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1、宇国实用神经疾病杂志2009年2月第12卷第3期ChineseJ o u r n a lo fP r a c t i c a lN e r v o u sD i s e a s e sF e b 2 0 0 9 , V 0 1 1 2N o 3 3 5 大鼠脑出血后F a s 表达与神经细胞凋亡的关系及氟桂利嗪的 干预作用 李建设 白宏英王金兰 杨霄鹏 苏 建 郑州大学第二附属医院郑州4 5 0 0 1 4 【摘要】目的观察大鼠脑血肿周围脑组织F a s 的表达和神经细胞的凋亡，探讨氟桂利嗪能否下调血肿周围F a s 的表达 而减轻神经细胞凋亡方法采用自体股动脉血注入大鼠尾壳核建立脑出血模型，
2、分别于术后6 h 、1 2 h 、2 4 h 、2 d 、4 d5 个时间 点取脑组织，应用免疫组化方法检测血肿周围组织F a s 的表达情况，T U N E L 法检测血肿周围神经细胞凋亡结果脑出血 组大鼠脑血肿周围组织F a s 的表达及细胞凋亡明显高于其他组( P 0 0 5 ) ；与前一时间点F a s 的表达呈正相关( r = o 9 5 3 ，P O 0 5 ) ；与前一时同点F a s 的表达呈正相关( r - - - - - O 9 5 3 ，P 0 0 5 ) 3 讨论 凋亡，即程序性死亡，是在中枢神经系统涉及正 常发育、再生、增殖和病理变性的细胞死亡的主要方 式 3 。已有
3、多项研究证实F a s 介导的细胞凋亡通过 胞外非线粒体依赖途径和胞内线粒体依赖途径在缺 血性脑损伤起重要作用 4 。由于脑出血后血肿周围 同样存在缺血半暗带，则血肿周围半暗带内神经细 胞亦可能表达F a s 蛋白，且F a s 介导的细胞凋亡可 能参与与此处神经细胞的损伤。 F a s ( C D 9 5 或A P 1 ) 是一种I 型跨膜蛋白，分 子量为4 5 0 0 0 k D 。F a s 蛋白中至少包含3 个与诱导 细胞凋亡功能密切相关的结构域，分别为死亡信号激 活域( E X E ) 、死亡结构域( D D ) 和调控区( I 咏) 5 。F a s 通过几种与F a s 胞内D
4、D 相互作用的衔接蛋白转导 凋亡信号。脑缺血时，缺血缺氧脑组织神经细胞的 F a s 、F a s L 表达增加，F a s 结合F a s L 可导致F a s 多聚 化或构型改变。多聚化的F a s 的D D 通过D D - D D 结 构域间相互作用，招募C 端也含D D 的接头蛋白F a s 分子相关蛋白( F a sa s s o c i a t e dd e a t hd o r r n a i n ，F A D D ) 。 F A D D 的N 端含死亡效应结构域( D E D ) ，可通过 D E D - D E D 蛋白问相互作用而与C a s p a s e - 8 酶原结
5、合 从而形成F a s - F a s L F A D D - C a s p a s e - 8 死亡诱导的 信号复合体( D I S C ) 睁7 1 。凋亡酶体形成后，其中的 P r o c a s p a s e - 8 分子中的两个线性亚单位相互靠近， 可以进行自身水解而成为具有水解活性的蛋白酶 C a s p a s e - 8 ，然后可依次水解其下游的同源酶，如 P r o c a s p a s e 一3 、6 、7 等，而C a s p a s e - 3 是C a s p a s e 级 联反应中最关键的效应酶，可以激活D N A 降解酶， 降解D N A 为特异性片段导致
6、细胞凋亡的发生 8 。 一些C a s p a s e s 酶原也能聚集和自我活化。这种一 种C a s p a s e 活化其他C a s p a s e s 的级联反应放大了 凋亡信号，进而导致快速的细胞凋亡 9 。 本研究结果发现，大鼠脑血肿周围神经细胞6 h 即有F a s 表达，之后逐渐升高，2 4 h 达高峰，继而表 达下降，4 d 时仍有表达。各时点与假手术组比较均 有显著差异( P o 0 1 ) 。用T U N E L 法染色研究发 现大鼠脑血肿周围6 h 可见凋亡细胞，之后逐渐增 多，2 d 时达高峰。与前一时间点F a s 的表达具有相 关性( P 0 0 5 ) 。F
7、a s 高表达时间早于细胞凋亡的 出现，出现这种情况可能是因为细胞凋亡过程是促 凋亡基因和抑凋亡基因，以及细胞因子问相互作用 的复杂过程，需能量，要合成R N A 、蛋白质等，所以， 从凋亡的启动到出现典型的凋亡形态需数小时或数 天不等 10 1 。以上结果表明凋亡参与了大鼠脑血肿 周围脑组织损伤的病理生理过程，且其凋亡与F a s 的表达具有相关性，提示F a s 的表达是脑出血神经 细胞凋亡发生的参与因子之一。 氟桂利嗪治疗组各时点F a s 表达与凋亡指数均 低于出血组( P 0 0 1 ) ，提示氟桂利嗪能减少脑出 血血肿周围F a s 的表达，进而在一定程度上抑制凋 亡的发生。同时，
8、从另一角度证明F a s 参与了脑出 血凋亡的过程。其机制可能是C a 2 + 作为细胞内第 二信使，C a 2 + 内流在脑损伤后诱导F a s 和F a s L 基 因表达及神经细胞凋亡中起重要作用。氟桂利嗪被 认为是钙通道阻滞剂中唯一能通过血脑屏障的药 物。其药理作用主要是通过维持细胞内重要的离子 调控，阻止了细胞内C a 2 + 超载。其通过阻止钙离 子内流可在F a s 和F a s L 表达的高峰时相内降低促 凋亡基因F a s 和F a s L 的表达D ，继而抑制凋亡。 总之，脑血肿周围组织存在神经细胞的调亡， F a s 与调亡有关，氟桂利嗪具有抑制细胞凋亡的作 用。 参考文
9、献 1 X u eM e n g z h o u ，M a r eR ，D e lB i g i o I n t r a c e r e b r a li n j e c t i o no fa u t o l o g o u sw h o l eb l o o di nr a t s ，t i m ec o t l r s eo fi n f l a m m a t i o na n d d e a t h J N e u r o s c i e n c eL e t t e r s ，2 0 0 2 2 8 3t2 3 0 2 3 5 2 刘颖菊，薛春生，周歧新脑缺血再灌流后F a s 及
10、F a s L 在脑 内表达的变化和氟桂利嗪的抑制作用 J 药学学报，2 0 0 0 ，3 5 ( 1 1 ) ：8 1 0 8 1 3 3 3 O r r e n i u ssM i t o c h o n d n a lr e g u l a t i o no fa p o p t o t i cc “d e a t h 刀 T o x i c o lL d t 。2 0 0 4 ，1 4 9 ( 1 3 ) ：1 9 2 3 4 3 B i aF a n g f a n g ，X i a oB o ，H uY u e q i a n g ，e ta LE x p r e s s i o
11、na n d l o c a l i z a t i o no fF a s a s s o c i a t e dp r o t e i n sf o l l o w i n gf o c a lc e r e b r a l 万方数据 3 8 中国实用神经疾病杂志2 0 0 9 年2 月第1 2 卷第3 期C h i n e s eJ o u r n a lo fP r a c t i c a lN e r v o u sD i s e a s e sF e b 2 0 0 9 ，V 0 1 1 2N o 3 i s c h e m i ai nr a t s J B r a i nR e
12、 s e a r c h ，2 0 0 8 ，1 1 9 1 3 0 3 8 外培养大鼠皮质神经无变化及意义 刀中国实用神经疾病杂 5 B a k e rs J R e d d yE P M o d u l a t i o no f l i f ea n dd e a t hb y t h e T N F志，2 0 0 7 ，1 0 ( 3 ) ：8 4 8 6 r e c e p t o rs u p e r a n f i l y J O n c o g e n e 。1 9 9 8 ，1 7 ：3 2 6 1 3 2 7 0 9 S u s a nE l m o r eA p o p t
13、 o s i s ：Ar e v i e wo fp r o g r a m m e dc e l ld e a t h 6 P e t e rM E K r a m m e rP H T h eC D 9 5 ( A P O - 1 F a s ) D I s ca n d J T o x i c o lP a t h o ! ，2 0 0 7 ，3 5 ( 4 ) ：4 9 5 5 1 6 b e y o n d J C e l lD e a t hD i f f e r ，2 0 0 3 。1 0 ：2 6 3 5 1 0 W a t a n a b l eF ，B r a n n a
14、nR ，C o p d a n d ，e ta LL y m p h o p r o l i I er a - 7 李国荣，朱婉儿F a s F a s L 系统和中枢神经系统疾病 J 中t i o nd i s o r d e ri nm i c ee x p l a i n e db yd e f e c ti nf a sa n t i g e nt h a t 国实用神经疾病杂志，2 0 0 7 t 1 0 ( 8 ) 1 1 3 3 1 3 7 m e d i a t ea p o p t o s i s F J N a t u r e 。1 9 9 2 3 5 6 3 1 4 I
15、s 樊哲铭，索爱琴，许予明等糖剥夺预处理后C a s p a s e - 3 在体( 收稿8 0 0 8 一1 1 2 0 ) 血管紧张素转换酶2 基因多态性与高血压合并糖尿病的关系 司大妞 李莉崔天祥 郑州大学第二附属医院心血管内科郑州4 5 0 0 1 4 【摘要】目的探讨血管紧张素转换酶2 ( a n g i o t e n s i nc o n v e r t i n ge n z y m e2 ，A C E 2 ) 基因单核苷酸多态性( s i n g l en u e l e o - t i d ep o l y m o r p h i s m s ，S N P ) 与高血压合并2
16、 型糖尿病( E H 并合T 2 D M ) 的关系方法采用横断面病例对照研究，应用聚合酶 连反应一限制性片段长度多态性检测高血压、2 型糖尿病、高血压合并糖尿病及正常对照者之间的A C E 2 基因G 8 7 9 0 A 多态性。 结果基因型分析显示高血压、2 型糖尿病及正常对照组之问G 与A 的分布差异无统计学意义f 高血压合并糖尿病组与高血 压组、糖尿病组及正常组比较，A 基因频率明显升高，G 基因频率明显下降( P o 0 5 ) 结论A C E 2 基因G 8 7 9 0 A 多态性位 点与高血压的发生无关，与高血压合并糖尿病的发生有一定关系，尤其在男性患者更显著。 【关键词】血管紧
17、张素转换酶2 ；高血压；糖尿病；单核苷酸多态性 【中图分类号】R 5 8 7 1 ；R 5 4 4 1【文献标识码】A【文章编号11 6 7 3 5 1 l O ( 2 0 0 9 ) 0 3 一0 0 3 8 一0 3 人类血管紧张素转换酶( A C E ) 基因多态性与 高血压和糖尿病的发生相关。由于A C E 同源的羧 肽酶A C E 2 的发现，使人们对肾素一血管紧张素系统 ( R A S ) 有了新的认识。人类A C E 2 定位于染色体 X p 2 2 ，含有多个多态性位点，包含1 8 个外显子，主 要分布于心脏、肾脏和睾丸。A C E 2 通过水解血管 紧张素I ( A n g
18、- I ) 和血管紧张素l I ( A n g 一1 I ) 产生 A n g 一( 1 7 ) 和A n g 一( 1 9 ) ，拮抗由A n g 介导的缩血 管作用，并抑制血管平滑肌增殖等 。刘同宝等乜3 对G 8 7 9 0 A 多态性位点的研究中发现，在高血压伴 心功能不全的患者中该位点的A 基因频率明显增 高，与对照组比较差异有统计学意义( P o 0 5 ) 。 关于人群中A C E 2 基因G 8 7 9 0 A 多态性与高血压合 并糖尿病的关系尚未见报道。本研究旨在探讨 A C E 2 基因G 8 7 9 0 A 多态性与高血压合并糖尿病之 间的关系。 1 对象与方法 1 1
19、研究对象 原发性高血压患者6 0 例，男3 8 例，女2 2 例，年龄4 5 6 9 岁，平均( 5 4 5 士1 2 1 ) 岁， 诊断均符合1 9 9 9 年W H O 关于高血压的诊断标准。 糖尿病患者6 6 例，男4 1 例，女2 5 例，年龄4 3 6 9 岁，平均( 5 4 5 1 1 O ) 岁，糖尿病病史5 “ - 1 6 年，诊 断均符合1 9 9 9 年W H O 关于2 型糖尿病的诊断标 准。高血压合并糖尿病患者6 0 例，男3 5 例，女2 5 例，平均( 5 3 6 士1 2 o ) 岁。同时检测患者的身高、体 质量、糖化血红蛋白、总胆固醇( T C ) 、血尿素氮
20、( B U N ) 、血肌酐( C r ) 及尿微量白蛋白等指标。对照 组6 0 例，男3 7 例，女2 3 例，为我院体检中心体检 者。年龄4 3 6 8 岁，平均( 5 3 5 士1 2 O ) 岁。对照组 无高血压史，血压正常，血糖正常。筛选标准：汉族， 排除继发性高血压，严重肝肾功能障碍等。 1 2 实验方法 1 2 1 外周血细胞D N A 提取：取空腹外周静脉血 2 3 m l ，肝素抗凝，使用血液基因组D N A 提取( 购 自A x y G E N 公司) 进行全血基因组D N A 提取， - - 2 0 保存备用。 1 2 2 基因多态性测定：采用聚合酶链反应一限制 性片段长
21、度多态性( P C R R F L P ) 。由p r i m e r 3 软 件进行引物设计：正向引物5 一T T C T c C C T G C T C C T A T A C C G 3 ；反向引物5 一T T C A T T C A T G T C C T T G C C C T T A - 3 ( 上海生工生物工程公司) 。 P C R ( 反应体系购自大连宝生公司) 反应条件：9 4 预变性4 m i n ；以下总共3 5 个循环：9 4 变性5 0 s ， 5 8 退火5 0 s ，7 2 延伸5 0 s ；终末延伸7 2 1 0 m i n 。 P C R 产物经溴化乙钉染色的1 的琼脂糖凝胶电 泳，于凝胶成像系统进行成像鉴定。P C R 产物中 万方数据