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1、中国临床康复第!“卷 第#$期2006-07-10 !“ Chine6 大鼠白色脂肪组织来源血管内皮生长因子受体阳性细胞向 内皮细胞的诱导分化! 付全花 !王豪夫!崔 磊 #!曹谊林# ! 基础研究 ! 1青岛大学医学院附属医院肝胆血管外科,山东省青岛市 266003;2上 海市第九人民医院整复外科,上海市200011 付全花!,女,1978年生,山东省新泰市人,汉族,青岛大学医学院在读 硕士,主要从事血管外科临床研究。 通讯作者:王豪夫,硕士,副主任医师,青岛大学医学院附属医院肝胆血 管外科,山东省青岛市266003 中图分类号:R394.2文献标识码:A文章编号:1671-5926(200
2、6)25-0021-03 收稿日期:2005-08-15修回日期:2006-02-11(05-50-8-6181/Y%S66epted9 2006-02-11 ;?ABC9SNiseUperimentTasconductedattNeSNangNaiVey Waboratory of Sissue Xngineering from December 2004 to April 2005. YNite adipose tissue Tas collected from fold inguen of 3*TeeZ*old Yistar rats.SNe obtained cells after d
3、igestion Tere inoculated in tNe Oetri disNJ and cultured TitN DLXL culture medium containing 0.1 Polume fraction of fetal boPine serum.Vascular endotNelial groTtN factor receptor*2 VXR*2)cells of passage 2 Tere sorted by LAMS.SNe obtained cells Tere diPided into induction group DLXLJ0.1 Polume fract
4、ion of fetal boPine serumJ10 g/W endotNelial groTtN factor and 2 g/W basic fibroblast groTtN factor)and non*induction group(DLXL,0.1 Polume fraction of fetal boPine serum)for culture. Mellular purity Tas detected TitN floT cytometer before and after sortingQSNe groTtN curPe Tere measured TitN LSS co
5、lorimetric assay.Mellular morpNology Tas obserPed under an inPerted pNase contrast microscopeQSNe eUpression of cellular Pon Yillebrandfactorandbloodplatelet*endotNelialcelullaradNesion molecular TitN immunofluorescenceQluorescence microscope Tas used to obserPe tNe function of taZing up Di_*ac*WDW
6、loT*density lipoprotein) by tNe induced cells.SNe ability of forming capillary*liZe structure in tNree* dimensional matrices Tas obserPedJand tNe induced cells Tere also cultured in metNylcellulose. DCEF?C9 Mellular purity : loT cytometer sNoTed tNat 94.066.86a of VXR*2*selected cells eUpressed VXR*
7、2JTNile only 8.651.47a of non*selected cells Tere VXR*2.SNere Tas no significant difference betTeen tNe tTo.Determination of cell groTtN curPe:Mells in tNe induction group greT Tell in tNe inducted culture mediumJand tNey entered tNe logaritNmic pNase on tNe 3rdday and reacNed tNe platform on tNe 6t
8、Nday.Mells in tNe non*induced group greT sloTlyJentered tNe logaritNmic pNase on tNe 5tNday and reacNed tNe platform on tNe 8tNday. SNere Tas significant difference at eacN time point after 5 days ? b 0.05). Mellular morpNology obserPation: At 12 days after cultureJ cells in tNe non*induced group Ta
9、s fusiformJTNile tNose in tNeinduced group presented“slabstone“*liZe arrange. _mmunofluorescence : After 12 days of inductionJPon Yillebrand factor and endotNelial cellular adNesion molecular in tNe induction group Tere positiPe Jand tNose in tNe non* induction group Tere negatiPe. unction detection
10、 of endotNelial cells: After 12 days of loT*density lipoprotion taZing upJinduction group presented red fluorescenceJbut non*induction group did not. SNree* dimensional culture:Mells Tere inoculated on tNe metNylcellulose in tNe induction group and“brancN*liZe“structure formed 3 days laterJ and tNer
11、e Tas no sucN structure in tNe non*induction group. 8AG8FEHIAG9Adipose tissue*deriPed VXR2cells can induce and proliferate into mature endotNelial cells. %3). +38M.7;N18;0OL 摘要 目的:观察大鼠白色脂肪组织作为内皮祖细胞来源的可能性。 方法:实验于2004-12/2005-04在上海组织工程重点实验室完成。 取3 周龄Yistar大鼠腹股沟白色脂肪组织J消化法得到的细胞接种在培养 皿内,用含体积分数为0.1的胎牛血清的DL
12、XL培养基培养,传至第2 代,应用免疫磁珠分选仪分选血管内皮生长因子受体阳性细胞。 获得的 细胞分诱导组(DLXL,体积分数为0.1的胎牛血清,血管内皮生长因子 10 g/W,碱性成纤维细胞生长因子2 g/W)和非诱导组(DLXL,体积 分数为0.1的胎牛血清)进行培养。流式细胞仪检测分选前后细胞纯度; 噻唑蓝比色法检测诱导组与非诱导组细胞的生长曲线; 相差倒置显微 镜观察细胞形态; 免疫细胞荧光检测细胞Pon Yillebrand因子和血小 板-内皮细胞间黏附分子-1的表达; 荧光显微镜观察细胞摄取Di_*ac* WDW的功能; 诱导组细胞接种于甲基纤维素半固体培养基进行三维培 养,观察形成
13、血管样结构的能力。 结果:细胞纯度:流式细胞仪检测显示未分选的第2代细胞血管内皮 生长因子受体阳性率为(8.651.47)a,刚分选的血管内皮生长因子受 体细胞阳性率(94.066.86)a,两者比较差异显著。 分选前后的第2代 细胞血小板-内皮细胞间黏附分子1阳性率分别为 (1.260.21)a和 (0.570.06)a,两者比较差异无显著性。细胞生长曲线测定:诱导组 细胞在诱导培养基中生长良好,第3天进入对数生长期,第6天到平台 期。 非诱导组细胞生长较慢,第5天进入对数生长期,第8天到平台期。 第5天后各时间点差异均显著(? b 0.05)。细胞形态观察:培养12 d 后,非诱导组细胞为
14、梭形,而诱导组细胞呈“铺路石“样排列。细胞免 疫荧光检测: 诱导培养12 d后诱导组细胞Pon Yillebrand因子和血小 板-内皮细胞间黏附分子1为阳性,非诱导组细胞皆为阴性。内皮细 胞功能检测:诱导后12 d后的低密度脂蛋白摄取实验,诱导组细胞内 出现红色荧光,非诱导组为阴性。三维培养:诱导组细胞接种在甲基 纤维素的半固体培养基内3 d后形成“树枝样“分叉结构,未诱导组细 胞未形成此类结构。 结论: 大鼠脂肪组织来源的血管内皮生长因子受体阳性细胞能够诱导 分化为成熟内皮细胞。 主题词:干细胞;脂肪组织;血管内皮生长因子受体-2;大鼠 J引言 近年的一些研究表明,成体内存在成血管细胞或
15、内皮祖细胞,在机体需要的时候,这些细胞能够循环、 分化并参与新生血管的形成c1J2d。在损伤、缺血和组织再 生等病理过程中,机体招募内皮祖细胞参与新生血管 !“ 大鼠白色脂肪组织来源血管内皮生长因子受体阳性细胞向 内皮细胞的诱导分化 付全花!等. “#$ %级2周龄?A大鼠+- 只,雌雄不限,体质量(+).-+B376U62-6 CLoi ZNZenned_ ONZaarov AN,- .125U725-32 ZaPKLal SNAXiel VNPleKerian ZbN,- .9U1035-40 eLling hON VrgPn SN STLPXaTLer hN ,- .95U3106-12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 与非诱导组比较,第5天开始差异显著,aP 0.05 图1细胞生长曲线测定 !“