大鼠脊髓内水通道蛋白-4(AQP-4)分布规律的研究.pdf

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1、2 0 0 7 年1 1 月 第1 9 卷上半月第1 1 期 中国民康医学 M e d i c a lJ o u r n a lo fC h i n e s eP e o p l e 自H e M t h N O V 2 0 0 7 V o l1 9F H MN o 1 1 【论著】 大鼠脊髓内水通道蛋白一4 ( A Q P 一4 ) 分布规律的研究 王威，孙丽君 ( 内蒙古医学院赤峰附属医院骨科内蒙古赤峰0 2 4 0 0 0 ) 【摘要】目的：通过研究大鼠脊髓水通道蛋白一4 ( A Q P 一4 ) 的分布规律，探讨脊髓内水转运的分子生物学机制。方法：通过免疫组织 化学方法标记A Q P

2、一4 在大鼠脊髓内的表达，图象分析系统测定阳性区域的平均吸光度，对不同区域的A Q P 一4 表达作统计学分析。结果：软 脊膜1 中央管周围、灰质血管周围A Q P 一4 表达较中央灰质、白质有显著增多；中央灰质A Q P 一4 表达较白质显著增多，软脊膜、中央管、灰质血 管周围之间比较无统计学差异。结论：大鼠脊髓内A Q P 一4 呈极性分布，主要集中在与水转运关系密切的部位是脊髓内水转运重要的的分 子生物学解剖基础。 【关键词】脊髓；水转运；水通道蛋白4 中图分类号】R 一3 3 2 文献标识码】A 文章编号 0 3 6 9 ( 2 0 0 7 ) 1 1 0 9 4 7 0 3 S t

3、u do fC h a n g i n go fA Q P - 4E x p r e s s i o ni ni n j u r e ds e c t i o no fS p i n a lC o r d i nR a t s W A N G W e i ，S U NL i j ( T h ea l d f e 唱吲血e dI - 0 s p i t a ldi r m 盯m o r g o l i am e d i c a lc o l l e a g e ，i n n e rm o n g o l i a0 2 4 0 0 0 ，C h i n ) 【A b s t r a c t 】O

4、b j e c t i v e ：T h r o n g hs t u d y i n g t h ec h a n g i n go fA Q P 一4e x p r e s s i o no f i n j u r e ds e c t i o no fs p i n a lc o r d t h e m e c h a n i s mo f m o l e c u l a rb i o l o g yo fw a t e rt r a n s p o n i o ni st ob ep r o b e di n t o M e t h o d s ：U s i n gt h em e t

5、 h o do fi m m u n o h i s t o c h e m i s n yt oL a b e lt h ee x p r e s - s i o no fA Q P 一4i ns p i n a lc o r do fr a t sa n du s i n gi m a g ea n a l y s i ss y s t e mt oe s t i m a t ea v e r a g ed e g r e eo fs p e c t r u ma b s o r p t i o no fm a l ea r e a ， A n da n a l y s i n gR e

6、s u l t s ：T h ee x p r e s s i o no fA Q P - 4i ss i g n i f i c a n tm o r ei ns p i n a lp i am a t e ra n da r o u n do fS p i n a lc o r dc e n t r a lc a n a la n d a r o u n do fG r a yM a t t e rb l o o dv e s s e lt h a nc e n t r a lo fG r a yM a t t e ra n dw h i t em a t t e r I ti sn od

7、 i f f e r e n c ei ns p i n a lp l am a t e ra n da r o u n do f S p i n a lc o r dc e n t r a lc a l l a a n da r o u n do fG r a yM a t t e rb l o o dv e s s e l C o n c l u s i o n s ：I ti so fp o l a r i t yd i s t r i b u t i o no fA Q P 一4i ns p i n a lc o r di n r a t s A n dA Q P 一4C o n c

8、e n t r a t ei ns u c hs p o to fc l o s er e l a t i o nw i t hw a t e rb a n s p o r t i o nS u c hi sm o l e c u l a rb i o l 0 9 3 , D i s s e c t i o no fw a t e r l a a n s p o r t i o n 【K e yw o r d s 】S p i n a lC o r dI n j u r y ；S p i n a lC o r dO o d e m a ；A Q P 一4 水通道蛋白( a q u a p o

9、r i n ，A Q P ) 是A g r e 等人在 胸腔显露心脏。左心室穿刺，先后用生理盐水、4 1 9 9 4 年分离发现的一组与水通透有关的细胞膜转多聚甲醛作心脏灌注。灌注固定后取俯卧位后正中 运蛋白，人类A Q P 家族现已知的1 1 个成员中有6切口切开，显露胸段脊髓，切取约1c m 长胸段脊髓， 个分布于中枢神经系统，其中水通道蛋白4 ( A Q P 一 置于4 多聚甲醛溶液内浸泡固定。将标本梯度酒 4 ) 含量最高，它具有选择性转运水的功能，已证实精系列脱水、梯度二甲苯系列脱脂、石蜡包埋，连续 A Q P - 4 在中枢神经组织水的调节代谢中起关键作切片，片厚5 “m ，裱于载

10、玻片上。切片置于6 0 烤 用”1 ，并推测A Q P 一4 与中枢神经系统水肿的产生箱内烘烤7 2h ，做免疫组织化学染色。采用链霉菌 密切相关，但具体机制尚不清楚。本实验采用大鼠抗生物素蛋白过氧化物酶( s P ) 法进行。石蜡切片 脊髓，用免疫组织化学的方法检测大鼠脊髓内不同常规二甲苯脱蜡，3 H ：O ：室温孵育l o 分钟以消除 区域A Q P 一4 的表达，研究A Q P 一4 在大鼠脊髓内的 内源性过氧化物酶的活性，蒸馏水洗3 次，每次2 分 表达规律，以期探索脊髓内水转运的分子生物学解钟，磷酸盐缓冲液( P B S ) 稍洗后进行免疫组化染色： 剖基础。1 0 正常山羊血清封闭

11、非特异性结合位点，室温孵 1 材料与方法 育3 0 分钟，倾去血清，水洗，滴加1 ：4 0 0 的一抗( 兔 健康雄性s D 大鼠1 2 只，体重2 5 0 3 0 0g 。抗大鼠水通道蛋白4 抗体美国S I G M A 公司) ，室温 3 0 的戊巴比妥钠d O m g k g ，腹腔注射麻醉后仰卧下孵育过夜，按A B C 试剂盒( 北京中山公司) 说明书 于鼠板上，头及四肢固定。胸前正中纵向切开，打开进行操作。P B S 液冲洗3 次，每次5 分钟，再滴加生 作者简介：王威，现在内蒙赤峰附属医院骨科工作，硕士研究 生，研究方向：脊髓损伤。E m a l l ：W E I W A N G T

12、 A O T A O Y A - H O O C O MC N 。 物素标记二抗( 羊抗兔) 室温孵育1 0 3 0 分钟，P B S 液冲洗3 次，每次5 分钟，之后滴加辣根标记链霉卵 蛋白素室温孵育P B S 液冲洗3 次，每次5 分钟，最 后加D A B 显色剂显色，自来水充分冲洗，苏木素复 9 4 7 万方数据 2 0 0 7 年1 1 月 第1 9 卷上半月第1 1 期 中围民康医学 M e d i c a lJ o u r n a lo fC h i n e s eP e o p l e gH e a l t h N o v 2 0 0 7 V o I1 9F H MN o 1 l

13、 染细胞核，脱水，透明，树脂胺封片，光镜观察。光镜 下胞膜上出现棕黄色颗粒为A Q P 一4 免疫阳性细 胞，同时用P B S 液代替一抗作为阴性对照。 统计学处理：结果统计采用S P S S1 1 0 统计软 件处理，所有计量资料均采用均数4 - 标准差表示多 样本均数比较采用方差分析，P 0 0 5 为差异有显 著性。 2 结果 低倍镜下脊髓灰质呈淡棕黄色，白质染色较灰 质浅，灰白质界限清晰。脊髓中央管、软脊膜以及灰 质的血管周围有着极性分布。在高倍镜下见阳性细 胞的胞膜淡染，胞浆及胞核未着色，呈空泡状。阳性 细胞主要为神经胶质细胞、中央管膜细胞和软脊膜 细胞，神经元未见着色。中央管周围和

14、后角临近软 脊膜部位染色较深，表达呈强阳性，其余灰质表达较 弱。白质染色较灰质更浅，呈弱阳性。神经胶质细 胞、中央管膜细胞胞膜呈棕黄色或深棕黄色，在血管 周围表达强烈，呈深棕色，表达呈强阳性。 选择中央灰质、软脊膜、中央管周围、灰质血管 周围、白质5 个解剖部位，每个解剖部位选1 0 2 0 个阳性区域用图象分析系统测定其平均吸光度，将 5 组数据用S P S S1 1 0 统计软件作方差分析。统计 结果显示：软脊膜、中央管周围、灰质血管周围与中 央灰质、白质比较有显著差异；中央灰质与白质比较 有显著差异软脊膜、中央管、灰质血管周围之间比较 无统计学差异。 表T a b l eR a t eo

15、 fa v e r a g ed e g r e eo fs p e c t r u ma b s o r p t i o n f o re v e r yg r o u p ( s ) 组别平均吸光度 白质0 1 l 00 2 中央灰质01 5 O0 3 血管周围0 1 7 00 7 中央管周围01 6 00 5 一 软脊膜01 7 00 3 一 ：P 00 1 ：P 0 0 5 。 图1 低倍镜下A Q P 一4 在脊髓内的表达( 柏。1 0 9 4 8 图2 中央管周围A Q P 一4 的高表达( 4 0 1 0 图3 血管周围A Q P - 4 高表达( 加1 0 ) 3 讨论 A Q

16、 P 家族成员的基本生理功能为特异性水通 道，介导自由水分子的跨生物膜转运，与其他离子通 道不同的功能特点是水通道不存在所谓的开放或关 闭的功能状态，只要存在渗透压梯度就可以有水分 子顺渗透压梯度通过水通道蛋白。按渗透性分类， A Q P 一4 属于A q u a p o n n s ，即仅对水可选择性通过 而对尿素、甘油或其他中性小分子溶质不通透。水 通道蛋白在脑和脊髓中含量丰富，人的中枢神经系 统中有6 种A Q P 家族成员，而以A Q P 一4 的分布和 表达为主”o 。A Q P 一4 广泛分布于中枢神经系统介 导细胞膜跨膜水转运，并被认为对水代谢和渗透调 节起主要作用”。N i e

17、 l e s e n ”o 等用免疫细胞化学及 高分辨率免疫金电镜鉴定出由A Q P 一4 调节水转运 的细胞及相应的膜区。A Q P 一4 富含于脑和脊髓表 面的软膜，靠近蛛网膜下腔的胶质细胞，脑室和中央 管的室管膜细胞及位于血管周围的胶质细胞表面 上，在脊髓毛细血管内皮细胞也有着广泛的分布。 免疫金分析进一步证实A Q P 一4 局限于胶质细胞膜 区及室管膜细胞的亚群，尤其在与毛细血管和软膜 直接相接触的胶质细胞膜上表达强烈。它已成为神 经胶质细胞另一基因标志物”1 。A Q P 一4 高度极化 分布显示这些细胞配有特别的选择性水通道的膜 区。此膜区在胶质细胞与充满C S F 的间隙中以及

18、血 万方数据 2 0 0 7 年1 1 月 第1 9 卷上半月第1 1 期 中国民康医学 M e d i c a lJ o u r n a lo fC h i n e s eP e o p l e 自H e a l t h N o v 2 0 0 7 V 0 11 9F H MN o 1 1 管之间起调节水运输作用。 R a s h ”1 等用冻结破裂法研究发现，A Q P 一4 的分 布与血一脊髓屏障上星形胶质细胞终足内的方形 ( 正交) 阵列的分布相平行，A Q P 一4 与其有着密切 关系，并认为A Q P 一4 可能是其组成部分。M a n l e y 等”1 在急性水中毒脑水肿模型中

19、研究显示，A Q P 一4 在水肿模型的脑组织内高表达，而正常鼠脑A Q P 一4 低表达；应用基因敲除技术使A Q P 一4 在脑组织表 达缺乏，结果发现缺乏A Q P 一4 的大鼠生存能力强， 且在A Q P 一4 缺乏的鼠脑内水的容量及星形胶质细 胞周围毛细血管水肿明显减轻，说明了A Q P 一4 参 与脑水肿的形成，并在脑水肿中起重要作用。S 0 - l e n o v 等“也证实了A Q P 一4 缺乏大鼠在低血钠和 急性缺血性损伤时脊髓水肿明显减轻。此外，在大 脑中动脉闭塞所致的缺血性脑水肿模型中，研究显 示在动脉闭塞的第3 d ，位于皮质梗死周围的分子层 和外颗粒层可见A Q P

20、 一4 m R N A 表达增强，尤以梗死 灶周围明显而且A Q P 一4 表达与脑水肿的程度呈 正比关系”1 。以上实验研究充分说明了A Q P 一4 在 中枢神经系统水转运机制中扮演着重要角色。 本组研究采用大鼠脊髓作为研究对象，通过免 疫组织化学方法标记A Q P 一4 在大鼠脊髓内的表 达。观察到A Q P 一4 在脊髓中的分布特点为：灰质 内的分布明显较白质内多，中央管、血管周围及脊髓 后角边缘贴近软脊膜处呈极性分布；神经元无A Q P 一4 分布，A Q P 一4 主要分布于胶质细胞、中央管膜 细胞、软脊膜细胞的细胞膜上，特别是在血管周围的 胶质细胞膜上表达强烈，而此处正是血一脊髓

21、屏障 所在的位置。这些特点与文献中A Q P 一4 在脑内分 布的报道相似。A Q P 一4 的这种分布规律充分反映 了其与脊髓内水转运的密切关系，是脊髓内水转运 重要的的分子生物学解剖基础。 参考文献 1 G m n e rJ A A m o n i l o r e dc o n t u s i o n m o d e lo fs p i n a lc o r d i n j u r y i n 岫 r a t J N e u r o n a u m a ，1 9 9 2 ，9 ( 2 ) ：1 2 3 1 2 8 2 N o b l e l W r a t h a l lJ C o r r

22、 e l a t i v e d 灿o fh s ! o nd e v e l o p m e n ta n d f u n c t i o n a l8 t m u Ba f t e r 口删s p i n a lc o r de o n U i s i r ei n j u r i e si n t h er a t J E x pN e u m l ，1 9 8 9 ，1 0 3 ：3 4 一加 3 B a d a n tJ h F ，M a g i s t r c t t iP J ，da 1 A q u a p m l mi n b r a i n ：d i s t r i b u

23、t i o n s ，p h y s i o k W a n dp m h o P h y 面o I o 科 I n t e r n a t i o n a l S o c i e t yo fC e r e b r a lB l o o dF l o wa n dM e t a b o l i s m 2 0 0 2 ，2 2 ( 4 ) ：3 6 7 3 7 8 4 R a s hJ E ，Y a s u m u mT ，H u d s o nc S ，e ta 1 D i li m m u n o g o l dl a b e l i l l g0 f 岬p o f i n 一4i n

24、呷I a m 毗“ 5o f 蚓唧ea T I d 。p e T l d y 删y k 一删唧T h 舶髓i n 哪h i I la n d 叩i 血e o M J P r o c N a dA c 日dS e iU S A 1 9 9 8 ，9 5 ( 2 0 ) ：1 1 9 8 1 1 1 9 8 6 【5 N i e l e s o nS ，N n g e l h u 目E A A m i t y M 咄a d d m M a t d S p e c i a l i z e dm e l l l b i n c ef o rw a t e rt r a n s p o r ti n #

25、 i B l 钟u B ! h i s h r 嘴d u t i 叩 i m m u n o g o l de y t o e h e m i a q , f o ra q u a p o r i n 一4i nm tb r a i n N e u r o o e i 1 9 9 7 1 7 ：1 7 1 1 8 0 6 L e e M D ，鼬I - g 岱，A g r ePT h e A q u a p o f i n f a m i l y o f w a t e rc h a n n e l p t a t e d m i nc l i n i c a lm e d i c i n e

26、 J M e d i c i n e ，1 9 9 7 ，7 6 ( 3 ) ：1 4 1 1 4 3 7 M a n l e ycT 。F u j i m u r aM ，M aT ，e l8 1A q u a p o d n - 4d e l e t i o ni n - r t t tr e d u c e sb r a i ne d e ma f t e ra c u ew a t e rn 蜘c “椰肌di s c h e m i e s t r o k e J N a t M e d ，2 0 0 0 ，6 ( 2 ) ：1 5 9 1 6 3 8 S o l e n o vE 1

27、 V e U i v e lL O s h i oK ds l O p t i e a lm e a s u r e m e n to f s w e l l i n ga n dw E t 盯t r a n s p o r ti ns p i n s lc o r ds l i e e ah n 舡! u a p o ri n n u l l r a l J N e u r o s c i e a c eM e t h o d s 2 0 0 2 ，1 1 3 ( 1 ) ：8 5 9 0 9 T a n i g u c h iM ，Y a m a s h i t eT K u m u r

28、aE ，e td I n d u c t i o no fa q u a - p o c l n - 4w a t e rc h a n n e lm R N A 正t W ef o c a lz e r e , b r a li s c h e m i ai nr a t J B r a i nR e * M o lB r a i nR e s 2 0 0 0 ，7 8 ( I 一2 ) ：1 3 1 1 3 7 ( 收稿日期：2 0 0 7 0 5 2 5 ) ( 上接第9 4 6 页) 资料观察证实维拉帕米治疗室上性心动过速的总有 效率达9 0 以上。另外，维拉帕米对冠状动脉有舒 张作用

29、，可增加冠脉流量，改善心肌供氧，降低心肌 耗氧量，但由于维拉帕米有一定的负性肌力作用和 降压作用，所以慎用于心功能不全及低血压患者。 我们根据上述药物特性和循证医学证据”J ，结 合患者的全身情况进行个体化治疗，注意以下几个 方面：( 1 ) 首先弄清室上性心律失常的病因，如甲 亢、感染、心肌缺血、心力衰竭、电解质紊乱、血容量 不足、药物影响等，注意病因治疗。( 2 ) 对无明显心 功能不全同时伴有血压偏高的室上性心律失常选用 维拉帕米治疗。( 3 ) 老年患者发生快速心律失常 时，易产生焦虑、烦躁不安，可适当给予镇静剂，利于 病情控制。( 4 ) 静脉应用维拉帕米要注意负荷量， 继之给予维持

30、量，预防心律失常复发。( 5 ) 老年人 往往伴有窦房结和房室结功能低下，首剂应用抗心 律失常的药物应缓慢推注，以防窦性停搏或房室性 传导阻滞发生。( 6 ) 对于反复发作的快速室上性心 律失常必要时行射频消融介入治疗。 参考文献 1 陈新谦，金有缘，汤光新编药物学 M 第1 5 版，北京：人 民卫生出腹社2 0 0 4 ：3 2 9 3 3 0 2 E u e b o S 舶K AD i a sV C ，C a r d e l l oF p ，ma 1 S a f e i 7a n d 插e u a yo f i n t r a v e n o u Bd i l t i a e mi na r e a lf i b r i l l a t i o na n da t r i a lA mJC a r d i a l ， 1 9 9 5 7 5 ：4 5 3 向小平，胡大一洪和秀，等静脉注射地尔硫卓对心功能的影 响 J 中华心血管病杂志，1 9 9 8 ，2 6 ( 2 ) ：1 2 3 ( 收稿日期：2 0 0 7 0 6 2 1 ) 万方数据