r 2 5 免疫组化结果为阴性，而大网膜表面则为强阳 性， 他们认为不是肿瘤细胞，而是腹膜 间皮细胞分泌 C A ,2 s ， 导致血清C A , 升高。B u t t in 对1 例卵巢良 性勃纳氏肿 瘤的研究也获得同样结果。我们的肿瘤切片C A 。免疫组化 染色报告进一步证实肿瘤细胞本身不分泌C A ,s ， 但大网膜 切片也没有显示阳性结果，可能和蜡块包埋取材部位有关， 没有取到大网膜的游离缘。因为前两个研究的大网膜切片 C A 12 5

32、 阳性均位于大网膜的游离缘。P a t s n e r 报道的1 0 例梅格 氏综合征中， 有6 例术前 C A 。升高， 其升高程度和腹水量 相关。在我们研究中，最高值也出现在腹水量较多、合并 胸水的患者。但是腹膜间皮细胞分泌C A t2 s 以及腹水产生的 机制仍然不清楚。是腹膜受到肿瘤的刺激，还是继发于腹 水形成，抑或肿瘤细胞和腹膜细胞之间存在某些信号通路， 这些假设尚未得到明确的证据支持。A b r a m o v 19 1 测定1 例梅 格氏 综合征患者术前、 术后连续5 天的血清I L - 1 p ， I L 一 6 , I L - 8 , T N F - a 浓度，结果显示前三者

33、明显下降，而 T N F - 。 保持高值。日 本学者I s h i k o (6 1 对1 例梅格氏综合征进行研 究， 术后连续4 天动态监测胸腔、 腹腔、 血清中的V E G F 和 C A , ， 结果显示胸水的V E G F 水平较腹水和血清的V E G F 水 平在术后明显下降， 另外肿瘤切片的V E G F 免疫组化结果显 示强阳性。本研究V E G F 免疫组化结果也证明肿瘤细胞合成 V E G F ， 但是不合成C A , 。同时观察到1 例患者C A 。升高， 但是没有胸腹水存在。这些细胞因子可能影响局部血管通 透性，导致胸腹水的生成， 但对于腹膜间皮细胞分泌 C A , ,

34、 的确切发生机制、 腹水和血清C A ,。 的关系仍有待于深人研 究 。 参考文献 1 M e i g s J V . F i b ro m a o f t h e o v a ry w i t h a s c i t e s a n d h y d ro t h o r a x : M e i g s s y n d ro m e J . A m J O b s te t G y n e c o l , 1 9 5 4 , 6 7 ( 5 ) : 9 6 2 一 9 8 5 . 2 连丽娟. 林巧稚妇科肿瘤学 M 第三版.北京:人民卫生出 版社. 2 0 0 0 , 5 5 2 一 5 5

35、5 3 Y a m a m o t o S , K o n i s h i 1 , M a n d a i M , e t a l . E x p re s s i o n o f v a s c u l a r e n d o t h e l i a l g ro w th f a c t o r( V E G F ) i n e p it h e l i a l o v a r i a n n e o p la s m s : c o r r e l a t i o n w i t h c l i n i c o p a t h o l o g y a n d p a t i e n t

36、s u r v i v a l , a n d a n a l y s i s o f s e r u m V E G F l e v e l s J . B t J C a n c e r . 1 9 9 7 ; 7 6 ( 9 ) : 1 2 2 1 一 1 2 2 7 . 4 0 C o n n e l l G J , R y a n E , M u r p h y K J , e t a l . P r e d i c t iv e v a l u e o f C A :二 f o r o v a r i a n c a r c i n o m a i n p a t i e n t

37、s p r e s e n t i n g w it h p e l v i c m a s s e s J . O b s t e t 仰n e c o l . 1 9 8 7 , 7 0 ( 6 ) : 9 3 0 一 9 3 2 . 5 T i m m e r m a n D , M o e r m a n P , V e r g o te I . M e ig s s y n d r o m e w i th e l e v a t e d s e r u m C A ,2 5 l e v e l s : t w o c a s e re p o rt s a n d re v i e

38、 w o f t h e l i te r a t u r e J . G y n e c o l O n c o l . 1 9 9 5 5 9 ( 3 ) : 4 0 5 一 4 0 8 . 6 I s h i k o 0 , Y o s h i d a H , S u m i T , e t a l . V a s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o w t h f a c t o r l e v e l s i n p l e u r a a n d p e r it o n e a l fl u id i n M e i g s s y n d

39、 ro m e J . E u r J O b s t e t G y n e c o l R e p r o d B i e l . 2 0 0 1 ，9 8 ( 1 ) :1 2 9 一 1 3 0 . 7 D e P r i e s t P D , S h e n s o n D , F r i e d A , e t a l . A m o r p h o lo g y i n d e x b a s e d o n s o n o g r a p h i c f i n d i n g s i n o v a r ia n c a n c e r . G y n e c o l O

40、n c o l . 1 9 9 3 , 5 1 ( 1 ) :7 一1 1 . 8 S l a d k e v i c iu s P , V a l e n t i n L , M a r s a l K . T r a n s v a g in a l D o p p le r e x a m i n a t i o n f o r th e d i f f e re n t i a l d i a g n o s i s o f s o l i d 州v i e t u m o r s J . J U l t r a s o u n d M e d . 1 9 9 5 .1 4 ( 5 ) :3 7 7 一 3 8 0 . 9 A b r a m o v Y , A n t e b y S O , F a s o u l io t i s S 7 . B a r a k V . T h e ro l e o f i n fl a m m a t o ry c y t o k i n e s i n M e i g s s y n d ro m e J .O b s t e t G y n e c o l . 2 0 0 2 , 9 9 ( 5 P t 2 ) :9 1 7 一 9 1 9 . ( 收稿日期:2 0 0 6 - 0 2 - 2 7 )