大鼠胚胎神经干细胞的分离、培养和鉴定.pdf

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1、第 2 2 卷第 3 期 2 0 0 5 年 6 月 阿 衬 林 方 季 荡母 牵惬 学 版 ， J o u r n a l o f He b e i N o r t h Un i v e r s i t y ( Me d i c a l E d i t i o n ) Vo l . 2 2 No . 3 J u n e 2 0 0 5 大鼠胚胎神经干细胞的分离、 培养和鉴定 吉胜朴 魏会平2 ( 1 .河北北方学院法医系2 0 0 2 级， 河拈 张家口 0 7 5 0 0 0 ; 2 . 河A北方学院生物教研室， 河A 张家口 0 7 5 0 0 0 ) 【 摘要】 目的: 探讨胚胎神经千

2、细胞的分离、 培养和鉴定方法.方法: 原代培养、 培养细胞生长状况观察、 组织化学鉴定、 流式细胞仪进行细胞凋亡分析。结果: 准确分离出了神经千细胞， 了解其生长规律及细胞 凋亡的情况。结论: 用此方法分离胚胎神经干细胞实用、 便捷和可行。 【 关键词】 大鼠; 胚胎; 神经干细胞 中图分类号 R - 3 3 2 文献标识码A【 文章编号1 1 6 7 3 - 1 4 8 4 ( 2 0 0 5 ) 0 3 - 0 0 3 1 - 0 3 E x t r a c t i o n , C u l t u r e a n d A p p r a i s a l o f t h e R a t E

3、mb r y o N e u r a l S t e m C e l l s J I S h e n g - p u , WE I Hu i - p i n g He b e i N o r t h Un i v e r s i t y , Z h a n g j i a k o u , 0 7 5 0 0 0 ， C h i n a A B S T R A C T O b j e c t i v e : T o m a s t e r e x t r a c t i o n , c u l t u r e a n d a p p r a i s a l o f t h e r a t e m

4、 b r y o n e u r a l s t e m c e l l s i n i t i a l l y b y e x p e r i m e n t , I n t h i s p a p e r t h e g r o w t h r u l e a n d a p o p t o s i s o f e m b r y o n e u r a l s t e m c e l l s w e r e s t u d - i e d . Me t h o d s : t h e g r o w t h c y c l e a n d g r o w t h s t a t e f

5、o r p r i m a r y c u l t u r e n e u r a l s t e m c e l l s w e r e o b s e r v e d c a r e f u l - 1 y , a n d a p o p t o s i s w a s a n a l y z e d w i t h h i s t o c h e m i s t r y i d e n t i t i c a t i o n a n d F C M( f l o w c y t o m e t r y ) a s w e l l . R e - s u i t s : i n v e s

6、 t i g a t e d t h o r o r g h l y T h e n e u r a l s t e m c e l l s w e r e a b s t r a c t e d a c c u r a t e l y , a n d t h e i r d e v e l o p m e n t c y c l e a n d a p o p t o s i s c o n d i t io n w e r e i n v e s t i g a t e d t h o r o u g h l y . C o n c l u s i o n ; T h e r e s u

7、l t a b o v e c a n p r o v i d e r e l i a b l e e v i - d e n c e t o o b t a i n a g r e a t q u a n t i t y o f n e u r a l s t e m c e l l s . K E Y WO R D S r a t ; e m b r y o ; n e u r a l s t e m c e l l s 减少， 屏障功能减退， 易发生各种9膜病变。断流术 后， 门脉压力降低不明显， 胃壁血流高动力状态依然存 在， 钻膜下动静脉短路进一步开放， 加重缺血， 是造成 再出血的

8、又一原因; 对于门脉高压大鼠实验模型断流 前后胃戮膜形态学变化的研究证实了上述观点 5 , 6 2 . 4 内分泌的变化肝硬化时肝功能受损， 肾上腺皮 质激素的灭活能力发生障碍， 加上门静脉高压时胃淤 血， H 十 逆向弥散增加， 广泛钻膜下水肿及戮膜负电位 差降低， 导致戮膜屏障功能严重受损， 血流减少， 压力 增加， 使胃豁膜病变加重。 防止门奇静脉断流术+脾切除术后胃破裂的发 生， 首先在切断脾胃韧带时靠近脾侧， 胃侧断端应贯穿 缝扎并浆肌层包埋， 以加强局部解剖结构; 其次持续胃 肠减压， 降低胃液对缺血胃壁的张力; 第三常规应用保 护胃猫膜和抑制胃酸分泌的药物， 减少胃液对胃壁的 侵

9、蚀; 第四能否通过胃冠状静脉腔静脉分流术减轻胃 静脉怒张， 关闭胃豁膜下动静脉短路治疗门脉高压性 胃病的方法还需经动物实验及临床观察得到证实。 参考文献 李文美， 陈治平， 邝雄麟.门奇静脉断流术对门静脉血流动 力学的影响 J . 普外临床， 1 9 9 6 , 1 1 ( 6 ) : 3 2 5 - 3 2 7 王效民， 申推宗， 刘志发.门脉高压大民胃钻膜损害发病机 制及其与断流术的关系 J . 中华外科杂志， 1 9 9 0 , 2 8 : 5 2 1 K a m a d a T , S a t a N, K a w a n o S . G a s t r i c m u c o s a

10、 l h e m o d y - n a m i c a l f o l lo w i n g t h e r n a l o f h e a d i n j u r y J . G a s t r o e n t e r o l y , 1 9 8 2 , 8 3 : 5 3 5 . Q u i n t e r E , P i q u e J M, B o m i b i J A , e t a l . G a s t r i c m u c o s a l e c - t a s i a s c a u s i n g b l e e d i n g i n c i r r h o s i

11、 s : A d i s t i n c t e n t i t y , a s s o - c i a t e d w i t h h y p e r g a s t r i n a e m i a a n d l o w s e r u m l e v e l o f p e p s i n - o g e n J . G a s t r o e n t e r o l o g s y , 1 9 8 7 , 9 3 ( 5 ) : 1 0 5 4 Mc c o r m a c k T T, E l s i n A T, P u g h E , e t a l . G a s t r i

12、c l e s i o n s i n p o r t a l h y p e r t e n s i o n : i n f l a m m a t o r y g a s e r i t i s o r c o n g e s t i v e g a s t r o p t h y J . G u t , 1 9 8 5 , 2 6 : 1 2 2 6 S a r f e h MD . F u n c t i o n h i s t o l o g i c a n d u l t r o s t r u c t u r e c h a r a c - t e r i s t i c s o

13、 f p o r t a l h y p e r t e h s iv e g a s t r i c m u e o s a J . J G a s t r o - e n t e r o l H e p a t o l , 1 9 8 9 , 1 : 1 ( 资任编辑: 李菌龙) 3 1 2 0 0 5 年 6 月河北北方学院学报( 医学版)第 3 期 干细胞具有可再生为各种组织、 器官的潜能， 将其 分离并使之向特定方向分化， 就可以用健康组织代替 病变组织， 治疗心肌梗死、 糖尿病等组织坏死性疾病、 退行性病变、 自体免疫性疾病等。神经干细胞( n e u r a l s t e m

14、c e l l s , N S C s ) 是具有增殖和分化潜能的原始神经 细胞， 它能分化成神经组织的各种细胞， 如神经元、 星 形胶质细胞和少突胶质细胞等， 并能自我更新， 甚至能 终身存在于神经系统之中。N S C s 在理论和临床上都 具有巨大的价值， 我们知道， 脑老化可能是神经系统退 变性疾病的初级阶段， 与疾病的发生有着相同的基础， 目前已用 N S C s 治疗神经系统退变性疾病， 并且也用 于脑老化的治疗。为此我们需要大量的神经干细胞， 本课题选取大鼠胚胎神经干细胞， 探讨其分离、 培养、 鉴定的方法， 并探讨其体外生长的生物学特性。 1 材料和方法 1 . 1 材料培养基:

15、 小牛血清， 天津生物制品研究所; D ME M/ F 1 2 培养基; E G F , b F G F 、 辅助培养基等均购 自北京试剂商店。实验动物: 2 0 d 大鼠胚胎， 由河北北 方学院动物中心提供。 1 . 2 方法 原代培养取材: 在无菌室内取孕鼠新鲜子宫， 用 烧杯盛之， 用 7 5 %酒精浸泡， 严格无菌的条件下， 取出 胚胎， 剪开头皮， 撕去脑膜， 掀开大脑皮层， 分别取侧脑 室部位和大脑皮层脑组织， 用 Ha n k s 液反复冲洗， 去 掉血液和血块， 除尽脑膜组织和结缔组织。分离细胞: 将组织移人青霉素小瓶， 剪碎脑组织， 加人 0 . 2 5 %胰 蛋白酶3 7

16、度消化 1 5 m i n ， 然后加人含 1 0 %小牛血清 的D ME M/ F 1 2培养基终止消化， 用 2 0 0目不锈钢筛 网过筛， 获得单细胞悬液， 然后离心， 获细胞沉淀( 1 0 0 0 转/ m i n , 8 m i n ) 。细胞培养: 在细胞沉淀内加人 l m l 含 小牛血清的培养基， 吹打均匀， 制成细胞悬液。取出一 滴细胞悬液， 细胞计数板计数， 然后以 3 5万/ ml 细胞 接种到2 5 m 1 培养瓶中， 3 7 0C , 5 %二氧化碳， 9 5 %湿度 孵箱培养。2 4 h 后除去贴壁的分化细胞和沉淀杂质。 分为两组: 一组加人含 1 0 %小牛血清的

17、 D ME M/ F 1 2 培养基; 另一组换为新鲜无血清胚胎神经干细胞培养 基， 其组分为: D ME M / F 1 2 , 2 0 n g / m l E G F , 2 0 n g / m l b F G F ， 辅助培养基。培养后视培养基颜色和细胞生长 状况进行稀释和换液。 培养细胞生长状况观察 每天对细胞进行计数， 随 即选择 1 0 个高倍视野， 取其平均值， 作为每天的细胞 数目指标， 由此可知细胞的生长状况。 每天对细胞的形态、 分裂、 分化情况、 有无克隆球 3 2 等生物学特征进行观察， 记录结果。 组织化学鉴定原代培养次日换液时， 取一瓶培 养细胞， 吹打均匀后离心，

18、 去上清液， 滴加 0 . 5 m 1 细胞 因子培养基， 吹打均匀， 直接滴加在 0 . 2 5 %多聚赖氨 酸包被好的盖玻片上， 进行培养， 生长 5 d后， 终止培 养， 按常规免疫荧光方法进行鉴定， 鉴定未诱导分化的 神经球的细胞属性。 流式细胞仪进行细胞凋亡分析自原代培养当天 起， 每隔 2 -3 d 取一瓶细胞， 4 %多聚甲醛固定， 用于细 胞凋亡分析。 2 结果 2 . 1 培养细胞的生长情况原代培养细胞均为圆形 亮球状， 含小牛血清培养基中的细胞第三天开始贴壁 分化， 细胞渐渐变为梭形， 伸出突起， 第 6 天出现大量 神经元和神经胶质样细胞， 突起交织成网状。培养物 中共有

19、四种不同形态的细胞: 悬浮圆形亮球状神经干 细胞样细胞; 具有 1 -2 个长突起的神经元样细胞; 多 个细突起且不断分支的少突胶质细胞样细胞; 多个粗 长突起的星形胶质细胞样细胞。含生长因子的培养基 中细胞大多为圆形亮球状， 于第 3天可见正在分裂细 胞， 并在第 4 天可见神经球; 但含生长因子的培养基中 也有贴壁分化伸出突起的细胞， 这些细胞活力渐渐减 小， 于第 5 天完全凋亡。 2 . 2 生长曲线原代培养细胞接种密度为 3 5 万/ m l , 在倒置相差显微镜下随机选择 1 0 个高倍视野计数( 1 0 X2 0 倍) ， 若平均每个视野细胞数为 3 5 0 计算， 由此可 知，

20、 每视野 1 个细胞所代表的实际瓶中细胞密度为 3 5 0 0 0 0 / 3 5 0 =1 0 0 0 / m l 。当第二天观察到每视野平均 数为8 0 时， 就知道实际瓶中细胞浓度为 8 0 X 1 0 0 0 / m l 。经每天计数发现， 生长因子组培养 2 -5 d细胞数 量有明显下降， 可见细胞大量死亡。6 -8 d细胞数量 成指数增加， 9 d 后细胞增加趋于平缓有受抑制现象。 血清培养基一直呈平缓下降趋势， 见表 t o 表 1 两种培养基不同时间的细胞数 万 时间( d ) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 有血清3 5 2 4 2 1 1 9 1 8 1

21、 6 1 5 . 8 1 5 . 2 1 4 . 9 1 4 . 3 1 4 无血清3 5 9 . 1 2 . 6 1 . 4 1 . 0 4 . 1 6 . 0 8 . 5 9 . 0 9 . 3 9 2 . 3 免疫荧光结果n e s t i n 是一种中间纤维骨架蛋 白， 可以作为神经干细胞的鉴别标记。用荧光免疫组 2 0 0 5 年 6 月吉胜朴等: 大鼠胚胎神经干细胞的分离、 培养和鉴定第 3 期 化法染色， 荧光显微镜下观察， 有圆球状细胞发出黄绿 色荧光， 背景呈深绿色; 而血清对照组则无此现象， 但 可以看到胶质细胞样细胞的形态轮廓， 荧光相对很弱。 这说明观察的圆球状细胞可能

22、是神经干细胞。 2 . 4 用流式细胞仪检测细胞凋亡率细胞凋亡率见 表2 ， 培养第一天细胞凋亡率只有 1 3 %， 而细胞密度却 从 3 5 万下降到第二天的2 4 万。 表2 细胞凋亡率【 %) 第 1 天第 6 天第 8 天 第 1 0 天 第 1 1 天 细胞凋亡率1 3 8 4 . 6 6 6 . 2 6 6 . 8 4 8 . 6 3 讨论 3 . 1 神经干细胞的分布神经干细胞是一类可自我 更新、 具有分化潜能的原始细胞类型。就神经干细胞 的来源而言， 目前大多数学者主张室管膜或室管膜下 层是中枢神经系统各个部位干细胞的来源， 其他部位 尽管存在着有分裂能力的细胞， 但这些细胞被

23、认为是 室管膜或室管膜下层的神经干细胞经过某种途径迁徙 而来的。这些细胞严格来说已经不是干细胞了， 因此 他们的增殖能力是有限的。 3 . 2 细胞分离方法分离细胞时我们采用了不同于 常规的胰酶消化法， 即再回收筛网上的脑组织加人 0 . 2 5 %胰蛋白酶3 7 消化 1 5 m i n ， 然后加人含 1 0 写小 牛血清的D ME D / F 1 2 培养基终止消化， 用 2 0 0目不锈 钢筛过筛， 除去未分散的脑组织获得单细胞悬液。这 种方法的优点是避免了过度消化或过度机械吹打造成 的细胞碎片， 缺点是易污染， 因此操作时应特别小心。 3 . 3 培养细胞的方法我们在取材当日 进行细

24、胞计 数， 接种密度为3 5 万， 第二天细胞密度急剧下降， 离心 前2 4 万， 这是大量非神经干细胞死亡造成的。离心后 密度 9 万， 说明离心会造成大量细胞损失， 因此， 在整 个培养过程中采用了半定量换液法， 得到的生长曲线 与其他的文献数据基本一致， 所以， 半定量换液法是减 少神经干细胞死亡的有效措施之一。 3 . 4 细胞生长和凋亡情况血清培养基细胞生长一 直呈下降趋势是因为分化细胞一般不会再增殖， 而神 经干细胞在体外保持未分化状态及其增殖特性， 在培 养基中加人一定浓度的促有丝分裂因子， 如 E G F和 b F G F ， 经过2 -5 d的潜伏期后， 6 .8 d 细胞表

25、现为对 数生长期， 9 d 后增加趋于平缓， 有受抑制现象， 这可能 是因为体外培养条件有限， 只有少部分细胞保留了干 细胞的特性， 其余大部分则经过非对称性分裂生成为 先祖细胞， 最后变成某一特定表型细胞的前体细胞， 虽 然细胞仍保持幼稚的特点， 但并不能分裂增殖， 因此生 长9 d 后细胞增加趋于平缓， 有受抑制的现象。 细胞凋亡率表明: 第一天细胞凋亡率只有 1 3 %, 而细胞密度却从 3 5 万下降到第二天的 2 4 万， 此时细 胞死亡可能是由于细胞坏死和受机械损伤所致， 这与 形态学观察的结果一致。凋亡细胞在指数生长的第 6 天到第8 天呈下降趋势， 从8 4 . 6 %到“.

26、2 %。细胞凋 亡率减少意味着细胞数量增加， 这与生长曲线 6 -8 d 呈指数生长完全吻合; 第 1 1 天细胞凋亡率呈下降趋 势， 细胞增殖也呈下降趋势， 说明 n 天后细胞因子对 细胞增殖没有促进作用， 所以生长呈现增长缓慢。 流式细胞仪定量测定细胞凋亡率的结果评价: 细 胞固定后可长期保存， 适用于不同时间获得的组织或 细胞之间的比较研究， 但由于先固定细胞， 再进行染 色， 故不能将凋亡细胞与坏死细胞和受机械损伤细胞 严格区分开来。 参考文献 1 B j o r k l u n d A . L i n d v a l l O J . N a t u r e , 2 0 0 0 , 4

27、 0 5 : 8 9 2 - 8 9 5 2 D u n n e t t S B , B j o r k l u n d A . L i n d v a l l O J . N a t R e v N e u r o s c i , 2 0 0 1 , 2 : 3 6 5 - 3 6 9 3 蔡文琴， 李海标主编. 发育神经生物学 M . 北京: 科学出版 社 ， 1 9 9 9 . 2 5 9 - 2 7 9 4 杨玲蜂， 李小玉， 胡火珍. S D大鼠乳戒神经干细胞的培养、 分离的实验研究 C . 中国医学生物学研究， 2 0 0 4 . 2 2 0 - 2 2 4 5 巩晓明， 李小玉， 胡火珍. 兔胚胎神经干细胞的分离、 培养和 鉴定 C . 中国医学生物学研究， 2 0 0 4 . 2 1 5 - 2 2 0 6 温进坤， 韩梅主编. 医学分子生物学理论与研究技术 M . 北 京: 科学出版社， 2 0 0 2 . 2 4 4 - 2 4 5 ( 责任编辑: 袁朴) 3 3