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1、实验研究 文章编号 1 0 0 7 0 8 9 3 ( 2 0 0 8 ) 0 2 0 0 8 7 一0 4 大鼠急性肾缺血再灌注对细胞内 钙水平与细胞凋亡的影响 潘广新1 赵军2 徐淑艳3 ( 1 空军总医院泌尿外科，北京1 0 0 0 3 6 ；2 吉林大学第一医院泌尿外二科暨器官移植中心， 吉林长春1 3 0 0 2 1 ；3 吉林大学中日联谊医院骨科，吉林长春1 3 0 0 3 1 ) 摘要目的：观察缺血再灌注损伤对肾细胞游离钙( ( C a 2 + ) i ) 水平和细胞凋亡的影响。方法：采用摘除大鼠左肾， 钳夹右侧肾蒂的方法，建立急性缺血再灌注肾损伤模型，应用F u r a 一2
2、A M 荧光指示剂测定缺血再灌注大鼠肾细胞【C a 2 + ) i 水平，流式细胞术检测肾细胞凋亡率。结果：缺血再灌注不同时期肾细胞呈现不同程度C a 2 + 超载，与对照组相比差异显 著( P O 0 1 ) ；肾细胞凋亡率与对照组相比差异显著( P O 0 5 ) 。结论：缺血再灌注不同时期肾细胞呈现C a 2 + 超载现 象并与肾细胞凋亡率有正相关趋势，再灌注时间与肾细胞C a 2 + 超载呈正相关，提示再灌注损伤在加重细胞钙超载同时增 加了肾组织细胞凋亡，可能是再灌注损伤肾功能障碍的重要原因。 关键词缺血再灌注；肾组织；细胞钙超载；细胞凋亡 中图分类号) R 一3 3 2 文献标识码
3、A T h eS t u d yo fI n t r a e e n u h 】rI o n i z e dC a l c i u mL e v e la n dA p o p t o s i s D u r i n gR e n a lI s c h e m i cR e p e r f u s i o nI n j u r yi nR a t s P A NG u a n g - x i n l ，Z H A 0J u nX US h u - y a n 3 ( 1 D e p a r t m e n to fU r o l o g y , T h eG e n e r a lH o s
4、p i t a lo ft h e 彳护F o r c e , B e i j i n g1 0 0 0 3 6 ；2 D e p a r t m e n to f T r a n s p l a n tC e n t e ra n ds e c o n dU r o l o g y , t h eF i r s tH o s p i t a lo fJ i l i nU n i v e r s i t y , J i l i nC h a n g c h u n13 0 0 21 ； 3 D e p a r t m e n to fU r o l o g y , C h i n a - J
5、a p a nU n i o nH o s p i t a lo fJ i l i nU n i v e r s i t y , J i l i nC h a n g c h u n1 3 0 0 31 ) A b s t r a c t O b j e c t i v e T os t u d yt h ee f f e c to fr e n a li s c h e m i cr e p e r f u s i o ni n j u r yo nt r a c e l l u l a ri n o n i z e d c a l c i u ml e v e la n da p o p
6、t o s i s M e t h o d sT h em o d e lo fr a t Sa c u t er e n a li s c h e m i cr e p e r f u s i o ni n j u r yw a s e s t a b l i s h e d R e n a li n t r a c e l l u l a r C a 2 + il e v e lw a sd e t e r m i n e db yF u r a - 2 A Mf l u o r e s c e n c ea s s a y , a n dr e n a l c e l la p o p
7、t o s i sw a sm e a s u r e db yf l o wc y t o m e t r y R e s ul t s C o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p ，r e n a li n t r a c e l l u l a r C a 2 + il e v e li n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y ( P 0 0 1 ) a n da p o p t o s i sr a t ei n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y 俨 0
8、0 5 ) a td i f f e r e n t p e r i o do fi s c h e m i cr e p e r f u s i o n C o n c l u s i o nA td i f f e r e n tp e r i o do fr a t sa c u t er e n a li s c h e m i cr e p e r f u s i o ni n j u r y , r g n a li n t r a c e l l u l a r C a ” io v e r l o a d i n ga n dt h er a t eo fa p o p t o
9、 s i sw e r er e l e v a n t R e p e f f u s i o nt i m ea n dr e n a l i n t r a c e l l u l a r C a ” io v e r l o a d i n gw e r er e l e v a n t w h i c hs u g g e s t e dt h a tt h er e p e r f u s i o ni n j u r ym i g h ta g g r e g a t e o v e r l o a do fi n t r a c e l l u l a r C a 2 + ib
10、 yd i f f e r e n tm e c h a n i s m s K e yW o r d s I s c h e m i cR e p e r f u s i o n ；R e n a lT i s s u e ；I n t r a c e l l u l a rI o n i z e dC a l c i u mO v e r l o a d i n g ；A p o p t o s i s ( 收稿日期 2 0 0 8 一0 2 一1 8 ( 作者简介 潘广新( 1 9 6 6 - ) ，男，黑龙江省七台河人，主治医师，主要从事泌尿外科临床工作。 万方数据 肾缺血再灌注损伤综
11、合征是公认的移植肾重要 的致病因子，不但与移植肾功能延迟恢复的发生密 切相关，而且也与肾移植术后急性和慢性排斥反应 的发生和进展密切相判”。肾缺血再灌注损伤的发生 机制，涉及诸多因素，其中细胞内钙代谢紊乱占有 相当重要的位置，可能与急性缺血缺氧造成细胞内 信号传导障碍及细胞膜性结构改变有关。另外，急 性缺血缺氧会引起细胞的急慢性损伤、死亡和细胞 凋亡。细胞内游离钙( C a 2 十) 是介导细胞生理与病理 作用的重要信使，其浓度异常升高会引起细胞的急 慢性损伤和死亡，还可引起组织细胞的氧化侵袭。 因此，本实验拟就缺血再灌注不同时期肾细胞内钙 含量( ( C a 2 + ) i ) 和肾细胞凋亡
12、水平进行研究，为 探讨缺血再灌注损伤的发生机制提供实验依据。 1 材料与方法 1 1实验动物及主要试剂 1 1 1 动物分组实验动物系白求恩医科大学 实验动物部提供，为封闭群动物。取雄性( 避免雌 激素对缺血的调节作用) W i s t a r 大鼠3 0 只，体重 2 0 0 2 5 0g 。随机分为假手术对照组( I 组) 、缺血 lh 组( I I 组) 、再灌注1h 组( m 组) 、再灌注2h 组( I V 组) 和再灌注2 4h 组( V 组) 。 1 1 2 试剂F u r a 一2 A M 购自C a l b i o c h c m 公 司。 1 2 实验方法 1 2 1 手术
13、方法及取材将W i s t a r 大鼠在2 0 乌拉坦( 按1g k 9 1 ，i v ) 麻醉下进行手术。腹中线 切口，左肾静脉穿刺取血，摘除左肾，以避免健侧 的代偿作用。I 组：单纯切除左肾，分离右。肾动 脉、静脉，不夹闭右肾动静脉，作为假手术对照 组；I I 组：夹闭右。肾动静脉1h ，取右。| | 子作为再灌注 损伤阴性对照组。夹闭肾动静脉1h 去除动静脉夹， 静脉补给生理盐水2 0 m L 。恢复血流再灌注1h ( 组) ；2h ( I V 组) 和2 4h ( V 组) 取右肾，同时留 取血液做肾功能检测。肾上极组织做光镜和电镜检 查，其余肾组织按实验要求处理。 1 2 2 肾细
14、胞游离钙浓度( ( C a 2 + ) i ) 测定用 荧光标记探针F m a - 2 A M 标记c a 2 + ，荧光分光光度 仪( 日本，F 4 0 1 0 型) 检测田。 1 2 3细胞凋亡检测细胞凋亡率检测采用流 式细胞仪( 美国C o u l t e r 公司I L I T l I 型) 检测。 1 3 统计学方法 全部实验数据采用S P S S8 0 统计软件，统计数 据用孑s 表示，组间分析采用方差分析和g 检验。 相关分析采用直线相关分析法。 2 结果 2 1 缺血再灌注肾组织病理改变 肉眼观肾组织在急性缺血及再灌注后肾皮髓质 微白并有轻度肿胀，余未见明显大体改变。光镜 下病
15、理改变：急性缺血及再灌注1h 组即可见肾小管 上皮细胞发生肿胀、变性；再灌注2h 和2 4h 组见 肾小管上皮细胞肿胀加剧，小管腔变窄，并出现上 皮细胞坏死，肾小球基底膜增厚。电镜结果：急 性缺血再灌注肾组织出现系列损伤性变化，近曲肾 小管发生变性、小管腔表面微绒毛减少或消失、甚 至发生溶解坏死；内质网脱颗粒扩张呈空泡状、线 粒体肿胀畸形、嵴断裂( 图1 ) ；膜性细胞器发生髓 样变性；微血管腔明显缩小或内皮细胞溶解；肾小 球3 层膜明显增厚，足突融合或消失等改变( 图 2 ) 。对照组肾组织细胞超微结构未见异常改变。 图1 再灌注2 h 肾小管( T E M 1 0 0 0 0 ) 万方数据
16、 图2 再灌注2 h 肾小球( T E M 1 2 0 0 0 ) 2 2 缺血再灌注后肾功能的改变 急性缺血再灌注损伤后肾脏功能有不同程度改 变，本项实验以血清C r 和B U N 水平作为评价肾功 能的检测指标。在急性缺血和再灌注早期( 再灌注 l 2h ) ，肾损伤改变明显，与对照组相比血清C f 和 B U N 明显增高( 尸 0 0 1 ) ，再灌注晚期( 2 4 h ) ，肾 功能未见明显改善，与对照组相比损伤仍很明显 ( f = 3 3 2 ，P 0 0 5 ) ，见表1 。 表l 肾缺血再灌注前后各组肾功能变化( i s ) 与I 组比较，木P 0 0 5 ，半宰P O 0 1
17、 。 2 3 急性缺血及再灌注对肾细胞( ( C a 2 + ) i ) 的影响 应用荧光分光光度仪检测急性缺血及再灌注损 伤肾细胞( ( C a 2 + ) i ) 均明显增高( f = 3 4 8 9 7 7 4 ， P 0 0 1 ) ，尤以再灌注2 4 h 组最为显著( f = 1 3 2 1 ， P 0 0 1 ，表2 ) 。 表2 大鼠肾细胞( ( C a 2 + ) i ) 水平 ( i s ，c e n m o l L 1 ) 与I 组比较，术P 0 0 1 。 2 4 肾组织细胞凋亡水平 流式细胞仪检测细胞凋亡率( 表3 ) ，在再灌 注各组均可见明显的凋亡峰，表明再灌注损伤
18、直 接造成以细胞凋亡为主的细胞D N A 分子的损伤性 改变。 表3 急性缺血再灌注损伤大鼠肾细胞凋亡率 ( i s ) 与I 组比较，牛P 0 0 5 ，木半P O 0 1 。 2 5 肾细胞( ( C 矿) i ) 与肾细胞凋亡率相关性 相关分析显示缺血再灌注细胞C a 2 + 超载与肾细 胞凋亡率有正相关趋势。表明在急性肾缺血再灌注 损伤中，肾细胞C a 2 + 超载可能加重和或诱导了细胞 凋亡的发生。 2 6肾损伤程度与细胞凋亡相关性 本研究中细胞凋亡率与肾功能损伤正相关( ，= 0 6 9 ) ，揭示缺血再灌注损伤中肾功能难以恢复与细 胞凋亡过多有关。 万方数据 3 讨论 缺血再灌注
19、损伤存在复杂的生物信息调节机 制，其中肾组织细胞内钙代谢失衡和细胞凋亡关系 密切并与再灌注病理损伤密切相关。肾缺血缺氧时 血管紧张素、内皮素等缩血管物质生成释放增 多，使肾血管收缩，致再灌流时产生无复流现象。 本研究显示，在急性缺血和再灌注不同时期均有肾 组织微结构改变，并伴随肾功能严重受损。缺血缺 氧本身即可引起组织细胞钙代谢失衡，加之细胞膜 结构的破坏，导致细胞膜各种泵功能受损等一系列 改变，造成细胞内严重的钙超载现象，细胞膜和细 胞器膜性结构损伤，既是细胞C a 2 + 超载的病理组织 学基础，也可能是细胞C a 2 + 超载的结果。研究证明 缺血再灌注损伤存在细胞钙超载和细胞凋亡机制的
20、 参与口 1 。C a 2 + 作为许多血管活性物质的第二信使， 增加血管张力，降低肾血流量和肾小球滤过率。细 胞( ( C a 2 + ) i ) 升高，损伤血管内皮细胞，减少内 皮源性血管扩张因子产生，进一步诱发和加剧血管 收缩，促进病理损害。本项研究中缺血组和再灌注 各不同时期细胞( ( C a 2 + ) i ) 均明显增高，证明缺 血及再灌注导致肾细胞内钙含量增高，其原因可能 主要为：细胞钙内流增多、向细胞外排出减少。再 灌流早期( 1 2 h ) ，脂膜c a 2 + 一A T P a s e 活性有所恢 复，细胞内钙与缺血期相比略有降低，表明钙外排 增多，但仍高于正常对照组。再灌
21、注晚期细胞和细 胞器膜性结构损害加重，泵功能进一步降低和细胞 内钙池( 内脂网、线粒体等) C a 2 + 释放进入细胞浆， 另外，组织液中的C a 2 十可通过细胞膜受损部位进入 细胞内，而使细胞内( ( C a 2 + ) i ) 进一步升高，进 而加重肾损害。胞浆C a 2 + 超载可引起细胞凋亡，凋 亡中D N A 降解片段现象与内源性C a 2 + M 9 2 + 依赖性 核酸内切酶活性增高相一致旧。缺血再灌注损伤可引 起机体组织细胞c a 2 + 超载，一方面与组织抗氧化能 力降低和脂质过氧化物增多引起的细胞膜钙通道开 放有关咖，另一方面也诱导了组织细胞的凋亡。用钙 拮抗剂或阻断钙
22、通道，可以明显减弱细胞凋亡的超 微结构改变、减轻细胞凋亡发生率、减轻缺血再灌 注肾损伤，也证明了( ( C a 2 + ) i ) 与缺血再灌注损 伤时细胞凋亡的发生密切相关【7 一。本研究从一个侧 面反映了移植早期的病理损伤机制与肾组织细胞C a 2 + 超载和细胞凋亡的发生有关。 上述结果表明，缺血再灌注在肾损伤机制中存 在钙代谢紊乱、细胞内C a 2 + 超载和不同程度的肾细 胞凋亡，提示再灌注损伤在细胞超微结构水平和信 息转导系统中通过不同机制加重了细胞的钙超载和 细胞凋亡。 ( 参考文献) ( 1 ) I 盈i os M e n d e s1 9 , B e s c o sM ，e
23、ta tE X p I 戚O l lo f n a n s f o m a h a g g r o w t hf a c t o r - b e t a Ia n dh y p o x i a - i n d u c i b l ef a c t o r - I a l p h ai n a ne x p e r i m e n t a lm o d e lo fk i d n e yt r a n s p l a n t a t i o n ( J ) T r a n s p l a n t a t i o n , 2 0 0 3 ，7 5 ( 1 0 ) ：1 6 4 7 1 6 5 4
24、( 2 ) 方福德，周吕，丁濂，等现代医学实验技巧全书( 下册) ( M ) 北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版 社，1 9 9 5 2 2 0 - 2 2 5 ( 3 ) S c h u m e rM ，C o l o m b e lM C ，S a w c h u kT S ，e ta 1 M o r p h o l o g i c ， b i o c h e m i c a la n dm o l e c u l a re v i d e n c eo fa p o p t o s i sd u r i n gi n t h er e p e r f u s i o np h a
25、 s ea f t e rb r i e fp e r i o d so ft o n a li s c h e m i a ( J ) A mJ P h a t h o l ，1 9 9 2 ，1 4 0 ( 4 ) ：8 3 1 - 8 3 4 ( 4 】Z a d o rZ ，L a c z aZ ，B e n y oZ ，e ta 1 A p o p t o s i si nf o c a lb r a i n i s c h e m i a ( J ) I d e g g y o g yS z ，2 0 0 3 ，5 6 ( 7 8 ) ：2 1 6 - 2 2 8 【5 ) A n
26、 d e r s o nK M ，A l r e f a iW A ，D u d e j aP K , c ta 1 I n c r e a s e d c y t o s o lC a 2 + a n dt y p e1p r o g r a m m e dc e l ld e a t hi nB o b 2 - p o s i t i v eU 9 3 7b u tn o ti nB c l - 2 - n e g a t i v eP C 一3a n dP a u c - 1 c e l l si n d u c e db yt h e5 - 1 i p o x y g e n a s
27、ei n h i b i t o rM K8 8 6 ( J 】 P r o s t a g l a n d i n sL e u k o tE s s e n tF a t t yA c i d s ，2 0 0 2 ，6 6 ( 4 ) ： 4 4 3 _ 4 5 2 ( 6 ) B o u l a r e sA H R e nT M e c h a n i s mo fA c e t a m i n o p h e n - I n d u c e dA p o p t o s i si nC u l t u r e dC e l l s ：R o l e so fC a s p a s
28、e - 3 ， D N AF r a g m e n t a t i o nF a c t o r , a n dt h eC g + a n dM 9 2 + E n d o n u c l e a s eD N A S l L 3 ( J ) P h a n n a c o lT o x i c o l ，2 0 0 4 ， 9 4 ( 1 ) ：1 9 - 2 9 ( 7 ) R a a f a tA M , M u r r a yM T , M c G u i r eT e ta 1 C a l c i u mb l o c k a d e r e d u c e sr e n a l
29、a p o p t o s i sd u r i n gi s c h e m i ar e p e r f u s i o n ( J ) S h o c k , 1 9 9 7 ，8 ( 3 ) ：1 8 6 - 1 9 2 ( 8 ) T o m n y iE ，H a m a rJ ，P e r n e rEe ta 1 P r e v e n t i o no fa p o p t o s i s r e p e r f u s i o nr e n a l 蝎u D rb yc a l c i u mc h a n n e lb l o c k e r s ( J ) E x pT o x i c o lP a t h o l ，1 9 9 9 ，5 1 ( 3 ) ：2 0 9 - 2 1 2 万方数据